灵长类动物视网膜中的型在型方向选择性神经节细胞

　　从俄勒冈州和加利福尼亚州国家灵长类动物研究中心的生物镜分布计划或UC Berkeley的动物中，从俄勒冈州和加利福尼亚州国家灵长类动物研究中心立即获得了来自性别后的动物（6名男性，5名女性，年龄范围1.17-19.17岁）的动物的猕猴（M. Mulatta）眼睛。根据加州大学伯克利分校的动物护理和使用委员会批准的程序，并根据《国家研究委员会指南》中指定的程序，根据终端麻醉的眼光被终止麻醉。在将后眼镜转移到用95％氧/5％二氧化碳平衡的AMES培养基中之前，将前部迅速去除。在室温下（20–22°C）将眼睛储存在黑暗中，直到使用（验尸后48小时）。鼻视网膜中的所有位置均使用该公式指定为等效的偏心率，其中x是鼻中鼻中的距离，而y是上毫米上或下凹室中心中心中心的距离。 　　在俄勒冈健康与科学大学的轨道肿瘤中获得了两个人类视网膜样品（男性，51岁和72岁）。两种情况下均未发现视网膜病理。在调查人员收到之前，将所有样品取消识别，因此，俄勒冈州健康与科学大学的机构审查委员会认为，组织使用被视为非人类学科研究。 　　对于小鼠视网膜中的钙成像实验，我们使用C57BL/6 J（JAX菌株：000664； RRID：IMSR_JAX：000664）或Crossbred AI95（RCL-GCAMP6F）-D（JAX菌株）（JAX株：028865; rrid; rrid：imsr_jax：imsr_jax：0288888865）VGLUT2-IRES-CRE敲入小鼠（JAX菌株：028863; RRID：IMSR_JAX：028863），以在RGC中获得GCAMP6F表达的后代。在标准的12:12 h白天：夜间周期中安装小鼠。环境温度和湿度保持在20–22°C和50–60％。小鼠是性别，年龄在6-26周大。在安乐死之前，将小鼠的黑暗适应1.5小时。用异氟烷麻醉动物，并根据加利福尼亚大学伯克利分校的动物护理和使用委员会批准的宫颈脱位。然后立即将眼睛摘除，去除前眼，并分离视网膜以进行后续实验。 　　在扩展数据表1中详细介绍了本研究中使用的主要和二抗体。使用针对同一蛋白质的不同表位的抗体证实了BNC2抗体的特异性，并通过确认BNC2在inl中的vglut3+ amarcarine细胞中的选择性表达（通过INL中的vglut3+ amocarine clive）（通过the Lotate predectective the the the Transcriptiondecriptement predcentection the the Transcriptive the Transcriptive）（7）（7）。Pieces of macaque or human retina were fixed for 30–120 min in 4% paraformaldehyde (PFA) in 0.1 M phosphate buffer at ~22 °C, rinsed in PBS and stored in PBS containing 0.025% NaN3 (PBS-NaN3) at 4 °C or cryoprotected in graded sucrose solutions and frozen at −20 °C until use.在PBS洗涤后，将视网膜在1％的牛血清白蛋白（BSA； Sigma A7030），150 mM MaleImide（Sigma 129585）中阻塞1小时。将初级抗体在3％的正常马血清（NHS），1％Triton X-100、0.025％NAN3中稀释（pH 7.4），并在〜22°C下孵育约3天。将二抗在3％NHS中稀释，在PBS中稀释0.025％NAN3，并在22°C下过夜。在Hoechst 33342（Invitrogen 33342）中对视网膜染色20分钟，然后安装在Slowfade Gold Antifade试剂中（Invitrogen S36936）。 　　使用RNASCOPE多重荧光V2分析与免疫荧光 - 整合的共同检测工作流程（高级细胞诊断），根据制造商的说明，使用RNASCOPE多重荧光V2分析对猕猴GCL进行荧光原位杂交。简而言之，在4°C下用4％PFA固定猕猴的视网膜，用10％，20％和30％的蔗糖冷冻保护，并嵌入冷冻凝胶（Leica）中。