肝脏免疫阻滞仪调节慢性HBV感染中CD8 T细胞免疫

　　六周大的C57BL6/J雄性小鼠是从Janvier或Charles River购买的。H-2KBSIINFEKL限制的OT-1 TCR转基因CD45.1+小鼠和H-2KBMGLKLKFRQL限制的COR93 TCR TCR-转基因CD45.1+小鼠购自Charles River，并在特定病原体的病原体条件下在医学的动物核心机构下，在特定的病原体条件下繁殖。将小鼠带有12小时的光/12小时黑暗周期。温度设置为22±2°C，湿度为55±10％，每天检查。实施了实验动物科学协会联合会的准则，用于育种和实验。实验已获得上巴伐利亚州地区政府的批准（ROB-55.2-2532.VET_02-14-185，ROB-55.2-2532.VET_02-16-55和ROB-55.2-2532.VET_02-18-100）。 　　总共1×102幼稚（CD44-CD62L+）H-2KBSIINFEKL限制的CD45.1+CD8 T细胞或1×104 NAIVE（CD44-CD62L+）H-2KBMGLKLKLKLKLKFRQL限制性CD8 T与TCR-TCR-TRANSEN cD8 t分隔于TCR-TCR-TRANSEN cd8 tcr-1+CD8与纯度超过95％的脾脏分离免疫磁分离。在感染重组腺病毒前1天，将天真的T细胞直接在PBS中静脉注射。 　　如先前所述，产生了肝脏重组腺病毒19,26。在最小的CMV启动子（导致肝细胞的急性解析感染）下，产生了表达盒式GOL的两个相同的重组腺病毒，即GFP，卵脂蛋白和荧光素酶的基因，或者在急性分辨出肝细胞的急性溶解感染下，或者在肝细胞特异性促进剂（Trepterty Trestents）（Ttrepertent）（Ttrepertent）（Ttreprients）（Ttrepertient）（Ttrepertient）（Ttrepertient）（Ttrepertient）（Ttrepertient）（Ttrepertient）（Ttrepertient）（描述19。如先前报道的57，使用HBV基因组（基因型D）的1.3重叠构建体生成具有复制能力HBV的肝细胞转导的重组腺病毒。重组腺病毒在HEK 293细胞中扩增，并通过体外感染测定法确定传染性滴度。使用前，将高尊腺病毒量等分并保存在-80°C之前。为了在体内转导肝细胞，将重组腺病毒溶解在盐水中，并在解冻后立即溶解在盐水中，并通过尾静脉静脉注射。 　　用体内成像系统IVIS Lumina LT系列III（PerkineLmer）对编码GOL表达盒的重组腺病毒转导后荧光素酶表达的体内生物发光。使用2.5％的异氟烷​​麻醉小鼠，并接受100 mg kg-1的体重-luciferin-k-salt（PJK）作为荧光素酶的底物。在该区域检测到的小鼠的右上象限中定义了目标区域。在每个实验都确保结果可比性之前，进行IVIS Lumina LT III的系统校准。 　　使用Replotron Plus系统（Roche Diagnostics）从小鼠的外周血中测量血清丙氨酸转氨酶。 　　使用建筑师平台和HBEAG试剂盒（6C32-27）在外周血中确定HBEAG滴度，并使用HBEAG定量校准器（7p24-01，Abbott Laboratories）确定。 　　如先前所述，进行了肝组织切片的组织学和免疫组织化学。简而言之，将组织固定在4％的福尔马林和石蜡中。对于血久毒素/曙红染色或免疫组织化学，进行了2 µM切片。根据标准方案进行血久毒素/曙红染色。将组织切片用抗HBC和抗GFP染色（1.5 µg Ml-1多克隆抗HBCAG（ORIGENE）；多克隆抗GFP（Fitzgerald）的0.4 ng µl-1，具有Leica Biosystems Max（Leica）键（Leica），并与DAB（Dabo）一起使用dako（dako），并与dako bydation dako一起使用。用Aperio系统扫描载玻片，并使用Aperio Image Scope V.12.4.0软件（Leica）和Qupath V.0.2.3（参考文献58）进行分析。 　　脾脏通过100 µM细胞过滤器，将红细胞用氯化铵 - 洛杉矶裂解液缓冲液裂解2分钟，并使用脾细胞进行进一步的实验。 　　