皮质杏仁核在塑造社会相遇中的关键作用

　　野生型Swiss-Webster（SW）小鼠（男性和女性，12-15周； Charles River）和ESR1-CRE小鼠（017911，B6N.129S6（CG）-ESR1TM1.1（CRE）（CRE）和/J; Jackson Laboratory）与SW雌性交叉以获得F1小鼠的使用。RI测试的入侵者为8-12周大的雄性或雌性C57/BL6J小鼠（杰克逊实验室）。在任何实验方案之前，所有已递送的小鼠都被允许对住房设施进行一周的适应。在四个星期时，将小鼠与同窝仔分开，并与异性成员配对，以供八个星期大时进行两天的性经历。将女性与cast割的SW雄性（8-12周；查尔斯河）配对，以防止怀孕。所有小鼠均在12 h – 12 h的光线周期（07：00–19：00）中保持，并随意进入食物和水。住房和实验室保持在20–22°C和40–60％的湿度。在光阶段进行实验。将动物随机分配给组，竞技场或治疗，并以双盲方式进行数据分析。根据经验和历史研究选择样本量。根据《美国国家卫生研究院的护理和使用实验动物》指南进行了程序，并获得了西奈山机构动物护理和使用委员会的伊坎医学院的批准。 　　使用以前的研究改编的方案对小鼠进行筛选3,41,42。简而言之，取出笼子顶部并用有机玻璃盖代替以监视试验。将一种与居民的性别相匹配的新型C57BL/6J小鼠被引入每个笼子，并允许小鼠自由相互作用5分钟。此后，入侵者小鼠被送回他们的家庭笼子，就女性RI试验而言，同居雄性小鼠被送回他们的家笼。对于男性交配测定，SW女性入侵者被预先筛选以接受性接受。所有测定持续10分钟，入侵者小鼠在会议结束时将其返回到他们的笼子。记录所有视频以供以后分析。使用观察者XT 11.5（Noldus Interactive Technologies）手动注释居民行为。 　　如前所述进行了攻击性自我管理测试。简而言之，将SW常驻小鼠放在标准的Med Associates操作室中，每天进行八次试验，持续16天，以便他们按下杠杆（FR1），以通过吉洛林门通过吉洛林门进入下属的同性小鼠进入操作室。在试验期间，房屋的光照亮了房间，并且始终延长了一个不活动的杠杆。在审判开始时，房屋的灯打开了，10秒钟后延长了杠杆。如果居民敦促获得奖励，则播放2-S音调，而活动杠杆旁边的断头台门打开了12秒钟。手动将同性C57BL/6J入侵者手动推入室内，并在试验结束时删除了入侵者。如果居民没有按压，则活性杆在60 s后缩回。所有钱伯斯还拥有带有横梁 - 断门注册入口端口的嵌入式食品颗粒插座。除了试验设计外，我们使用与自我管理训练的参数相同的参数进行了所有渐进率（PR）测试。在获得奖励（给定试验的所需主动杆数量）之后，将自动断头台门打开10 s，并在主操作室内手动将同性入侵（C57BL/6J）手动推动。自动门关闭后，立即重新延伸了主动型杠杆。攻击后或经过30秒后，将入侵者小鼠从腔室中移除。如果在总持续时间长达20分钟后未发生增强反应，则公关会议将终止。在整个课程中，对于每个试验，激活断头台门并获得入侵者所需的响应数量在指数进程后会增加（r =（5×e0.12p）-5，其中p是先前的比率）。断点值对应于奖励总数（在整个会话中访问入侵者的数字访问）。用AAV9-DIO-HM4DI-MCHERRY或AAV9-DIO-MCHERRY在COAPL中转染的ESR1-CRE小鼠（请参见下文，有关滴度，手术信息和坐标），在PR的两天内施用了盐水或CNO。在两个队列之一中监视了自我管理的获取。图3J中的数据来自队列2。 　　在接受测试前两天，小鼠习惯了并允许食用可口的食物（Reese的迷你花生杯）。然后在测试前一天晚上，小鼠受到食物的限制。在红灯下测试小鼠，并放入干净的笼子中。食物被放在笼子床上的深处8厘米，发现食物的时间是用秒表记录的。 　　雄性和雌性C57BL/6J小鼠用作靶小鼠，并将其放置在网格杯中的开放式围墙的相对侧。测试小鼠被放置在空地中，并允许在红光下探索竞技场五分钟。用高架情感摄像头记录小鼠，并手动将与每只鼠标互动的时间手动评分。为了计算歧视比率，与两只小鼠相互作用所花费的总时间被与男性和男性所花费的时间之间的差异分开。