通过GCL的平面以10 µm的厚度将外围视网膜区域的区域进行冷冻剖面。将切片在〜100°C下在共检测溶液中检索5分钟，然后与兔抗RBPMS抗体（磷酸1830-RBPMS）孵育过夜，以标记RGC。然后将切片用蛋白酶III在40°C下消化30分钟，并与猕猴BNC2（ACD 1238401-C1）和FSTL4（ACD 1238411-C2）mRNA杂交。信号分别用1：1500 TSA生动的荧光团520（ACD 323271）和1：1500 TSA生动的荧光团570（ACD 323272）进行放大并用荧光标记。最后，将切片在山羊抗兔Alexa Fluor Plus 647（1：200; Thermofisher A32733）中孵育一整夜，用DAPI对抗并安装在慢速金中。 　　在4％PFA中固定猕猴的视网膜块30分钟，在PBS中冲洗，并在4°C下储存在PBS-NAN3中，直至使用。对于预先标签，将视网膜在BNC2的原代抗体中孵化，并在含有3％NHS的PBS-NAN3中稀释的BNC2的原代抗体中孵育3天。在PBS洗涤后，将继发抗体应用于孵育缓冲液中过夜。在初级抗体孵育之前，在22°C（7个细胞中的3个）中含有0.3％Tween 20的孵育缓冲液中，将一些视网膜透化。在某些情况下，染料加载后进行聊天抗体的次要检测。预先标记的视网膜在PBS-NAN3中的Olympus BX51WI显微镜上安装在神经节细胞侧。BNC2+ RGC含有落叶，然后用尖锐的硼硅酸盐微电极刺穿，在100％乙醇中填充1％DII，并用Dodt或DIC Cortast 51,52进行红外照明。使用贴片钳放大器（HEKA EPC10）将电流脉冲（10 s）的〜+10 Na施加3-5分钟。由于预先显示的仅使用BNC2抗体，因此我们无法明确区分PRGC10和PRGC16细胞。然而，大多数BNC2+细胞是PRGC10（图1E），最强标记的BNC2+细胞在PRGC10簇内（图1D）。有时，恢复了可能代表PRGC16的分类细胞（扩展数据图8）。注射细胞后，将视网膜在PFA中固定在4°C的PFA过夜，用Hoescht抗染色，安装在Vectashield（VWR 101098-042），并在一周内成像。 　　为了重建神经元的形态，在带有Plan-Apochromat 20×/1.0 DIC水，20×/0.8空气和63×/1.4油脂目标的Zeiss LSM 880显微镜上获取共聚焦激光扫描和快速的炮弹图像。图像以每µm（20×）1.93–2.41像素为1.93–2.41像素，每µm（63×）分辨率为7.6–11.7像素，并具有最佳的轴向分辨率，以允许3D重建。Z-stacks从GCL延伸到INL，Z-STEP尺寸为20倍物镜的0.65至0.86 µm，63倍物镜的Z-Step尺寸为0.16–0.19 µm。激发激光线为DII为561 nm，Alexa-488（CHAT）为488 nm，Hoescht为405 nm，Alexa-594（BNC2）为594 nm。DII和聊天在单独的轨道中成像，以防止信号串扰。 　　对于钙成像后IMHC的共焦成像或用于摩西分析，以20×/1.0 N.A.水或20×/0.8 N.A.空气目标获取瓷砖扫描。每µm）以10％的重叠获取，并用ZEN 2软件（Zeiss）或ImageJ中的网格/集合插件缝合。图图中指示了对原始图像的所有修改。将横向中值滤波器应用于某些图像，其中指示在BNC2通道中删除非特异性信号。在这种情况下，将过滤器均匀地应用于整个图像。亮度和对比度的其他线性变化均匀地应用于ImageJ中的图像。 　　为了分析猕猴的视网膜半场，在Zeiss Axioplan 2落叶显微镜上获取图像，该显微镜具有plan Apochromat 10×/0.45 N.A.空气物镜和100 W HG弧光灯激发源。使用Axiovision软件中的Mosaix模块获取瓷砖扫描，并使用用于ImageJ的网格/收集缝合插件缝制。 　　为了进行钙成像实验，从红外照明（850 nm）下，从巩膜中分离出了带有脉络膜和视网膜色素上皮的猕猴视网膜（〜4–8 mm2）。鉴于视网膜水平中线上PRGC10的密度较高（扩展数据图3），大多数记录场来自视网膜区域，这些视网膜区域从视神经头的鼻缘延伸到远鼻腔。