切除之前，肝脏通过门静脉灌注PBS。肝组织通过100 µM网状细胞过滤器，并在GBSS（PAN Biotech）中用125 µg mL -1型胶原酶II型（沃辛顿）在37°C中消化10分钟。为了富集与肝相关的淋巴细胞，以40％/80％Percoll（GE Healthcare）的密度梯度离心，在1,440G下进行20分钟。 　　通过门静脉，用0.12 U mL -1的胶原酶（Serva）灌注胶原酶（Serva）8分钟。然后去除肝脏，机械破坏并通过300 µm细胞滤网。通过100 µm的网格过滤肝细胞悬浮液，并在50g下颗粒2分钟。肝细胞通过密度梯度离心纯化，在600g时为50％/80％Percoll（GE Healthcare）20分钟。对于细胞毒性测定，将每孔的10,000个肝细胞播种在96孔电子板（ACEA Biosciences）上，涂有0.02％胶原蛋白（Serva）。在补充威廉的E培养基（PAN Biotech，200 mM谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific），1 M HEPES pH 7.4，104 U ml -1的Penicillin/streptomycin，50 mg mL -1的源自源性nmmycin（0.005 N mL -1％）的胰岛素（Insuman速度），SANFII（Insuman）迅速，SANOFI（1.6％），在补充了William's E培养基中获得了细胞附着。FBS（PAN Biotech）在含有1％FBS的William's培养基中培养。 　　门静脉灌注后用胶原酶在Gey平衡的盐溶液中从小鼠肝脏中分离出非核肝细胞，然后在37°C的旋转水浴中用胶原酶在37°C的旋转水浴中进行体外消化，并密度梯度离心。然后，使用抗CD146涂层的微珠（Miltenyi）通过免疫磁分离获得LSEC，如前所述59,60,61，纯度达到95％或更高。为了研究分子从LSEC到T细胞的转移，用10 µM CFSE（Invitrogen）标记LSEC。用50 µg mL -1的IFNγ（Miltenyi）激活LSEC，以在共培养实验之前增加粘附。为了分析cAMP信号，在共培养前用1 µM塞来昔布（Cayman Chemical）处理LSEC。 　　从肝脏或脾脏中分离CD8 T细胞，并在补充10％FCS的RPMI 1640培养基（Gibco）中培养，1％ - 谷氨酰胺（200 mM），1％青霉素/链霉素/链霉素（5,000 U ML -1），50 µm 2- coccaptoeto乙醇。为了进行体内刺激和细胞内细胞因子染色，将细胞用10 nm重组的siinfekl肽（肽和象），HBCore肽MGLKFRQL（肽和大象）或1×Ebioscience细胞刺激Cocktail（Thermo fishericific）与3 µG -GML -GML -1（afterigience fistrigation）刺激。为了分析cAMP信号，将T细胞与腺苷酸环化酶激动剂FSK（25 µm，Sigma-Aldrich），PKA激动剂SP-8BR训练营（250 µm，Cayman，Cayman Chemical）孵育1小时CGS21680（100 nm，Tocris）在DMSO（Sigma-Aldrich）中求解。 　　将CD8 T细胞与原代小鼠LSEC或树突状细胞以1：1的比率共培养，然后与抗原呈递细胞分离，并直接用Cognate肽直接分析或恢复18小时。To analyse cAMP signalling in cocultures, T cells were pretreated with the EPAC inhibitor ESI-09 (10 µM, Tocris), PKA antagonist Rp-8-bromo-cAMPS (1 mM, Cayman Chemical), adenylyl cyclase antagonist MDL-12330A (100 µM, Tocris), A2AR antagonist SCH58261 (100 nM,Tocris）和PTPN22抑制剂PTPN22-IN-1（1.4 µM，Medchemexpress）。 　　