肺炎爆发与新的冠状动脉起源有关的冠状病毒

　　在过去的二十年中，冠状病毒引起了两种大规模大流行，SARS和中东呼吸综合症（MERS）8,9。人们普遍认为，SARSR-COV（主要在蝙蝠中发现）可能会导致未来的疾病疫情10,11。在这里，我们报告了一系列由中国中部湖北省武汉肺炎爆发的一系列病例。这种疾病爆发始于当地的海鲜市场 - 大大成长是为了感染中国的2,761人，与80例死亡有关，并导致截至202012年1月26日，在10个国家中感染了33人。疾病发作可能导致由于肺泡损伤而导致呼吸道衰竭（如横向胸部计算机计算学图像所观察到的）甚至死亡。该疾病被确定是由病毒诱导的临床医生根据临床症状和其他标准引起的，包括体温的升高，淋巴细胞和白细胞的数量减少（尽管后者有时是正常的水平），胸部放射线摄影的新肺部浸润和未经抗伤分子治疗后没有明显的改善。看来，大多数早期病例与原始海鲜市场都有联系。但是，该疾病现在已经通过人类到人类的接触来传播。 　　七名严重肺炎患者（其中六名是海鲜市场的卖方或分娩），他们被送往爆发开始时送往武汉·金·杨医院的重症监护室，被送往武汉病毒学研究所（WIV）的实验室（WIV），以诊断为导致patedentagentive Peratonication Paterentagential Paterion Paterendent Paterion Paterended Dagity表1）。作为一个实验室调查COV，我们首先使用Pan-COV PCR引物测试这些样品13，鉴于爆发发生在冬季和市场中，与SARS感染相同。我们发现五个样品对COV是PCR阳性的。通过使用下一代测序的元基因组学分析分析了从支气管肺泡灌洗液（BALF）收集的一个样品（WIV04），以鉴定潜在的病因学剂。在10,038,758个总读数中，在过滤来自人类基因组的读数后，保留了1,582个总读数 - 1,378（87.1％）序列与SARSR-COV的序列相匹配（图1A）。通过从头组装和目标PCR，我们获得了一个29,891-Base对COV基因组，该基因组与SARS-COV BJ01（GenBank登录号AY278488.2）共享了79.6％的序列身份。通过将总读数重新读取到该基因组来获得高基因组覆盖率（扩展数据图1）。该序列已提交给Gisaid（https://www.gisaid.org/）（登录号EPI_ISL_402124）。按照世界卫生组织（WHO）给出的名称，我们暂定称其为小说冠状病毒2019（2019-NCOV）。2019-NCOV（WIV02，WIV05，WIV06和WIV07）的四个全长基因组序列（GISAID登录号EPI_ISL_402127-402130）随后从四个使用下一代序列和PCR的其他患者获得了与彼此相同的99.9％以上的99.9％以上。 　　该病毒基因组由六个主要的开读帧（ORF）组成，这些框架是冠状病毒和许多其他附件基因共有的（图1B）。进一步的分析表明，一些2019-NCOV基因与SARS-COV共有小于80％的核苷酸序列同一性。但是，用于COV物种分类的ORF1AB中七个保守复制酶结构域的氨基酸序列在2019-NCOV和SARS-COV之间相同94.4％，这表明这两种病毒属于同一物种SARSR-COV。 　　然后，我们发现，来自蝙蝠冠状病毒（BATCOV RATG13）的RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）（RDRP）先前是在云南省的Rhinolophus affinis中检测到的，该区域是从云南省的Rhinolophus affinis中检测到的，它显示了2019年NCOV的高序列。我们在此RNA样本（GISAID登录号EPI_ISL_402131）上进行了全长测序。Simplot分析表明，整个基因组与Ratg13的2019-NCOV高度相似（图1C），总体基因组序列同一性为96.2％。使用2019-NCOV，RATG13，SARS-COV和先前报道BAT SARSR-COV的对准基因组序列，在2019-NCOV的基因组中未检测到重组事件的证据。全长基因组和RDRP和SPIKE的基因序列的系统发育分析表明，对于所有序列，RATG13是2019-NCOV的最接近的亲戚，它们与其他SARSR-COV形成了独特的谱系（图1d和扩展数据图2）。由S基因编码的受体结合尖峰蛋白与其他COV高度分歧（扩展数据图2），除了对所有先前描述的SARSR-COV，核苷酸序列的身份少于75％，除了对Ratg13的93.1％核苷酸的身份（扩展数据表3）。2019-NCOV和RATG13的S基因比其他SARSR-COV长。2019-NCOV的S基因序列的主要差异是N末端结构域中的三个短插入以及与SARS-COV的序列相比，受体结合基序中五个关键残基中有四个的变化（图3）。是否需要进一步研究MERS-COV中的N末端插入2019-NCOV的S蛋白的N端结构域。与Ratg13的密切系统发育关系提供了证据，表明2019-NCOV可能起源于蝙蝠。 　　我们基于S基因的受体结合结构域的序列迅速开发了一种基于QPCR的检测方法，该基因是基因组最可变的区域（图1C）。