将样品安装在无机膜盘上（阳极盘，13毫米，孔径0.2μm，GE Whatman），并用切片锚（Warner Instruments）稳定。将视网膜定向在记录室中，以使鼻腔轴与水平视觉刺激平面近似对齐。在5-6 mL min-1的温暖（36-37°C）碳酸氢盐 - 缓冲的AMES培养基中，制剂不断地用超级融合。将样品用20×/0.95 N.A.的奥林巴斯或尼康16×/0.8 N.A.的尼康在红外照明下（850 nm）的水物浸入物镜，并带有倾斜的对比度光学。带有膜可渗透钙指示剂的花道，CAL-520 AM（离解常数（KD）= 320 nm，AAT BioQuest）或Cal-590 AM（KD = 561 nm，AAT BioQuest）。将指标溶解在含有20％Pluronic F-127（热泡P3000MP）的DMSO中，然后在HEPES缓冲或碳酸氢盐 - 缓冲AMES的培养基中稀释至终浓度为0.91 mm（pH = 7.4）。对于染料载荷，将2–5MΩ的硼硅酸盐移液器填充，并在穿透内部限制膜后，通过压力施加（〜3 psi的〜3 psi，约为10×5 s）将其施加到GCL上。染料加载后至少45分钟开始记录。在某些情况下，将磺胺素101（0.8 µm； Sigma S7635）添加到AMES培养基中，并灌注15分钟，然后开始记录以可视化脉管系统。 　　在红外照明下从视网膜色素上皮上解剖小鼠视网膜，并与猕猴相似。在0.7-1毫米视神经内的背面半肌区域用于最大程度地减少DS Tuning29中的地形差异。如上所述，立即对VGLUT2-GCAMP6F小鼠（n = 2）成像，而野生型小鼠视网膜则用Cal-590 AM加载，并在浓料加载后〜1小时开始记录。 　　使用修饰的Scientifica MP-2000多光子显微镜和修饰的超镜多光子显微镜（Scientifica）进行两光子钙成像，该钙具有锁定的Ti-Sapphire激光器（Scientifica），并调谐到930或1040 nm（Chameleon Ultra II; Comeleon ultra II; Coolent; Coolent; Coolent; Coolent; Coolent）。调整激光强度，以使最小功率可视化负载的细胞（范围为9-21 mW，为1,040 nm，为930 nm的6-25 mW）。可以在https://github.com/llamero/puthussery_lab_2p_setup上找到两个显微镜系统的开源CAD型号，零件列表和滤镜光谱。 　　两光子发射灯通过二分色镜（FF552-DI02，Semrock）拆分为红色（FF01-590/36，Semrock）和绿色（FF01-510/42，Semrock）检测通道。扫描场是256×256像素或128×128像素（220×220 µm），以2.67 Hz或10.67 Hz的帧速率获取。使用Sciscan获取软件（V1.3，Scientifica）获取图像。 　　用伽马校正的LG LP097QX1 TFT-LCD视网膜显示器（2,048×1,536）（Adafruit Industries）产生视觉刺激，该显示器通过20倍目标投射到视网膜上。显示屏的RGB输出经过三重带滤波器（FF01-466/555/687-25，Semrock），以将RGB视觉刺激带与光电峰型检测通道分开。 　　两光子发射光通过二分色镜（FF552-DI02，semrock）拆分为红色（FF01-590/36，Semrock）和绿色（FF01-515/30，Semrock）检测通道。扫描场是512×512像素（246.71×246.71 µm），以30 Hz的帧速率获取。使用Scanimage Basic V2021.01.0（MBF Biosciences）获取图像。 　　视觉刺激是用纤维耦合的DLP LightCrafter 4500（EKB技术）生成的，该刺激通过16倍物镜投射到视网膜上。RGB照明分别使用XLAMP XP-E2红色，凉爽和蓝色LED生成（Creeled）。LED灯通过带通滤波器（FF01-640/20，Semrock，ET550/20×，Chroma，FF01-465/30，Semrock）传递，以将RGB视觉刺激带与光电峰型检测通道分开。