在德国弗雷堡大学医院II招募了病毒肝炎的参与者的血液样本，并在胃肠病学，肝病学和内分泌学系招募。外周血和肝脏细针吸气是从伊拉斯mc MC大学医学中心（荷兰鹿特丹），多伦多综合医院（加拿大多伦多）和马萨诸塞州马萨诸塞州（美国波士顿）（美国波士顿）的慢性丙型肝炎的参与者那里收集的。所有参与者均提供了书面知情同意。这项研究得到了所有三个地点的机构审查委员会的批准，并根据赫尔辛基和伊斯坦布尔的声明进行。根据欧洲2017年肝脏指南研究协会的慢性或分辨HBV感染的不同临床阶段，该协会认为HBEAG存在HBEAG，HBV DNA浓度，跨激酶浓度（丙氨酸跨激酶和天冬氨酸透氨基酶酶）和存在或不存在LIVERAMPAMPAMENAINS62。HBEAG，血清HBV DNA和天冬氨酸转氨酶/丙氨酸转氨酸酶的值是德国弗莱堡大学医院临床诊断的一部分。HLA-A*02：01的确认是通过使用市售引物（GENDX）在Miseq系统上的下一代测序进行HLA型进行的。在献血之前，已获得所有参与者的书面知情同意。这项研究是根据联邦准则，德国弗莱堡的阿尔伯特·卢德维格斯 - 纳弗里蒂特的地方道德委员会法规（第474/14号）和赫尔辛基宣言（1975）进行的。 　　在EDTA涂层管中收集静脉血液样本。使用淋巴细胞分离培养基（PAN Biotech）通过密度梯度离心分离外周血单核细胞。将分离的外周血单核细胞重悬于RPMI 1640培养基中，这些培养基补充了10％FCS，1％青霉素/链霉素和1.5％1 M HEPES缓冲液（Thermo Fisher），并储存在-80°C下，直到使用。将冷冻的外周血单核细胞在完整的培养基中解冻（RPMI 1640补充了10％FCS，1％青霉素/链霉素和1.5％1 M HEPES缓冲液（Thermofisher），其中含有50 U ML -1的苯甲酶（Sigma）。 　　将总共​​1×107至2×107的外周血单核细胞与PE偶联肽的HLA I类多聚体一起孵育30分钟。然后根据制造商的说明，使用磁激活的细胞分选技术（Miltenyi）用抗PE珠进行富集。随后使用富集的特异性CD8 T细胞进行转录组分析。 　　在4°C下进行流式细胞仪的细胞染色30分钟。The following antibodies (clones, dilution, catalogue number) were used for staining of mouse cells: anti-CD8 (53-6.7, 1:250, 100752), anti-CD45.1 (A20, 1:200,110722, 110704 and 110748), anti-CXCR6 (SA051D1, 1:200, 151117, 151104, 151108,151109和151115），抗CX3CR1（SA011F11、1：200,149016、149004和149006），抗CD44（IM7、1：200、103036），抗CD69，抗CD69（H1.2F3、1：1：1：1：100、104503），Anti-tim-3（B8.2c1）抗tigit（1G9，1：200，142111），抗IFNγ（XMG1.2，1：200，505808），抗CD19（1D3，1：200，152404），抗CD335（抗CD335933104），CD39（Duha59，1：200，143805），抗CD45.2（104，1：200，109805），抗CD3（17a2，1：200，100217），抗NK1.1anti-CD49a (HMa1, 1:200, 142606), all Biolegend, and anti-CD69 (H1.2F3, 1:100, 63-069-82), anti-PD-1 (J43, 1:200, 46-9985-82), anti-LAG-3 (eBioC9B7W, 1:200, 406-2239-42 and12-2231-82），抗TIM-3（B8.2C12，1：200，200，12-2231-82）抗TOX（TXRX10，1：1：100，100，12-6502-82），抗Granzyme B（GB11，1：200，GRB04和GRB04和GRB04和GRB04和GRB05），Anti-Tnf（1：1.200）25-7321-82），抗4-1BB（17b5，1：100，48-1371-82），抗CD25（PC61.5，1：200，48-0251-82），抗AKT PS473（SDRNR，1：100，100，25-9715-42），1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：3，/11。