安慰剂疼痛缓解的神经电路基础

　　所有程序均根据斯坦福大学行政动物护理（APLAC）批准的动物护理指南，由北卡罗来纳大学教堂山大学和国际痛苦研究协会的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。在温度控制的环境中，在12 h – 12 h的光线周期下，将小鼠最多容纳5只小鼠，并保持在12 h – 12 h的光周期循环，并随意进入食物和水。年龄范围为8-12周的雄性或雌性小鼠用于实验。C57BL/6野生型（000664），TRAP2（Foscreert2，030323）和PVALBCRE（017320）小鼠购自杰克逊实验室。使用标准基因靶向程序在斯坦福转基因研究中心生成OPRD1CRE小鼠。简而言之，通过同源重组，在OPRD1终止密码子之后立即引入了IRES-CRE盒。将靶构建体电穿孔到129SV/SVJ衍生的ES细胞中后，使用远距离PCR和Southern印迹筛选了耐新霉素ES细胞菌落的IRES-CRE插入。然后进行FLP转染以去除FRT频率的新霉素耐药基因。然后将确认的新霉素溶出的菌落注入C57BL/6胚泡中，以产生嵌合雄性，这些嵌合雄性被饲养到C57BL/6雌性中，以产生创始人。使用功率分析（“ PWR” R软件包）确定了小鼠行为和电生理实验的样本量。具体而言，使用了“ pwr.t.test”函数，其显着性水平为0.05，功率为0.80，并且使用类似方法估算了试验实验和/或以前的研究估算的效应大小。对于组织学实验，通过随机选择包含感兴趣区域的大脑切片来分配样品。对于所有其他实验， 样品和动物被随机分组​​。在所有小鼠行为实验之前和期间，实验者对实验组视而不见。两名独立研究人员使用两所大学的两个不同分析管道分析了钙成像数据。 　　4-OHT（H6278，Sigma-Aldrich）是在绝对乙醇和Kolliphor EL（C5135，Sigma-Aldrich）中制备的，并进行了腹膜内（每公斤50 mg）。纳洛酮（N7758，Sigma-Aldrich）在盐水中制备并腹膜内施用（每公斤5 mg）。 　　为了在RACC→PN投影神经元中表达GCAMP7F60用于Ca2+成像，我们颅内注射了400 nl RAAV2-RETRO-HSYN-CRE-WPRE-HGH（1055553-AAVRG; ADDGRG; ADDRG; TITRE; TITRE; TITRE：7×1012病毒基因组（VG）per sopor in Ml pers op pn art prigine op pn，−4.0 mm, mediolateral (ML): +0.4 mm, dorsoventral (DV): −5.4/−5.8 mm and 400 nl of AAV1-syn-FLEX-jGCaMP7f-WPRE (104492-AAV1; Addgene; titre: 1 × 1013 vg per ml) into the right ACC (AP: +0.75 mm, ML:+0.5毫米，DV：-1.75毫米）。为了在ACC IT神经元中表达GCAMP6，我们将400 nl aavretro-ef1a-flpo（55637-aavrg; addgene; addgene; titre：2.2×1013 vg每毫升VG）注入左侧背纹状体中，坐标为ap：+0.2 mm，mm，mm，mm：-2.0MMMMMMMM，AAV8-EF1A-FDIO-GCAMP6S（105714-AAV8; ADDGENE; TITRE：1.8×1013 VG每毫升）进入右ACC。为了在小脑Purkinje细胞中表达GCAMP8M进行Ca2+成像，我们在颅内注射了200 nl的AAV1-CAMKIIA-JGCAMP8M（176751-AAV1; ADDGENE; ADDGENE; TITRE; TITRE：1.8×1013 VG vg lobule vi coilmis ap coilmis ap ap ap ap ap ap ap ap ap：s：mm 7.7.7.7.7.7.7.6+0.0毫米，DV：-360和-200 µm。 　　