LED照明通过开源可编程LED驱动器（https://github.com/llamero/four_channel_mhz_led_driver）控制。具体而言，只有在共振镜的回弹中进行LED照明才能避免在LED引起的样品激发和两光子成像之间进行串扰，并将LED通道同步到DLP RGB输出信号。 　　使用Igor Pro 9.0和Psychopy Toolbox（V2022.2.0或更早）编写的自定义软件生成光刺激。鲜亮的棒（500 µm s-1，200×750μm或500×750μm； 1.47×105光子S-1μm-2 mp-2000，2.083×106光子S-1μm-2超镜）在黑暗的背景上（4.47×103 Photons S-000）3.63×104光子S -1μm -2高度镜），并以500 µm s -1的速度向杆的长轴漂移到杆的长轴上（使用参考文献53的每度223 µm的转换系数为每秒2.24度，相当于每秒的2.24度）。所有角度均表示视网膜上刺激运动的方向。总刺激面积为750 µm2（MP-2000）或1,000 µm2（高度）。杆方向顺序在块中进行伪态度，以便在重复之前呈现所有方向，并且在杆刺激之间存在5 s的刺激间隔。将细胞的子集集中在扫描场中，并用明亮的条（500×750μm）探测在首选和无效方向上以一系列速度（125-2,000μms -1，0.57-9度）移动。还用直径增加（25–750μm）的明亮斑点刺激了一个中心细胞。我们允许从激光发作到第一个刺激呈现35 s，以进行激光和背景适应54。翻译晶状体用于将视觉刺激从成像平面轴向偏移〜200 µm（用于猕猴）或〜150 µm（对于小鼠），因此视觉刺激集中在光感受器上，同时获得GCL的两光子扫描。对于某些刺激方案，收集记录，没有激光刺激，以降低到达检测器的任何残留刺激光的背景减法（仅MP-2000记录）。 　　小鼠的成像程序为猕猴，除了漂移的杆刺激为500×750 µm，以250 µm s-1（每秒8度）55处漂移，这种速度刺激了类型和Off-Off-Off-Off-Off-On-Off-On-Off-On-Off-type DSGC在鼠标Retina 29,34,34,56,56,56,57中。 　　在某些实验中，将GABAA受体拮抗剂Gabazine（SR95531; Hellobio HB0901）添加到浴溶液中（5个细胞的最终浓度为10μMGabazine，1个细胞为20μM）。在H2O中制备储备溶液，并在-20°C下储存直至使用。对于药理学实验，首先通过基于像素的矢量和映射在线鉴定候选dSGC，并以扫描场为中心。然后在基线时记录钙反应，并在吸毒后至少4分钟记录钙反应，以确保效果达到稳态。 　　为了进行转录组分析，我们从Macaque（GEO登录GSE11848014），Human（GEO GIENESION GSE14807741）和鼠标（GEO GEGE GIGSION GSE13740025）挖掘了现有的单细胞RNA-revoring数据集。细胞群集分配是原始出版物中报告的。使用Broad Institute单细胞门户（https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell）生成点图可视化，其中DOT大小表明群集中细胞的比例表示基因和点颜色表示每行相对基因表达水平。为了识别候选者ON-DSGC类型，我们比较了每种外围RGC类型及其相应的Foveal RGC类型之间GABRA2和GLRA2的表达。如果gabra2和/或glra2的表达差为2 log折叠和p，则将细胞类型排除在外。< 0.05 by Wilcoxon rank-sum test. 　　Cell somata ROIs of Cal-520 AM- or Cal-590 AM-loaded cells, or GCaMP6f-expressing cells were manually drawn in ImageJ and the average intensity of the ROI over time was extracted for each cell. As detailed above, for some retinas, a no-laser control recording was taken to subtract any low-level stimulus bleedthrough reaching the detectors. For experiments without the no-laser control, a ‘background ROI’ was drawn in an area containing a blood vessel, with no calcium indicator present, and subtracted from the raw recording. 　　