48-0731-82）（全部Thermo Fisher Scientific）和反帝国（47/pka; BD Biosciences，1：5,560205）。MHC I类H-2KBSIINFEKL限制性或H-2KBMGLKFRQL限制性链球菌63由D. Busch（微生物学研究所，TUM）提供。为了标记抗原特异性CD8 T细胞，将每样品中的0.4 µg肽加载的链蛋白酶与0.4 µL的链球菌 - tactin-PE/APC（IBA Lifesciences）在PBS中在冰上孵育30分钟，然后再孵育细胞悬浮液。为了排除死细胞，染色面板中包括可固定的活力染料Efluor780（Invitrogen）。对于细胞因子的细胞内染色，细胞内固定缓冲液（Invitrogen） 根据制造商的说明使用。根据制造商的说明，将GZMB和TOX的染色与FOXP3/转录因子染色缓冲套件（Thermo Fisher Scientific）结合使用。为了染色PPKA，将细胞固定在IC固定缓冲液（Invitrogen）中30分钟，然后用冰冷的甲醇透化30分钟，然后染色。 　　对于人体细胞的染色，使用了以下抗体（克隆，稀释，目录数，批号）：抗CD14（61D3，1：1：100，A15453，2406638，），抗CD19（HIB19，1：1：100，100，17-0199-42，2472560）1：200，304178，2327528），抗CCR7（G043H7，1：20，353244，B347205）（所有Biolegend），抗CD8（RPA-T8，1：200，563795，563795，9346411）和GBZMB（GBZMB（GBZMB）（所有BD生物科学）。可固定的生存能力染料Efluor 780（65-086-14，EBIOSCIENCE）用于活/死歧视。HLA I类表位特异性四聚体是通过肽/HLA I：链霉亲和素摩尔比为5：1的生物素化肽/HLA I类单体与PE-偶联链霉亲和蛋白链球菌（Prozyme）的结合而产生的。值得注意的是，先前对HBCore特异性CD8 T细胞的靶向表位进行了病毒序列突变的分析。排除了靶向表位中具有病毒序列突变的患者的T细胞反应。HLA-A*02：01/，FLPSDFFPSV肽与标准FMOC化学合成，纯度超过70％（Genaxxon）。 　　在Sony SP6800光谱分析仪（Sony Biotechnology）或Cytoflex S（Beckman Coulter）上获取了多色流式细胞仪数据。用Sony SH800（Sony Biotechnology）或Moflo Altrios EQ（Beckman Coulter）对细胞进行分类。使用FlowJo软件V.10.7.1和V.10.8.0（BD Biosciences），GraphPad Prism v.10.0.3（GraphPad Software），R V.4.0.2和R Cytofkit GUI V.0.99分析流式细胞仪数据。 　　用基于XCelligence的细胞阻抗测量进行了体内细胞毒性测定。原代鼠肝细胞用作靶细胞，并在胶原胶涂层的96孔电子板上播种。分离后24小时，将分类的CD8 T细胞添加到肽脉冲或模拟治疗的原代小鼠肝细胞中，并用Xcelligence RTCA MP仪器（ACEA Biosciences）记录为细胞指数，作为细胞指数，作为抗原特异性CD8 T细胞细胞毒性的量度。 　　通过门静脉将肝脏用2.5 mL的抗原溶液（Diupath）灌注，切除并固定4小时，以1 mL的抗原固定。固定的肝叶嵌入到组织软件的O.C.T.中。（Sakura Finetek）并在-80°C下冷冻，用冷冻组（Leica）切割50 µm冷冻切片。