皮质面积的地图集鉴定了动态分子特征

　　在严格遵守法律和机构伦理法规的情况下，在先前同意的情况下收集了取消识别的组织样本。协议获得了加利福尼亚大学旧金山分校的人配子，胚胎和干细胞研究委员会（机构审查委员会）的批准。两组样本包括双胞胎：GW20_31和GW20_34；GW22和GW22T。 　　关于主要硫的立体镜，在识别皮质区域的立体镜下进行脑解剖。值得注意的是，所有解剖均由相同的个体（T.J.N.）进行，以实现样品之间的可重复性和比较。将组织在4 mL的木瓜蛋白酶/DNase溶液（沃辛顿）在37°C下孵育20分钟，然后用玻璃移液管小心地对其进行三杆，并通过40 µm的细胞过滤器过滤并用HBS洗涤。GW22和GW25样品还通过卵球形梯度（沃辛顿），以最大程度地减少捕获中的髓磷脂碎屑。根据制造商的说明，将最终的单细胞悬架加载到基于液滴的基于液滴的图书馆准备平台铬（10X基因组学）上。版本2用于除GW19_2，GW16和GW18_2以外的所有样品，用于其中3版3版。使用Agilent 2100生物分析仪对cDNA文库进行定量，并用Illumina Novaseq S4进行测序。 　　我们使用高度严格的质量控制（QC）指标对单元进行了过滤。简而言之，我们使用R封装scrublet29为每个单独的捕获巷丢弃了潜在的双线，然后每个细胞中至少需要750个基因，并以高含量（> 10％）的线粒体基因含量去除细胞。这些严格的质量控制指标可保留下游分析的细胞的40％，并且对特定大脑结构或细胞类型的数据进行重新分析可能会受益于质量不太严格的QC，以进行附加发现。我们的目标是获得具有高验证率的干净人群，以更好地理解面部化签名。通过所有阈值的〜700,000个细胞用于下游分析。 　　我们使用递归聚类工作流程来了解数据集中存在的单元格类型。为了最大程度地减少潜在的批处理效应并提高潜在稀有细胞群体的检测敏感性，我们首先对每个样本进行了Louvain -Jaccard聚类。在初始的细胞类型分类之后，我们将所有属于细胞类型的细胞群群群群簇生成了最刺眼的细胞亚型。然后，我们根据所有标记基因中的基因得分之间的个体之间的亚型相关联，以弥合所有批次效应，并在所有个体和细胞类型中迭代合并簇。在这项研究中，我们曾经将所有个体的单个细胞类型中的簇组合在一起，并再次与所有个体和细胞类型的所有簇相结合，从而产生了两种迭代组合。每个步骤的注释都保留在补充表中，以在管道中的任何时刻进行重建。 　　群集层次结构是从矩阵将所有簇相关联的矩阵使用Pearson在所有组中所有标记基因的基因得分空间中的相关性。分层聚类在Morpheus（https://software.broadinstitute.org/morpheus）中执行所有行和列，并使用一个减去距离度量的Pearson相关性。 　　为了可视化和量化细胞类型，细胞类型子插图或细胞类型区域组之间的全局关系和连接性，我们实现了参考文献中所述的星座图。1，通过调整在https://github.com/alleninstitute/scrattch.hicat/上提供的代码。简而言之，我们将每组细胞表示为一个节点，其大小与其中包含的细胞数量成正比。每个节点位于其细胞UMAP坐标的质心上。边缘代表节点之间的关系，并通过在主成分分析空间（主要成分1:50）中获得每个单元格的15个最近的邻居来计算，然后在每个群集上确定属于不同群集的邻居的分数。如果> 5％的最近邻居属于至少一个群集中，则在2个节点之间绘制边缘。在节点处的边缘的宽度与属于相反节点的最近邻居的比例成正比，并且在所有群集上的最大分数表示为100％的边缘宽度，等于节点宽度。本文相关的GitHub存储库中的函数buildStellationPlot中描述了此分析的完整代码适应和实现。 　　使用上述输入值的摘要来量化星座图。对于每种单元格类型或区域连接，将两组之间的边缘数乘以满足组内连接阈值的平均分数。结果数称为连接索引。 　　使用R封装WGCNA30计算许多基因集的模块特征根。使用功能模量函数为组中的每组最多10,000个从组随机子集细胞生成得分，根据细胞子集中表达的基因集和基因的相交计算得分。对于区域特异性特异性特征，如上所述进行差异表达，并使用所有区域的晚期神经元的基因特征来计算径向神经胶质和IPC种群的模块特征元。 　　