阳性歧视比率表明与女性在一起的时间更多，而负比例表明与男性花费了更多的时间。 　　对于IDISCO+，将小鼠注入10％氯氢酸盐，并在1倍的1×PBS中将冰冷的1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）灌注。将大脑在4°C的同一固定剂中固定12小时。对于鱼，将大脑迅速去除，并在-30°C等异坦烷中闪烁5-10 s，然后保持在-80°C，直到切片。使用低温恒温器（Leica）以15μm切片切片。注射后48或70小时灌注注射H129ΔTK-TT的小鼠。 　　对于鱼，根据制造商的说明使用了rnascope多重荧光试剂盒（高级细胞诊断）。将新鲜液体的大脑安装在玻片上，厚度为15μm，在冷4％PFA中固定15分钟，并以50％，70％和100％的EtOH/H2O串行脱水2分钟，然后进行20分钟的蛋白酶IV（rnascope）治疗。Proprietary probes (Advanced Cell Diagnostics) for Fos (316921, accession no. NM_010234.2), Vglut1 (also known as Slc17a7) (SLC17A7-C3, accession no. NM_182993.2) and Esr1 (478201-C2, accession no. NM_007956.5) were hybridized at 40 °C for2 H，然后在40°C（1-FL，30分钟； 2-FL，15分钟； 3-FL，30分钟； 4-FL，15分钟）处进行一系列扩增步骤。试剂ALT-A用于第四个扩增步骤，通道1处于488 nm，通道2为550 nm，在647 nm处的通道3。最后，将幻灯片用DAPI处理30 s，并立即用生态安装覆盖。使用Zeiss LSM 780共聚焦显微镜对所有切片进行成像。从所有ISH图像中的细胞（每个样品两个）以20倍的形式盲目计数。每个探针至少有五个点的细胞被认为对感兴趣的探针呈阳性。通过创建DAPI通道的16位灰度图像来计数细胞核。创建了一个阈值，并使用“分析粒子”插件计数核。使用“分析颗粒”功能，分析了每个样品的两个部分，以40倍的MRUBY+ PUNCTA定量。每个部分以4μm的间隔包含三个或四个光学部分。手动计数来自两个部分的起始细胞。 　　IDISCO+染色协议是从http://www.idisco.info（参考文献43）修改的。将固定的全脑与原代FOS抗体（226003，1：1,000，突触系统）和次级驴抗兔IgG（H+L）孵育高度交叉吸附的二级抗体，Alexa Fluor 647（A-31573，1：1：1：1：1：1,000，热渔民科学），每天持续7天。带有变焦主体的Lavision灯页显微镜用于半脑矢状扫描，具有动态焦点和4μm的步长。清除大脑的处理如前所述，使用ClearMap13。使用细胞检测模块对FOS+细胞进行定量，并根据信号的强度和形状参数进行了优化和验证的细胞检测参数。使用Elastix工具箱将自动荧光通道与Allen Institute的共同坐标框架对齐。为了比较性别和HM4DI与MCHERRY中的AGGS和NON之间的细胞计数，使用R的GLM.NB函数进行了负二项式回归。对R中的质量包装中的glm.nb函数进行了。组分类为虚拟分类（AGG组为0，非组为1）。通过迭代重新加权的最小二乘确定最大样品系数α和β。显着的β意味着组状态与指定感兴趣区域处的细胞计数有关。z得分对应于该β系数，该系数通过其样品标准偏差进行标准化。使用Benjamini – Hochberg程序校正P值以进行多次比较，以降低错误发现率。Q值低于0.05被认为是显着的。为了进行网络分析，将数据扩展到480个大脑区域。为了进行GLM分析，将数据折叠到271个区域。 　　通过腹膜内注射氯胺酮HCl（100 mg kg – 1）和甲苯嗪（10 mg kg – 1），将ESR1-CRE小鼠（8-10周龄）麻醉，并放在立体仪器上（David Kopf Instruments）。