将肝切片透化并用含有1％BSA，0.3％Triton X-100（Gebru Biotechnik），1％正常小鼠血清（Sigma）的0.1 M TRI（Applichem）阻塞2小时或更多。用抗CD3（克隆17A2、100240、1：200，Biolegend），抗CD45.1（克隆A20、110732、1：200，biolegend），抗CD146（抗CD146），抗CD45.1（克隆A20、110732、100），抗CD3（Clone A20、110732、100），将部分染色。(21833, 1:100, Thermo Fisher Scientific) or anti-CD3 (clone 17A2, 100240, 1:200, Biolegend), anti-CD45.1 (clone A20, 110732, 1:200, Biolegend), anti-I-A/I-E (MHC class II) (clone M5/114.15.2, 107622, 1:200, Biolegend) and抗CD103（山羊多克隆，AF1990，1：200，研发系统），其次是抗山羊IgG（驴多克隆，705-625-147，1：500，Jackson Immunoresearch）。将组织切片与Mowiol一起安装，并使用倒置的TCS SP8共聚焦显微镜（Leica）成像。用Imaris 9.6软件（BITPLANE）分析图像。 　　人肝样品（福尔马林固定，石蜡嵌入，n = 21；伦理批准：518/19 s）由rnascope（CXCR6）和CD3（MRQ39，1：1,500）进行双重染色。简而言之，在减去分解和标准预处理后，将载玻片与RNA探针进行CXCR6（468468，ACD，ACD，Bio-Techne）孵育，并用RNASCOPE 2.5 Leica Assay-Brown-Brown-Brown-Brown-Brown（Leica Biosystems）检测到，然后用CD3键入CD3（103R-95 RARQU），然后使用抗体孵育，然后将其孵育。债券RXM系统（Leica Biosystems）上的套件（Leica Biosystems）。所有载玻片均用血久毒素染色，使用AT2扫描仪（Leica Biosystems）覆盖和数字化。这项研究是根据德国慕尼黑技术大学地方道德委员会法规的联邦准则进行的（第518/19号S-SR） 　　将肝相关的淋巴细胞和来自具有分辨AD – CMV-GOL感染的小鼠的脾细胞分类为CD45.1+CXCR6+CXCR6+CX3CR1- CD8和CD45.1+CXCR6-CXCX3CR1+CD8 T细胞。将源自具有持久AD -TTR – GOL感染的小鼠衍生的CD8 T细胞分类为CXCR6+CX3CR1 -CD45.1+CD8和CXCR6+CXCR6+CX3CR1+CD45.1+CD8种群。每个样品总共收集了5,000个细胞，在补充了1％（v/v）2-甲醇的1×TCL裂解缓冲液（QIAGEN）中，并立即在干冰上冷冻。 　　如先前所述，进行了poly（a）-RNA的批量3'-序列的库构建。64。简而言之，每个样品用最大值RT聚合酶（Thermo Fisher）和条形码互补DNA生产。唯一的分子标识符（UMIS）和模板开关寡核（TSO）用于拉长cDNA的适配器5'末端。所有样品均融合在一起，并用底漆扩增全长cDNA。将cDNA与Nextera XT Kit（Illumina）和3'-End-Fragments相辅相成，并补充了P5和P7 Illumina悬垂。使用NextSeq 500（Illumina）对库进行测序。使用drop-seq管道（https://github.com/broadinstitute/drop-seq）将UMI桌子用于样品和基因。我们使用GRCM38参考基因组ENMBL注释版本75进行注释。我们使用DESEQ2 R软件包v.2.1.28.1（参考文献65）提取DEGS（log2 fold-fold-change 1 and padj≤0.05）。使用GGPLOT2 R软件包v.3.3.2将DEG视为火山图。使用PRCOMP R函数（在STATS R软件包v.3.6.1中）执行主成分分析，并使用GGPLOT 2和GGREPEL R V.0.9.4软件包拍摄。