将来自每个亚集群或皮质区域的细胞的表达谱与所有其他细胞的表达曲线使用函数findallmarkers在r套件Seurat中实现的差差基因表达进行比较，并根据调整后的PVALUE缩短为0.05。调整后的P值基于Bonferroni校正，使用数据集中的所有功能。我们针对每种细胞类型和每个个体分别执行了此步骤，因为我们观察到基因特异性在整个发育过程中都是高度动态的。然后，我们结合了每个细胞类型和区域的单个基因列表，并注释了每个基因似乎是特定的阶段。我们将个人分为三个阶段：早期（GW14，GW16和GW17），中间（GW18，GW19和GW20）和晚期（GW22和GW25）。我们通过计算其基因评分来对基因进行排名，我们将其定义为基因的平均对数折叠变化×富集率的结果，而基因的平均对数倍数变化×富集率则定义为在兴趣群中表达基因的细胞百分比除以在所有细胞中表达的细胞的百分比。用于可视化细胞类型和/或皮质区域的不同标记基因表达的点图是在我们的代码存储库中可用的自定义函数makedotplot的，该功能使用Seurat函数dotplot。简而言之，对于每个基因，使用基本R函数尺度（），缩放了每个组的所有非零细胞（皮质区域）的平均表达值，从而得出z分数。进行缩放是为了使基因在同一颜色尺度上的截然不同的表达范围内可视化。 　　如上所述获得的面积丰富的标记基因在31中所述的1,632个人转录因子的综合列表中进行了注释，并从转录因子数据库Animaltfdb332下载，可从http://bioinfo.hust.hust.hust.hust.edu.edu.cn/static/static/static/animaltfdb3/nimaltfdb3/lonlantlloand/fload/flost下载。 　　为了量化不同细胞类型，皮质区域和/或发育阶段分子特征的（DIS）相似性的程度，我们在每个阶段计算了所有细胞类型和区域特异性基因标记的重叠，并使用SANKEY图可视化这些比较，并使用Sankey图中的功能GGSANKEY从GGVIS R套装中进行了比较。然后，我们通过根据共享基因的比例来计算其欧几里得距离来计算其与其他节点共享的每个节点的基因比例，并通过计算其欧几里得距离进行群组群体。用于构建重叠矩阵，创建图并量化结果的代码在我们的github存储库中的buildsankey和buildHeatMap中描述。 　　使用Python 3包速度v0.1722和Scvelo V0.2.223计算速度估计。读取聚类后通过质量控制的读数被用作速度命令行实现的输入。从UCSC基因组浏览器中检索了人类表达的重复注释文件。使用的基因组注释文件由Cellranger提供。输出织机文件已合并并在Scvelo中用于估计速度。对于皮质分析，细胞进行了随机次采样（分数= 0.5），并根据以下参数进行过滤：最低总数= 200，最小剪接计数= 20，最小无序列计数= 10。最终处理的对象产生了一种新的UMI计数基因，该基因使用了195,95,775细胞的18,975细胞，该embix intrix intrix intrix intrix intrix intrix intrix intrix intrife asting titer titer，该物体估计了VEL，该物体用于velcoth，该物体使用了VEL，即VEL，即VEL，即Velcoth the vel con模型。使用降低尺寸的UMAP可视化嵌入。速度基因通过皮质区域匹配，并使用SCVELO中的等级速度基因的功能估算。上面描述的转录数据数据的计算分析使用R 4.024和Python 3，R套件Seurat（版本2和版本3和版本3）25,26，GoogleVis27，dplyrr和dplyr和ggplot228，python套件，python套件速度velocyto v0.1722和scvelo v0.2.2222222223.2.223 and ustuct。我们可重现的代码可在与此手稿相关的GITHUB存储库中获得。 　　首先通过识别数据集中有用的单元格类型标记来选择用于验证的标记基因。选择SOX2标记径向胶质细胞，选择EOMES标记IPC，并选择BCL11B和SATB2以标记具有先前验证的不断变化的共表达模式的标记兴奋性神经元种群。POLR2A被用作该技术的阳性对照。