Raw fluorescence intensity values were imported into Igor Pro (version 9.0.0.10, Wavemetrics) and ΔF/F values were calculated for each cell using the following equation: 　　where F is instantaneous fluorescence and F0 is the mean fluorescence over a 23-s window prior to stimulus onset. For some ROIs where there was a slow background oscillation, a high pass filter was applied to restore the baseline. For analysis of responses to drifting bar stimuli, we extracted the time windows when visual stimuli were presented, sorted the directions and averaged the maximum ΔF/F amplitudes from three trials. The extent of direction selectivity was reported as either the normalized vector sum where the magnitude of the vector sum was divided by the scalar sum of responses to all of the recorded directions (Fig. 2f,g), or in the case of comparison of directional tuning before and after drug application, using the following formula: 　　The DSI ranges from −1 to 1 with values closer to 1 indicating higher direction selectivity. Negative values indicate a residual response in the opposite direction to the original preferred direction, which was seen in some cells after gabazine application. Only cells that were responsive to the light stimulus, (defined as having an average amplitude >分析中包括1.5基线S.D.）。通过手动检查每个迹线以忽略活性与光刺激无关的痕迹来确认响应细胞。调整了首选角度，以使上，时间，下和鼻腔分别对应于90、0、270和180度。钙反应与von mises分布拟合（图2和图3中的极性图以及扩展数据图5），这是高斯分布的圆形类似物，由以下方式给出： 　　其中r max是最大响应，μ是优选方向，κ是调谐曲线的宽度。 　　为了量化以不同速度移动的条刺激过程中的钙反应，我们在首选方向响应期间测量了0.5 s窗口上的最大ΔF/f振幅。为了量化对不同点大小的响应，我们在2-S点刺激过程中测量了ΔF/F的积分。对于鼠标数据，使用自定义Python代码（Google Colaboratory）生成了组极图和直方图（扩展数据图5E，F）。 　　