参见图。1和4和扩展数据图2。 　　将P14细胞通过过多地转移到C57BL/6小鼠中，并在一天后用LCMV克隆13或LCMV Armstrong感染。在27 d.p.i中对居民（CD69+CD101+CXCR6+CX3CR1-）和效应子/效应子 - 内存（CX3CR1+）P14细胞进行排序，以27 D.P.I.使用RNADVANCE Cell V.2试剂盒（Beckmann-Coulter）分离总RNA。用生物分析仪RNA PICO芯片（Agilent）分析了分离的RNA的质量和数量。按照制造商的协议，使用Smart-Seq V.4超低输入RNA试剂盒（Takara）进行cDNA合成，并使用12个PCR扩增周期进行。输入量为每个RNA样品的1 ng。用生物分析仪DNA HS芯片（Agilent）测量cDNA，并使用Nextera XP DNA文库制备试剂盒（Illumina）使用300 pg扩增的cDNA进行库制备。用生物分析仪DNA HS芯片（Agilent）分析库，并按照Illumina的指南和使用KAPA SYBR Master Mix（KAPA Biosystems）对定量PCR进行定量。在所有库归一化为2 nm之后，使用HISEQ Rapid v.2 Chemistry（Illumina）在Hiseq2500（Illumina）上在两个单端运行（1×100碱基对，双索引）上进行了13个样本。参见扩展数据图2。 　　Liver-associated lymphocytes and splenocytes from mice with Ad–HBV infection were pregated on (CD19/Ly6G/TER119/CD335)− CD8 T cells and sorted into liver CXCR6+CD45.1+, liver CD45.1+CX3CR1+ CD8 T cells, spleen CD45.1+CX3CR1+ CD8 T cells and liverCD45.1- CD8 T细胞来自已分辨感染，肝脏CD45.1+CXCR6+和肝CD45.1+CXCR6+CX3CR1+CD8 T细胞和肝CD45.1- CD8 T细胞来自持续感染。将总100个CD8 T细胞直接分为96孔板，该板由1倍反应缓冲液制备，该反应缓冲液由裂解缓冲液和RNase抑制剂组成，用于低输入RNA-SEQ（Takara）。盘子向下旋转，立即将其存储在干冰上或-80°C下，直到进一步加工。根据制造商的指示，使用NEXTERA XT DNA培养基制剂（Illumina），使用Smart-Seq V.4超低输入RNA试剂盒（Takara）对含有裂解的T细胞进行样品板进行cDNA文库制备，然后使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒（Illumina）进行测序。简而言之，如前所述的66，通过逆转录，模板切换反应和PCR预扩增产生了全长cDNA。使用Qubit DSDNA高灵敏度试剂盒对cDNA文库进行了定量，并使用DNA高敏感芯片（Agilent）在生物分解器上评估了质量。双链cDNA在两个片段末端都经过片段化和基于PCR的Imlumina barcoded测序适配器的添加。如上所述评估了测序文库数量和质量。在每个样品的目标读取深度为25 m的novaseq 6000仪器（Illumina）上，对50×循环配对的测序进行。参见图2和扩展数据图3。 　　通过基于磁珠的排序富含HBVCore18特异性CD8 T细胞，并进行表面染色。总共将1,152个活的CD8 T细胞分选在384孔板（Bio-Rad）中，其中包含裂解缓冲液和矿物油，使用FACS Melody Cell Sorter以单细胞分类模式进行。幼稚的CD45RA+ CCR7+ T细胞被排除在外。分类后，将板在4°C下在2,200g下离心1分钟，在液氮中捕获冻干，并在-80°C下储存直至处理。使用McEl-Seq2方案进行SCRNA-SEQ，这是在蚊子纳米级液体液体处理机器人（TTP LabTech）67,68上的cel-Seq2的自动化和微型化版本。