在Coap（CoAPL）的侧部分（Bregma：AP -1.7 mm； Ml±2.8 mm； DV-5.9 mm），使用33尺尺寸的Hamilton用在5分钟内双侧注入0.3μl病毒，并在5分钟内剩下5分钟的针，可在注射后剩下5分钟。为了输送病毒，0.3μL的AAV8-HSYN-DIO-HM3D-MCHERRY（2.0×1012 VG ML – 1，NO。44361-AAV8，ADDGENE），AAV9-HSYN-DIO-HM4D-MCHERRY（2.0×1012 VG ML-1，no。444362-HSYN-HYNENN-HYNENN-HYNENN-HYNENN-HYNENN）或A.（2.0×1012 VG ML – 1，NO。50459-AAV9，ADDGENE）被注入COAPL中。我们还将0.3μlAAV9-HSYN-DIO-HM4D-MCHERRY（2.0×1012 VG ML – 1，NO。44362-AAV9，ADDGENE）注射到COAPM（Bregma：AP -2.4 mm; Ml±2.0 mm; Ml±2.0 mm; DV-5.6 mm）中。为了进行直系示踪，0.3μL的AAV1-HSYN-FLEX-MGFP-2A-突触蛋白蛋白 - 鲁比（3×1012 VG ML – 1，NO。7161-AAV1，addgene）或0.2μLH129δTK-TT（4.0×109 VG ML-1，中心）单方面注射到COAPL中。对于光遗传操作，AAV9-EF1A-DIO ENPHR3.0-YFP（3.0×1012 VG ML – 1，NO。26966-AAV9，ADDGENE）或AAV9-EF1A-DIO-YFP（3.0×1012 VG ML – 1，no。20298-AAV9，ADDGENE）注入了COAP，所有AAV注射均在行为实验前三到四个星期进行。对于原遗传（NPHR）和FP实验，插管（NPHR：MFC_200/240-0.22_3MM_MF1.25_FLT; FP：MFC_200/250.57_3MM_MF1.MF1.25_FLT）植入了与局部植入的时间（均为0.2均为coapl soperal in Digrant in Digrant in Digrant in Digner，MMM MM MMM MMM MM MM MMM MM MMMM MMM。地点）。For optogenetic (eNpHR3.0) experiments of COApl terminal stimulation, cannulae (MFC_200/240-0.22_MF1.25_FLT, 6 mm for VMHvl, 5 mm for CEA) were bilaterally implanted into the VMHvl (from bregma: AP −1.7 mm; ML ±2.5 mm; DV −5.5 mm,20°角）或CEA（来自核酸元：AP -1.5 mm; ml±2.5 mm; dv -4 mm，0°角）。为了固定光纤的固定装置，将牙科水泥（握把水泥; dentsply）添加到头骨和纤维周围。 　　CNO（1 mg kg – 1，tocris）在RI测试，开放式，侵略自我给药，隐藏的食物和性别歧视测试前30分钟进行腹膜内。 　　对于黄色（ENPHR3.0）光刺激，光纤（BFP（2）_200/220/900-0.22_4M_FCM-2XMF1.25，Doric镜头）连接到589-NM黄色激光二极管（NO.MGL-III-589-50M50M589-50MW，OPTO ATC）（编号MFP_200/240/900-0.22_4M_FC-MF1.25，Doric镜头）。在五分钟的RI测试期间，使用功能发生器（第33220A号，安捷伦技术）为ENPHR3.0实验生成恒定的黄光。对于所有光遗传学测试，在RI进行测试之前，将实验小鼠习惯于斑块绳索两天。对于RI实验，对小鼠进行了两天的测试，在激光下和激光条件下对闭环行为实验进行了平衡，激光持续了10 s，作为以平衡方式以其他方法进行入侵者的居民启动方法。攻击行为在灯光打开的时期进行了量化。为了进行交配实验，在实验的持续时间内留下了光。 　　