为了追踪PAC期间RACC神经元的输出，我们颅内注射了400 nl的AAV-DJ-HSYN-FLEX-MGFP-2A-SYNAPTOPHYSIN-MRUBY（Stanford Virus Core; Titre; Titre; Titre：1.2×1013 VG vg coscreert2）apc of trap2（foscreert2）miCe ape apce apc： +0.777.77。+0.5毫米，DV：-1.75毫米。 　　为了在光遗传学上操纵RACC→PN途径的活性，我们在颅内注射了400 nl的AAV5-HSYN-ENPHR-EYFP（UNC向量核心；滴度：4.4×1012 VG每毫升）或AAV5-HSYN-CHR2-CHR2-EYFP（UNC cORE; acccector; acccect; acccect; acc; acc; titre; titre; titre;400 nl aav5-ef1a-dio-enphr-eyfp（unc vector core; titre：4.5×1012 vg每毫升）进入OPRD1CRE小鼠的Pn中。 　　为了在光遗传学上操纵从RACC神经元接收单突触输入的OPRD1+ PN神经元的活性，我们在OPRD1CRE小鼠中颅内注射了400 NL AAV1-EF1A-FLPO的400 NL）AAV8-NEF-CON/FON-NPHR-EYFP（137152-AAV8; ADDGENE; TITRE：2.6×1013）双侧分配给PN。 　　为了追踪ACC和二级运动皮层对PN的输出，我们在颅内注射了400 nl的AAV5-HSYN-EGFP（UNC矢量核心；滴度：4×1012 VG每毫升）中的ACC（AP：ap：+0.75 mm，MM，ML：+0.5 mm，dv：+0.5 mm，dv：-1.75 mm）和400 nllRAAV5-HSYN-CHRIMSONR-TDT（UNC矢量核心；滴度：4.6×1012 VG每毫升）进入次级电动机皮层（AP：+1.41 mm，ML：+0.75 mm：+0.75 mm，dv：-1.5 mm）。 　　为了标记RACC→PN神经元进行电生理记录，我们颅内注射了400 NL的Aavretro-CAG-TDTOMATO（59462-AAVRG; TITRE; TITRE; TITRE：1.2×1012 VG vg titre：1.2×1012 VG）在上面列出的坐标的右PN中。为了测量PV+中间神经元对RACC→PN神经元的喂养抑制，除了注射到PN中的Aavretro-CAG-TDTOMATO病毒外，我们还注入了400 NL AAV5-DIO-DIO-DIO-EF1A-EF1A-CHR2-CHR2-EYFP（UNC core; UNC core; titre; titce+ pr+ chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr 2 　　为了追踪从ACC接收输入的PN神经元的输出，我们将300 nl的跨性别性病毒AAV1-HSYN-CRE-WPRE-HGH（Addgene; titre; Titre：1×1013 Vg）注入ACC61中病毒核心；每毫升1.2×1013 Vg）。ACC和PN注射的坐标与CA2+成像实验相同。 　　为了追踪与OPRD1+ PN神经元形成单突触连接的大脑区域，我们将AAV助手病毒AAV-FLEX-FLEX-TVA-MKATE和AAV-FLEX-G注射到OPRD1CRE小鼠的PN中。然后，3周后，将重组狂犬病病毒（RVDG）注入PN。接下来，在注射狂犬病病毒后1周，收集了大脑。 　　病毒的标记效率受多种因素相互作用的控制，包括病毒的血清型和滴度，选定的启动子和靶向细胞类型。因此，本研究中使用的病毒的标记效率不能始终如一地量化。 　　所有手术均在无菌条件下进行。使用异氟烷（07-893-8441，帕特森兽医）对动物进行麻醉。在腔室中用4％异氟烷诱导麻醉后，将动物转移到小动物的数字立体定位仪器（David KOPF仪器）中，并使用2％的异氟烷​​进行了麻醉。使用校准的微毛细管（P0549，Sigma-Aldrich）进行注射，并用P-97 MicroPotette Puller（Sutter Instruments）拉动。使用负压将病毒试剂用负压吸入管，并使用正压以约50 nl min -1的速度递送。