22个具有96个单元格的库在Illumina HISEQ 3000测序系统（配对多重运行）的深度约为130,000–200,000读的深度上。测序是在Max Planck免疫生物学和表观遗传学研究所（德国弗雷堡）的测序设施中进行的。参见图3和扩展数据图4。 　　我们分析了23个冷冻保存细针肝抽吸的HBV特异性CD8 T细胞（3例HBV肝炎患者，8例HBE-HBV感染患者和10例HBV功能治愈患者）。用谱系标记抗体和HBV多聚体融化并用两个不同的HBV特异性染色。将实时HBV特异性CD8 T细胞中的96孔臂木板（Thermo Fisher Scientific）分选，其中含有RNA裂解缓冲液，使用BD SORP FACS ARIA在索引单细胞分配模式下进行。分类后，将板离心，并在干冰上快速冻结。SCRNA-SEQ使用Smart-Seq2协议和Illumina NextSeq500在Broad Institute Walk-Up测序设施（美国马萨诸塞州剑桥）进行。在质量控制之后，可以使用r v.4.1.2与Seurat软件包v.4.3.0分析来自21个肝样品的977个HBV特异性细胞。使用Seurat v.4.3.0分别通过将每个单元格中的特征计数除以单元的总计数，将原始计数分别归一化和缩放，并分别将天然对象转换应用于每个基因的log1p和缩放表达水平。随后，每个样品中的HBV特异性细胞是根据是否表现出CXCR6表达的。根据CXCR6状态将CREM特征的每个基因的每个结果组平均基因表达水平，然后在热图中可视化。从伊拉斯mc MC大学医学中心（荷兰鹿特丹），多伦多综合医院（加拿大多伦多）和马萨诸塞州综合医院（美国波士顿）的慢性丙型肝炎的参与者和肝脏细针弹收集。所有参与者均提供了书面知情同意。这项研究得到了所有三个地点的机构审查委员会的批准，并根据赫尔辛基和伊斯坦布尔的声明进行。见图3E。 　　我们在肠道，皮肤和肺组织居住记忆T细胞数据数据集69上进行了GSEA，如下所示：首先，我们下载了来自GEO数据库的原始微阵列数据（登录ID：GSE47045：GSE47045，组织 - 居民记忆T细胞T细胞：肠，肺和皮肤效应的degs（spleed）（spleed）（splee）（spleen）（spleen），并提取量表（spleen）。（参考70）。我们使用GSEA V.4.0.3使用DEG进行富集分析，DEG是根据DESEQ2 v.2.1.28.1订购的DEG进行订购的。我们还使用GSEA分数进行了核心签名分析，如下所示。最初，我们提取了从组织居住的特征中促进核心富集的基因。与Hobit和Blimp相关的基因集是从Ref获得的。71（GEO登录ID：GSE70813）和RAW数据集使用GREIN DB V.1（参考文献72）处理。使用DESEQ2 v.2.1.28.1 r软件包65确定DEG。与TCR信号相关的基因集是从MSIGDB Biocarta数据集获得的（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）。我们从分子基因组信息学数据库（http://www.informatics.jax.org/go/go/term/go/term/go:0019722）中检索了钙信号通路基因。来自Hobit缺陷型，缺乏型缺陷细胞的基因集与肝CXCR6+ CD8 T细胞的DEG相匹配，而不是脾CX3CR1+ CD8 T细胞。取决于CREM的基因集是从Ref获得的。73。为了创建用于营地信号传导的基因集，所有编码腺苷酸酯酶，磷酸二酯酶，PKA调节和催化亚基的基因符号，Ezrin，EPCA1，EPAC2和小型GTPase的激酶锚定蛋白锚定蛋白锚定蛋白质是从人类的基因基因基因基因数据库Genecase下载的。GSEA V.4.0.3（参考文献74）的预先工具用于评估归一化富集评分，而FDR（Q <0.25）用于衡量归一化富集评分的统计显着性。参见图。1-4和扩展数据图2。2和4。 　　我们使用AD – CMV – GOL与AD – TTR – GOL感染期间的CXCR6+ CD8 T细胞的DEG CXCR6+ CD8 T细胞进行了转录因子网络分析。使用转录因子检查点数据库提取转录组中调节的转录因子75。