扫描字段中的潜在DSGC通过基于像素的矢量总和映射使用ImageJ中的自定义宏来识别。简而言之，首先将XYT系列转换为ΔF/F电影，并以2个Sigma值为2的高斯过滤。提取了与每个条呈现周期相对应的替换，并进行了Z-projection（最大值）。然后计算图像中每个像素的响应矢量的X和Y分量，并将每个角度的响应平均。使用热图可视化来识别显示最高矢量总和值的扫描场中的像素。 　　免疫染色后，我们获得了用于钙成像的视网膜碎片的落荧光图像。通过匹配血管里标和XY阶段参考坐标来鉴定钙成像区域。然后获取并缝合了两个P扫描区域的共聚焦Z-Projections。使用自定义宏（ImageJ（1.53Q，NIH）中的bunwarpj 2.6.12插件）将共聚焦图像注册到每个2 p成像字段。对于注册，我们对2 P扫描场进行了平均z练习，并提高了分辨率以匹配共聚焦图像。为了识别BNC2+和FOXP2+细胞，我们将强度阈值设置为2×背景荧光。然后手动检查所有扫描场，以确保检测所有免疫染色的核。 　　使用Simple神经突示踪剂（SNT）4.1.9插件从共聚焦图像堆栈中追溯了充满DII填充细胞的形态。使用A*搜索算法启用了半自动跟踪。为了填充骨架的单元格，手动调整距离阈值设置以最佳匹配共聚焦图像。SOMAS被追踪并分别填充，并且在共聚焦图像中的过度饱和情况下，它们的大小受到限制。在某些情况下，由于体暴露过度暴露，将主要树突与躯体连接不可见，因此使用最短路径将路径推断。通过将堆栈分为两层（GCL到碎片边框，然后在碎片上为INL），可以进行追踪和填充细胞的深度编码。还检查了每个单元格以确定每层树突的分类，并手动调整以反映原始图像。将细胞痕迹的图像抬高采样（双孔插值），以改善可视化。 　　为了确定DII填充细胞的IPL分层深度，Z轴强度曲线图是从成像为63倍的树突状植物区域（Airyscan）产生的。对于每个细胞，选择了1或2个区域，面积从745μm²到17,375μm²。IPL边界是通过Hoescht染色或使用聊天Somas的位置来识别的。减去平均背景荧光值，并将值标准化为最大荧光。负值设置为0。将总IPL深度（平均32.8±4.3μm）从0转换为0至100％的百分比值（其中0是INL边框和100％GCL边框）。 　　DII细胞填充和聊天标记之间的共临时程度是从完整细胞填充物的20倍图像中估计的。DII通道包含了细胞的追踪和填充的二进制面具，并且原始聊天通道被中间过滤和阈值。DII通道用于掩盖聊天通道，以确定图像堆栈中每个切片的重叠接触区域。根据图像将重叠区域求和为DII总面积的百分比。在正常方向上使用聊天通道测量接触区域，并在旋转有关Z轴的聊天频道后，缩短了90度。 　　在Imaris 9.8.2（牛津仪器）中渲染完整的DII填充细胞，并使用SNT中的手动调节阈值追踪并填充细胞（请参阅“追踪DII填充细胞”）。Imaris从63×kiryscan图像堆栈中启用了“环绕式”突触。首先通过缩放像素的高度和宽度以匹配体素深度，将图像在ImageJ中首先制成。对于完整的DII单元和包裹的突触，使用默认的表面设置和手动调节阈值在Imaris中表面呈现通道。选择了DII树突的裁剪区域，并过滤聊天表面，以仅包括DII树突中1μm之内的聊天表面。 　　我们将BNC2+ RGC分类为从不同动物的四个视网膜中取出的猕猴GCL的瓷砖扫描Z-stacks。视网膜碎片来自视神经头和远鼻周围之间的外围鼻视网膜（鼻等效偏心率〜3.5–8.5毫米，平均总RGC密度为1,251±217个细胞，每mm2）。扫描场以1.6–2.41像素µm-1的XY分辨率获取，并以10％重叠的瓷砖扫描。用于分析的缝合图像区域平均为8.44±5.16 mm2。对图像堆栈进行2D过滤，以减少像素噪声并提高标记的核的可见性以进行随后的分割。手动分割BNC2+ RBPMS+细胞的核，并通过其他观察者检查准确性。然后提取强度测量值的BNC2+和FOXP2+通道，并进行Z得分，以允许对在不同日期进行处理或成像的样品进行比较。FOXP2+细胞根据z得分阈值强度值进行分类，该阈值强度值对手动分类进行了交叉检查。使用K-均值聚类独立确认细胞簇，该聚类在Igor Pro 9中实现。 　　为了进行细胞密度分析，根据RBPMS染色，使用半自动化方法对RGC进行了分割。