其余基因是根据其作为感兴趣的兴奋性神经元簇的特定标记基因的地位选择的。 　　如上所述，从原代组织中阐述了空间转录组的样品。按照OSMFISH协议中描述的协议33中所述的协议，将样品在OCT中闪烁。然后将样品安装到APS涂层的盖玻片上，并在4％PFA中固定10分钟。然后将样品用PBS洗涤，然后处理以进行空间分析。使用自动化的ESPER ESPER空间上的OMICS平台（Rebus Biosystems）进行了空间分辨的，多路复用的原位RNA检测和分析。该系统集成了合成光圈光学（SAO）显微镜34，流体和图像处理软件，并与Smfish化学结合使用。自动检测到来自靶基因的单个转录物，对单个细胞进行自动检测，计数和分配，从而生成一个单个单个单元的基因表达和空间位置数据的单元×特征矩阵以及如下的注册成像数据。 　　Rebus Biosystems专有软件用于设计每个基因的主要目标探针（22-96个寡核苷酸）和相应的独特读取探针（分配和标记为Atto染料）。寡核苷酸是从集成的DNA技术购买的，并在TE缓冲液中重悬于100 µm。盖玻片（24 x 60毫米，第1.5号，目录（Cat。）编号1152460，Azer Scientific）被功能化，如先前发布的33。切成新鲜冷冻的脑组织切片（10 µm），在冷冻仪上切割，安装在处理的盖板上，并在PBS中用4％多聚甲醛（Alfa Aesar，Alfa Aesar，Alfa Aesar，Catalog No。）固定10分钟，在室温下在PBS上用PBS冲洗两次，在室温下用PBS RIN，并在40％乙醇中储存在4°乙醇中。将盖玻片上的样品部分组装到流中，然后将其加载到仪器上。杂交周期和成像是在仪器控制软件下自动完成的。简而言之，所有靶基因的主要探针最初均杂交6小时，并将未特异性结合的探针洗掉。Readout probes labelled with Atto532, Atto594 and Atto647N dyes for the first 3 genes were then hybridized, washed, counterstained with DAPI and then imaged with an Andor sCMOS camera (Zyla 4.2 Plus, Oxford Instruments) through a 20×, 0.45 NA dry lens (CFI S Plan Fluor ELWD, Nikon) with a 365-nm LED for DAPI and532 nm，595-nm和647 nm激光器配置为SAO成像。在感兴趣区域内为每个通道（ROI）内对多个视野（FOV）成像。每个FOV都采集了具有2.8 µm景深的单个Z-planes。成像后，将前三个读取探针剥离，然后将接下来三个基因的读数探针杂交，成像和剥离。重复此过程，直到所有基因完成读数为止。 　　使用Rebus Esper图像处理软件，重建了原始图像以生成高分辨率图像（相当于或比使用100×油浸入透镜获得的图像）。自动检测到RNA斑点，以生成包含XY位置和信号强度的高保真RNA斑点表。基于Stardist35的核分割软件通过从DAPI图像中找到核边界来识别单个细胞。然后使用最大距离阈值将检测到的RNA斑点分配给每个单元。所得的细胞×特征矩阵包含每个细胞的基因计数以及细胞位置和核大小的注释。 　　核密度估计图是从空间转录组学管道中检索到的单个基因斑点位置图中创建的。它们是使用带有阴影和CMAP着色的Python中的Seaborn Kdeplot功能创建的。它们使用50％的不透明度将它们与Adobe Illustrator覆盖和变暗的特征合并在一起。 　　使用单元格×特征矩阵，我们消除了信号计数少于十个计数的所有斑点。然后，Pearson的相关性在每个数据集中的基因上进行，并进行过滤以进行自相关。从分析中删除了阳性对照（POL2RA）和非激发神经元细胞类型标记（SOX2，EOMES和DLX6）。使用强制定向的生物划分保留了0.05或更多的相互作用，并用Cytoscape v3.8.2可视化。单个节点在图4B中的合并图像文件中通过其颜色颜色。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。