SARS-COV-2 OMICRON SUBVARIANTS BA.2.12.1，BA.4和BA.5的抗体逃避抗体

　　没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。 　　在哥伦比亚大学欧文医学中心收集了接受三剂MRNA-1273或BNT162B2疫苗的人的血清。从2021年1月至2021年9月，在哥伦比亚大学欧文医学中心或Hackensack Meridian发现与创新中心收集了来自SARS-COV-2的非摩托点变体的血清。从2021年12月至2022年5月在哥伦比亚大学欧文医学中心收集了疫苗接种后感染Omicron（BA.1或BA.2）的人的血清。抗核蛋白ELISA证实了所有样品以前的SARS-COV-2感染状态。所有收款均根据哥伦比亚大学机构审查委员会或Hackensack子午发现与创新中心审查和批准的协议进行。所有参与者均提供了书面知情同意。扩展数据表4提供了有关研究参与者不同研究参与者的临床信息。 　　抗体表示如前所述17。合成了每种抗体的重链变量和轻链可变基因（Genscript），然后转染到Expi293细胞（Thermo Fisher Scientific）中，并使用rprotein a sepharose（GE）通过亲和纯化从上清液中纯化。Regn10987，Regn10933，COV2-2196和COV2-2130由Regeneron Pharmaceuticals提供；Brii Biosciences提供了BRII-196和BRII-198；CB6由B. Zhang和P. Kwong（国立卫生研究院（NIH））提供，ZCB11由Z. Chen（香港大学）提供。 　　从Thermo Fisher Scientific（A14527）获得了EXPI293细胞；从ATCC获得VERO-E6细胞（CRL-1586）；从ATCC获得人类胚胎肾脏293T（HEK293T）细胞（CRL-3216）。细胞是从身份验证的供应商那里购买的，并在使用前在视觉上确认了形态。所有细胞系测试了支原体阴性。 　　如先前所述23,26，生成了BA.1，BA.1.1和BA.2表达尖峰的质粒。编码BA.2.12.1和BA.4/5尖峰的质粒，以及在BA.2.12.1和Ba.4/5中发现的个体和双突变，使用Quikchange II XL位置定位的诱变型试剂盒根据制造商的指示（Agilent）。为了表达稳定溶剂S2P尖峰蛋白的表达构造，2P取代（K986P和V987P）以及液逆裂解位点的“ GSA”取代（682–685氨基酸（682-685氨基酸）（WA1中的WA1），在Spike-seckike-necike-necike-necike-tecrike-inclike-incemids-incean-incain-incean-incain-incain-incain-incrains-incrands-anclys plasmids 35中均引入中。尖峰的WA1）与C末端8×His-Tag融合，并将其克隆到PAH矢量中。通过Sanger测序确认所有构建体。 　　D614G和OMICRORS子变量的SARS-COV-2 S2P SPIKE TRIMER蛋白是通过使用S2P Spike Trimer表达型构建体转染Expi293细胞，并使用1 mg ML-1聚乙基氨基转染，然后使用超级ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni-ni ishery均产生，然后使用1 mg mL-1的trimer trimer表达构建体来产生。说明17。 　　HACE2结合与SARS-COV-2 S2P SPIKE的SPR结合测定使用BIACORE T200生物传感器配备了S CM5芯片（Cytiva），在10 mm HEPES pH 7.4，150 mm NaCl，NaCl，3 mm Edta，3 mmmm Edta，0.05％P-20（Cytiva）中，在10 mm HEPES pH 7.4，150 mm NaCl中进行了SCM5芯片（Cytiva）。尖峰蛋白通过其C末端HIS标签在抗His抗体表面上捕获。这些表面是根据制造商的说明使用His捕获试剂盒（Cytiva）生成的，每种表面上大约有10,000 RU的抗His抗体。