纤维光度法是根据神经运动手册和已发表的方案5进行的。一条纤维光贴片线附着在植入的套管上，立方氧化锆套筒上覆盖着黑色管。电缆的另一端耦合到神经运动测定端口。开源盆景计划用于控制系统。470 nm和415 nm LED灯用于GCAMP6S信号和自动荧光测量。纤维尖端的光在40μW至80μW之间，并且在测试日内在试验中持续恒定。从470 nm和415 nm通道中同时记录40 fps，并使用盆景可视化并可视化。在病毒注射和锻炼植入后三周，在RI测试中测试了小鼠，并以平衡的方式出现了不同的气味。一旦连接到设备，允许小鼠休息并习惯3-5分钟。对于RI测试和气味呈现，我们在没有入侵者的基线活性的2分钟内记录了Ca2+荧光，其次是入侵者或气味暴露的5分钟。415 nm通道用作控制通道，并从GCAMP6S通道中减去以消除自动荧光，漂白和运动效应。通过在基线记录的最后一分钟中减去平均值，然后将结果值除以在基线的最后一分钟，然后将结果值除以平均值来计算荧光（ΔF/F）的变化。然后，通过从每个值中减去平均ΔF/f并除以标准偏差来对此值进行z评分。行为数据在情节中手动注释，并将时间戳与荧光记录对齐。 　　ESR1-CRE×SW雄性小鼠（大约三到四个月大）使用氯胺酮和甲基嗪的混合物麻醉，并放置在立体定位仪（David Kopf）中。After exposing the skull, custom-made platinum–iridium depth electrodes (Pinnacle Technology) were implanted in the CoApl (from bregma: AP −1.7 mm; ML ±2.8 mm; DV −5.7 mm) in the VMH (from bregma: AP −1.7 mm; ML ±0.7 mm; DV −5.8 mm) Before implantation, the electrodes were涂有Vybrant Dil细胞标签溶液（Invitrogen），以后检查放置电极的位置。在左右小脑上植入了两个头骨螺钉（0.25厘米，顶峰技术），以作为记录LFP的地面和常见参考。将电极和参考螺钉连接到小鼠的6针连接器（Pinnacle Technology），并使用牙科水泥（Metabond）密封。手术后，在行为测试之前，小鼠在标准住房条件下恢复了至少一周。所有录音均在鼠标家庭笼中进行，行为会议均由连接到Ethovision 15（Noldus）的高架相机进行录像。通过情节发送到LFP采集软件，以同步行为和神经生理学数据。LFP信号是使用束缚数据采集系统（8401HS，Pinnacle Technology）捕获的，并使用Sirenia获取软件（Pinnacle Technologn）捕获。使用顶峰技术前置放大器（增益×100），高通（0.5 Hz）和低通（200 Hz）过滤器以2 kHz获取数据。将信号分割为单个试验时期，该时期与刺激发作对齐。 　　将原始数据文件加载到R中，并使用PSD软件包44分析。在分析之前，使用Butterworth滤波器将信号低通量过滤至200 Hz。从未选择攻击之前的攻击或调查回合的前两秒钟的信号进行分析。我们选择了前两秒钟，因为所有感兴趣的行为持续了至少两秒钟。在每个细分市场上执行了具有多个正弦Tapers45的快速傅立叶变换。然后对Delta（1-4 Hz），Theta（5-12 Hz）和Gamma（40-100 Hz）频带进行带通滤波数据。相干性（定义为跨光谱密度除以自光密度）的值是使用每个事件的pspectrum函数从0 Hz到100 Hz计算的，并在每个事件中平均每个值。从社会行为期间获得的相干值中减去了一分钟基线周期的相干值。 　　为了记录光学引起的兴奋性突触后电流（OEPSC），AAV9-EF1A-DIO-CHR2-EYFP（0.5μL，3.0×1012 VG ML – 1，Addgene，35509-AAV9）单方面注入了八周的男性男性Esr1 coapl。注射后五到八周，使用压缩机（NO。