我们的数据表明，引物可以将2019-NCOV与包括BAT SARSR-COV WIV1在内的所有其他人类冠状病毒区分开，该冠状病毒与SARS-COV共享95％的身份（扩展数据图4A，B）。在从七名患者中获得的样品中，我们发现在第一次采样期间，2019-NCOV六个BALF和5个口头拭子样品呈阳性，如QPCR和常规PCR所评估。但是，在第二次采样期间，我们无法再检测到从这些患者中采集的口腔拭子，肛门拭子和血液样本中的病毒阳性样品（图2A）。但是，我们建议将其他QPCR靶标，包括RDRP或INVELOPE（E）基因进行2019-NCOV的常规检测。根据这些发现，我们建议该疾病可以通过空中传播传播，尽管我们不能排除其他可能的传播途径，因为需要进一步的调查，包括更多患者。 　　For serological detection of 2019-nCoV, we used a previously developed nucleocapsid (N) protein from bat SARSr-CoV Rp3 as antigen for IgG and IgM enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), as this protein shared 92% amino acid identity to N protein of 2019-nCoV (Extended Data Fig. 5) and showed no cross-reactivity against other human coronaviruses exceptSARSR-COV7。我们只能从七个病毒感染患者中获得五个血清样品。我们监测了一名患者的病毒抗体水平（ICU-06）7、8、9和18天（扩展数据表2）。在IgG和IgM滴度中观察到了明显的趋势，随着时间的流逝，IgM滴度在最后一个样本中减少了（图2B）。作为第二个分析，我们在疾病发作后20天左右的7例病毒阳性患者中的5例中测试了病毒抗体的样品（扩展数据表1、2）。所有患者样本（但不是来自健康个体的样本）对病毒IgG的呈阳性（图2B）。还有三个IgM阳性样品，表明急性感染。 　　接下来，我们使用患者ICU-06的BALF样品从Vero E6和HuH7细胞中成功地将病毒（称为2019-NCOV BETACOV/WUHAN/WIV04/2019）分离出来。孵育三天后，在细胞中观察到明显的细胞致病作用（扩展数据图6a，b）。使用交叉反应性病毒N抗体（扩展数据图6c，d）和宏基因组测序通过免疫荧光显微镜在Vero E6细胞中验证了菌株WIV04的身份，并且大多数读取的读取大多数读取了2019-NCOV，QPCR分析显示为QPCR分析，显示了病毒载载载荷，显示了病毒载载载荷量从每日日数增加了。被感染细胞的超薄切片中的病毒颗粒显示出典型的冠状病毒形态，如电子显微镜可视化（扩展数据图6G）。为了进一步确认病毒IgG阳性样品的中和活性，我们使用IgG阳性的五种患者血清在VERO E6细胞中进行了血清中和化测定。我们证明，所有样品都能够以1：40–1：80的稀释度中和2019-NCOV的100 TCID50（50％组织感染剂量）。我们还表明，这种病毒可以通过1:40的稀释液通过马抗Sars-CoV血清（来自L.-F。Wang的礼物）进行交叉中和。但是，需要用人类的抗SARS-COV血清确认与SARS-COV抗体的交叉反应性的潜力（扩展数据表4）。 　　已知ACE2是SARS-COV14的细胞受体。为了确定2019-NCOV是否也将ACE2用作细胞进入受体，我们使用表达或未表达来自人类，中国马蹄形蝙蝠，Civets，猪和小鼠的ACE2蛋白的HELA细胞进行了病毒感染性研究。我们表明，2019-NCOV能够使用所有ACE2蛋白，除了小鼠ACE2，作为进入ACE2表达ACE2的细胞的入口受体，而不是未表达ACE2的细胞，表明ACE2可能是2019年NCOV进入细胞的细胞受体（图3）。我们还表明，2019-NCOV不使用其他冠状病毒受体，例如氨基肽酶N（APN）和二肽基肽酶4（DPP4）（扩展数据图7）。 　　该研究提供了一份有关2019-NCOV的详细报告，该报告可能是导致中国和其他国家急性呼吸综合症流行病的可能的病因学剂。在所有测试的患者中都观察到病毒特异性核苷酸阳性和病毒蛋白血清转化，并提供了该病毒之间存在关联的证据。但是，仍然有许多紧急问题要回答。动物实验尚未验证2019-NCOV与该疾病之间的关联，以实现科赫假设，以建立微生物与疾病之间的因果关系。我们尚不知道宿主中这种病毒的传播常规。看来该病毒在人之间变得越来越多。我们应该密切监测该病毒是否继续发展为更具毒性。由于缺乏特定治疗方法，并且考虑了2019-NCOV与SARS-COV的相关性，因此可能会使用一些针对SARS-COV的药物和临床前疫苗来治疗该病毒。最后，考虑到SARSR-COV在其自然储层中的广泛传播，未来的研究应集中于对这些病毒的积极监测，以供更广泛的地理区域。从长远来看，应为将来由这种病毒簇引起的新兴传染病准备广谱的抗病毒药物和疫苗。最重要的是，应实施针对野生动植物的驯化和消费的严格法规。 　　在证明中添加的注意：由于本文接受了，因此ICTV已将病毒指定为SARS-COV-215；此外，WHO发布了该病毒引起的疾病的官方名称，即1916年Covid。