没有抗原的抗HIS抗体表面用作参考流量细胞，以去除结合信号的大量移位变化。 　　使用三倍稀释系列测试了人ACE2-FC蛋白（SINO生物学）的结合，其浓度范围为2.46至200 nm。分别在30 µl min -1下分别监测60 s和300 s的关联和解离速率。使用10 mM甘氨酸pH 1.5从抗HIS抗体表面再生结合的尖峰-ACE2复合物。通过注入运行缓冲液而不是人ACE2-FC来进行空白的缓冲循环以从结合信号中删除系统噪声。处理所得数据并使用BIACORE评估软件拟合到1：1结合模型。 　　如前所述17，在囊泡口腔炎病毒背景中产生了假病毒，其中天然糖蛋白被SARS-COV-2及其变体代替。简而言之，用1 mg ml-1聚乙基亚胺转染HEK293T细胞，在37°C下在5％CO2以下，然后在5％CO2下过夜，然后感染囊泡性口腔炎病毒-G-Pseudotipy pseudotipy pseudation tim pseudotipedΔG-葡萄酶（G*ΔGuluciferase，g*Δguluciferase，kerafast）1天1天。感染2小时后，将细胞洗涤3次，更改为新鲜培养基，然后在收集上清液之前再培养约24小时，通过离心澄清，并在-80°C下进行等分存储，以进一步使用。 　　首先将所有病毒滴定以使测定之间的病毒输入标准化。首先将热灭活的血清或抗体在96孔板的一式三份中连续稀释（五倍），从1：100稀释的血清，抗体的10 µg ml-1开始。然后加入假病毒，并将病毒 - 样品混合物在37°C下孵育1小时。然后将Vero-E6细胞以每个孔的3×104细胞的密度加入，并在37°C下孵育约10小时。使用SoftMax Pro V.7.0.2（分子设备）根据制造商的说明，使用荧光素酶测定系统（Promega）对荧光素酶活性进行定量。中和曲线和IC50值是通过将非线性五参数剂量响应曲线拟合到GraphPad Prism v.9.2中的数据来得出的。 　　SARS-COV-2病毒HCOV-19/USA/CO-CDPHE-2102544747/2021（BA.2）和HCOV-19/USA/USA/MD-HP30386/2022（BA.4）获得从BEI（NIAID，NIH）获得，并通过传播通过Vero-E6细胞传播。如前所述17，通过对VERO-E6细胞的终点稀释和细胞致病作用测定确定病毒感染性滴度。 　　进行了终点稀释的微板中和测定法，以测量接种和增强个体以及纯化的单克隆抗体的血清中和活性。简而言之，从1：100开始，将血清样品连续进行五倍稀释。单克隆抗体从5μgml -1开始连续稀释（五倍）。在Eagle的Minumum必需培养基中，将每种稀释度的三份稀释度与SARS-COV-2一起在0.1的多种感染中孵育，在37°C下灭活了7.5％的胎儿小腿血清1 h。孵育后，将病毒 - 抗体混合物转移到过夜的Vero-E6细胞的单层中。将细胞与混合物孵育约70小时。两名独立的观察者在视觉上对病毒感染的细胞致病作用对每个孔进行了视觉评分。然后将结果转化为在给定样品稀释或单克隆抗体浓度下中和的百分比，并使用GraphPad Prism v.9.2中的五参数剂量响应曲线绘制数据（平均值±S.E.M.）。 　　从PDB下载了用于显示表位足迹的SARS-COV-2尖峰结构（PDB 6ZGE）。使用带有默认参数的PISA36鉴定了表位残基，并且具有非零埋入的可及表面积的RBD残基被视为表位残基。对于RBD中的每个残基，将抗体识别的频率计算为接触抗体的数量37。还从PDB（7L5B（2-15），6XDG（REGN10933）和7kmg（LY-COV555））获得了用于建模的抗体 - Spike复合物的结构。从PDB 7U0N下载了Omicron Ba.1 rb D与HACE2一起使用，并从PDB 7UB0下载了无配体BA.2 RBD。Pymol V.2.3.2用于执行诱变并生成结构图（Schrödinger，LLC）。 　　通过将每个血清样品的中和效力纳入先前描述的抗原制图方法27中，可以近似SARS-COV-2变体之间的抗原距离。该地图是由Racmacs软件包（https://acorg.github.io/racmacs/，v.1.1.4）在R中生成的，其优化步骤设置为2,000，最小列基础参数集设置为“无”。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。