注射后，将管子抬高约100 µm并保持静止10分钟，以扩散病毒，然后以0.05 mm s -1的速率缓慢撤回。手术后，将小鼠转移到温暖的腔室中，直到完全恢复为止，然后将其返回到他们的家笼子。 　　如先前所述56,61，在ACC中植入了微观镜植入。简而言之，我们立体定义在病毒注射后1周对不锈钢套管植入。该套管用18克304 s/s的皮下管制成，定制为4.3毫米（Ziggy的管子和电线）的碎片，并以直径为2毫米的Schott Glass与0.1毫米厚的Schott Glass（TTL）连接，并使用光学粘合剂（Norland Optical Offive）（Norland Optical Offive＃81，Thermo＃81，Thermo hevero Scientific）。使用抛光剂磨碎多余的玻璃后，仔细存放了插管，直到进行植入手术为止。 　　对于套管植入手术，用异氟烷（4％的诱导症和2％的维持）麻醉小鼠，使用加热垫保持体温。After cranial hair removal, skin sterilization and scalp incision, we performed small craniotomies in three locations (AP: +5.10 mm, −3.56 mm, −3.56 mm; ML: −0.77mm, +2.06 mm, −3.01 mm) and then screwed three stainless steel screws (MX-000120-01SF, Component Supply Company) down to the dura of the头骨稳定植入。然后，我们使用钻头（型号EXL-M40，OSADA）和1.4毫米圆形钻头（19007-14，FST）进行了第四次颅骨切开术。使用灭菌镊子将骨碎片和其他碎屑清除了开口。为了防止颅内压的任何增加并提高图像质量，我们以18°的角度将上覆的组织向下降低至大约DV：-1.0 mm。 　　然后将定制的套管连接到持有人（David Kopf仪器），并将其降低到AP：+0.75 mm，ML：+1.25 mm，DV：-1.8 mm，在18°。迅速清除了颅骨切开术周围的血液和其他碎屑，并应用了粘合剂水泥（S380 metabond快速粘合水泥系统，C＆B），以密封套管和头骨之间的间隙。将定制设计的激光切割头杆（18-24 G不锈钢，激光稳定）放在左后颅骨螺钉上，然后将牙齿水泥层（Lang Dental）涂在插管上，将套管和头条粘贴到头骨上。水泥干燥后（7-10分钟），我们将动物转移到加热垫上以恢复。完全恢复后，小鼠被送回他们的家笼。 　　After cranial hair removal, skin sterilization and scalp incision, we performed small craniotomies in two locations (AP: +5.10 mm, −3.56 mm; ML: +0.77 mm, −2.89 mm) and then screwed two stainless steel screws (MX-000120-01SF, Component Supply Company) down to the dura of the skull to stabilize the implantation.然后，我们在小脑VI的小叶VI上方开放了大约4毫米直径的颅骨切开术（Bregma后部7.0 mm，横向0.0 mm）。我们首先将表达GCAMP8M的病毒注射到小脑中（DV：-360至200 µm）。注射病毒后，我们用细镊子（91197-00，FST）轻轻去除硬脑膜。接下来，我们将Kwik-SIL（世界精密仪器）应用于开裂切开术的边界。然后，我们用3毫米直径的盖玻片覆盖了大脑，我们使用紫外线激活的环氧树脂（Norland光学粘合剂＃81，Thermo Fisher Scientific）在实验之前附着在5毫米直径的盖玻片下方。我们用粘合剂（S380 Metabond快速粘合水泥系统，C＆B）和牙齿水泥（Lang Dental）将5毫米直径的盖玻片固定在颅骨上。