VF-210-0Z编号（0-4°C）基于蔗糖的人工脑脑脊髓液（ACSF），冠状和CEA的冠状大脑切片，编制了冠状脑切片（vf-210-0z，vf-210-0z，精确仪器）Nahco3，75毫米蔗糖和25毫米葡萄糖。将切片转移到记录室中，在2-3 mL min – 1中连续灌注ACSF。Patch pipettes (4–7 MΩ) were pulled from thin-walled borosilicate glass using a micropipette puller (P-97, Sutter Instruments) and filled with a potassium gluconate (KGlu)-based intrapipette solution containing 116  mM KGlu, 20 mM HEPES, 0.5 mM EGTA, 6 mM KCl, 2 mM NaCl, 4 mM ATP,0.3 mM GTP和2 mg ML – 1生物细胞（调整为7.2）。使用带有IR-DIC透镜的直立显微镜可视化细胞，并用白光源（Scientifica）照明。通过显微镜物镜使用470 nm LED（PE-300ULTRA，cOOLLE）照明来可视化EYFP+细胞。VMH和CEA神经元以电压钳模式记录。通过显微镜×40物镜（每脉冲5 ms，470 nm； pe-300ultra，coolled）刺激coaplesr1端子。在存在四毒素（TTX，1μM，Tocris）和4-氨基吡啶（100μM，Tocris）的情况下，以-70 mV记录OEPSC，以探测单突触效应。通过浸泡NBQX（NO。SR-95531，5μM，Tocris）的浴室阻止OEPSC，从而证实了突触接触的谷氨酸能性质。使用斑块钳放大器（Axoclamp 200B，分子设备）进行全细胞记录，该放大器连接到Digidata 1550 Lownoise采集系统（分子设备）。信号被低通过滤（Bessel，2 kHz） 并使用数据采集软件PCLAMP 11（分子设备）以10 kHz收集。提取电生理记录并使用夹具（分子设备）分析。 　　对于网络构建，我们遵循了先前发布的指南46。简而言之，创建了一个N×N邻接矩阵，该基质使用功率邻接函数编码了节点对（大脑区域）之间的连接强度：aij = | sij |β。AIJ指的是邻接矩阵，而SIJ是指I和J之间的相关性与β的功率相关。相关性提高到β的力量，以减少潜在的相关性的影响。为了测量聚类节点之间的相似性，使用了拓扑重叠度量（TOM）：。ωi，j是指汤姆矩阵，而aij = | si |β。用文字说，这是区域i和j之间共享连接的产物的总和，以及区域i和j之间的直接连接。该值由分母划分，以达到0到1之间的值。为了比较网络中性别之间的这些模块的表达，在每个模块上计算了一个单数值分解（SVD）。SVD定义为：。Xn是网络中nth模块的tom矩阵，U和VT是正交矢量的矩阵，s是特征值的对角线矩阵，表示u和v的每个列的变化都在考虑到多少变化。保存功能。对于网络之间的比较，我们重点介绍了以下连接性的度量：Z.Cor Kim，Z.Cor.kme，Z.Cor.kmeall，Z.Cor.Cor.Cor和Z.Cor.mar。对于密度度量，我们专注于z。 Z.Meanadj和Zmean.Mar。通过将模块标记在测试网络中随机置换并计算相应的保存度量，从而得出所有Z值。每个统计量的平均值从观察到的统计量中减去，并除以统计量与排列的标准偏差。有关保存措施的详细说明，请参见补充表2。上述所有步骤均使用R中的WGCNA包进行。 　　所有统计测试和相关信息均在图中报告。使用GraphPad Prism软件进行所有t检验，单向和双向方差分析。双向方差分析进行了分析，然后进行šídák或Tukey的多镜头测试进行事后分析。单向混合效应方差分析之后进行了Tukey的事后测试。对于按区域IDISCO+分析的区域之间的比较，使用Benjamini – Hochberg程序校正了P值，以降低错误发现率。Q值低于0.05被认为是显着的。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。