简而言之，应用了2D或3D高斯模糊滤波器，使用自动粒子分析检测到阈值并检测到感兴趣的对象。或者，通过应用高斯滤波器，然后在ImageJ中使用FIND MAXIMA函数来计数RGC。进行分割的手动校正以纠正假阳性或假阴性细分。对于空间细胞密度图，将图像分为500×500 µm平方采样区域。在图像焦点较差或组织受损或遮盖的采样区域中，通过平均周围区域来估计细胞计数。覆盖率因子由细胞的空间密度（每MM2）乘以该细胞类型的树突状场面积（每个细胞MM2）。覆盖率为1.0表示完整的瓷砖，在Arbours或Arbor重叠之间没有空间。较高的覆盖范围因素表明树突状arb的重叠更大。 　　与上述的相同区域进行了镶嵌分析。使用内置ImageJ函数（http://biii.eu/voronoi-imagej），使用自定义宏来测量每个单元格的Voronoi域区域。Voronoi域的规律性指数（VDRI）用于评估镶嵌性规律性，并由平均Voronoi域面积除以标准偏差给出。将实际VDRI与来自相同密度的细胞随机模拟的VDRI进行了比较。VDRI值为1.9，较低表示点的随机阵列26。与图像边界相交的Voronoi结构域被排除在分析之外。每个视网膜的平均VDRI是在跨动物平均之前计算的。如前所述58确定密度恢复曲线（DRP），并使用R（sjedrp v0.12，https：//github.com/sje30/sjedrp/sjedrp/blob/master/master/description; stephen eglen）中的SJEDRP软件包实现。PRGC10和PRGC16质心的坐标用于使用20 µm增量的0-1,000 µm的半径来计算DRP。将每个视网膜的DRP轮廓汇总并在X轴上镜像，以更好地观察“良好的”排除区27。还针对随机模拟计算了DRP。为了计算近似收敛，“井”的底部（平均3个最低垃圾箱）被视为平均密度的百分比，占390-1,000 µm（密度谱的高原）。由于与最内向的Annulus59较小面积相关的可变性升高，因此排除了第一个垃圾箱的数据。 　　我们在一个猕猴视网膜（上鼻腔，鼻等效偏心度〜7.4 mm）的水平截面中鉴定了BNC2+ FSTL4+ RGC。用平面物的20×/0.8空气物镜以每µm的1.93像素分辨率获得16位共聚焦瓷砖扫描堆栈。为了进行分析，对大约1.2 mm2的面积进行了z射击（总和切片）。使用上述半自动化方法从RBPMS染色中分割RGC。使用ACD指南（SOP-45-006，ACD）对每个细胞的点数进行定量。简而言之，从没有细胞的区域确定每个荧光团的平均背景强度。这与阴性对照背景水平相当。每个点的平均强度由平均至少21个单点确定。然后，通过此公式确定DOT的数量： 　　在排除了血管或高细胞背景等人工伪像之后，如果细胞有40多个点和FSTL4+，则将其视为BNC2+，如果它们有80个以上的点。 　　图和文本中的所有数据均表示为平均值±S.D。除非另有说明，否则中位数和四分位间范围。由于数据的非正态分布（由Shapiro-Wilks测试确定）或样本量很小时，使用了非参数测试。为了比较独立样品，使用了Wilcoxon秩和测试。为了配对比较，使用了Wilcoxon签名的等级测试。所有测试均为双面，并且使用了0.05的α水平，除非进行了多次比较。没有使用方法来确定样本量先验。在这项研究中未分配实验组。数据采集​​和分析没有对实验条件视而不见，因为大多数实验不涉及治疗或扰动，并且分析是自动化的。对于框图，使用Tukey方法计算四分位间范围。在显示代表性显微照片的情况下，在多个视网膜中复制了实验，如下所示：图1b（n = 9个视网膜），图2a（n = 6个视网膜），图3a，b（n = 3视网膜），图3e（n = 3视网膜），图4b（n = 2 retinas），图4B（n = 2 entenas），图5 rested数据（n = 4 AA）。（n = 3个视网膜），扩展数据图6a，b（n = 6个视网膜，如图2所示），扩展数据图7a，b，d – f（n = 2视网膜）和扩展数据图8（来自2个视网膜的n = 4个细胞）。来自单个视网膜的显微照片显示在扩展数据中图2D，e。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。