通过此分析，我们从转录组数据集开采了7个和两个转录因子。我们评估了转录因子 - 转录因子网络：（1）从真核启动子数据库和UCSC（GRCM38/MM10）下载了显着调节DEG的启动子序列（-1千倍酶（Kb））https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgtrackui?db=mm10&c=chrx＆g = encode3renenhancerepdnewpromoter and Ref。76;（2）我们从Jaspar Core和Hocomoco数据库中提取了转录因子结合位点77,78；（3）最后，使用自定义Python v.3.12脚本（https://zenodo.org/records/11040043）使用自定义Python v.3.12扫描启动子序列（-1 kb启动子）和结合位点的转录因子。在Cytoscape v.3.7.1（参考文献79）中生成转录因子网络。为了评估转录因子网络的层次结构，使用IGRAPH R软件包v.2.0.2（https://igraph.org/）和HierArchy Height（H）计算了每个转录因子及其目标的计算。按照以前的解释进行计算80。层次结构高度得分定义了三个和两个转录因子 - 转录因子网络。见图1。 　　通过BCL2FASTQ软件v.2.2.20.0.422进行反复插图。如https://gitlab.lrz.de/immunophysio/bulkseqpipe中所述，使用snakemake Pipelines81处理读取。使用Trimmomatic V.0.36（参考文献82）对读取进行过滤。Star v.2.5.3a（参考文献83）用于映射到注释释放编号。91和基因组构建号。38来自Mus Musculus（Ensembl grcm38）。丢弃了多模拟的读物。使用HTSEQ V.0.9.1（参考文献84）和DESEQ2 V.1.24.0（参考文献65）进行读取计数。丢弃了显示总数少于10的基因。当绝对log2折叠大于1，而pADJ <0.05时，差异被认为是显着的。参见扩展数据图2。 　　为了进行数据预处理，将FASTQ文件映射到人类基因组（V.GRCH38），使用SCPIPE R Package Workflow v.1.12.0，R V.3.5.0进行注释，消除和计数。将少于150 UMI计数的细胞过滤掉。使用Louvain方法聚类，使用Seurat v.3.2.0进行UMAP投影和DEA。我们使用seurat v.3.2.0的AddModulesCore函数对细胞进行了评分。85。我们删除了少于十个基因的特征，另外还有簇11-13，这对应于Galletti研究85中的边缘簇。使用Pyscenic Pipeline计算转录因子活性水平（V.0.10.10）。我们在基因TSS周围选择了10 kb进行基序搜索。为了在循环人类HBCore特异性CD8 T细胞中分析CREM签名，我们通过使用Seurat R Package v.3.2.0中的RUNPCA函数来计算主组件来对SCRNA-SEQ数据进行无监督的聚类。接下来，我们使用Harmony v.1.2.0集成了四个患者数据集。我们使用Clustree R软件包V.0.4.0（参考文献86）确定了聚类分辨率（0.6）。最后，我们使用UCELL R软件包v.1.2.4（参考文献87）分析了CREM签名。参见图3和扩展数据图4。 　　涵盖ICER特异性外显子以及驱动ICER和Smicer的表达的替代启动子的基因组区域分别使用小鼠ES细胞中的同源重组的LOXP位点两侧（扩展数据图8A）。新霉素抗性盒侧面是FRT部位的两侧，并通过与FLP占用的小鼠进行了互相去除，从而产生了ICERFL等位基因（b）。ICERNULL等位基因是由CRE介导的重组产生的（扩展数据图8B）。带有ICERFL等位基因的小鼠被反向C57BL/6背景进行十多个以上。为了使ICER在T细胞中的特异性缺失，将ICERFL/FL小鼠与CD4CRE小鼠间交叉。将小鼠维持在没有特定病原体的设施中。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。