水泥干燥后（7-10分钟），我们将动物转移到加热垫上以恢复。完全恢复后，小鼠被送回他们的家笼。 　　套管植入后三周，我们在定制设计的设备上验证了醒着小鼠中的GCAMP7F/8M荧光和Ca2+活性，以避免使用任何一般的AnaeSthetics56。小鼠被夹紧（CC-1，siskiyou）头固定，并被允许在自由旋转的轮子上跑步（Innowheel，Thermo Fisher Scientific）。对于成像RACC→PN神经元，使用镊子将裸露的1.0毫米直径梯度折射率（Grin）透镜探针（1050-004598，INSCOPIX）降低到植入的套管中。将微型显微镜（NVOKE，INSCOPIX）连接到连接到X – Y和Y – Z平面的GONIOMETER（GN1，TORLABS）的支架（1050-002199，Inscopix）。持有人连接到三轴显微镜，以将微型显微镜降低到最佳焦平面。图像采集软件（NVOKE，INSCOPIX）用于以相对荧光变化（ΔF/f）的单位显示传入的图像框架，从而使CA2+活性在醒着中观察到了行为的小鼠。如果我们观察到Ca2+瞬变，我们通过安装微型显微镜底板进行进行。 　　用异氟烷（诱导量为4％，维持2％）将小鼠麻醉，并放在立体定位仪器上。用紫外线可策展的环氧树脂（Loctite光激活粘合剂，4305）固定在适当的位置。将附着的底板的微型显微镜立体定向降低，朝着咧着嘴镜头探头或盖玻片的顶部降低，直到脑组织聚焦为止。然后，我们调整了微型显微镜的方向，直到平行于Grin Lens探针的表面。然后用牙科固定底板将底板固定在头骨上。为了防止外部光在记录过程中污染视图场，外层涂有黑色指甲油（黑色Onyx NL T02，OPI）。连接底板盖（1050-004639，inscopix）后，将小鼠转移到加热垫中以恢复。然后将老鼠送回他们的家笼，然后单独安装。 　　为了在PAC期间在小鼠中执行Ca2+成像，我们使用了植入的笑镜→PN神经元或小脑Purkinje细胞的颅骨窗口和微型显微镜（NVISTA，INSCOPIX）。在使用自定义安装站进行每个行为实验之前，将微型显微镜安装在鼠标头上。使用INSCOPIX数据采集软件（IDA； INSCOPIX）以20 Hz的速率获取图像。发光二极管强度设置为1.5兆瓦，用于成像RACC→PN神经元或1 MW用于成像小脑Purkinje细胞树突。所有小鼠使用2的增益。 　　在进行细胞提取之前，我们首先使用TurboreG62运动校正算法在视频中校正了脑运动。后来，我们使用Extract63（一种鲁棒的细胞提取例程提取了感兴趣区域（ROI）的空间过滤器和稳健的时间迹线。我们根据Tanimoto的相似性在几天内匹配所得ROI，其中定义为，其中X和Y是对应于扁平的空间过滤器的向量。我们调整了与每只小鼠的Tanimoto相似性的截止，以通过视觉检查评估的最佳结果，然后使用全局细胞图重新初始化提取物。该过程允许提取物找到可能在不同日期遗漏的单元。我们对五个迭代进行了这种常规的细胞提取，整天的注册和重新定性。接下来，我们在视觉上检查了所有视频，并丢弃了虚假，重复和树突状的Rois。最后，使用与细胞相对应的经过验证的ROI，我们通过提取物进行了最终的鲁棒回归，以获得最终的痕迹。我们采取了迹线的Z分数，减去平均值并除以S.D.，以在几天内标准化痕量单位。 　　为了获得射击率的离散近似，我们首先以恒定值为阈值，以0.5×迹线的最大值选择。搜索阈值的轨迹，以找到至少彼此分开3帧的峰值点，然后在这些峰下进行二进制（扩展数据图3C）。通过与S.D.500毫秒。当我们在开始时阈值阈值并在卷积前结束时将峰进行了二进制，因此所得的触发速率不一定包含所有事件时间，但应使用大型CA2+事件的二进制版本视为离散近似。我们选择了点火速率的近似值，以符合细胞基线和/或绝对ΔF/f值的日常变化的稳健性。 　　对于每种情况，通过平均在交叉事件前2 s开始，在一个时间窗口内，在边界越过时间期间每个神经元的平均活性是通过平均z评分的神经活动（扩展数据的触发速率）计算的。我们选择了时间窗口内的平均活动，而不是进行神经活动的点估计。这种选择是由于我们渴望减轻行为视频交叉时间的测量错误，并在短时间内对神经代码的精细结构保持不可知，因为我们的兴趣是在PAC的每个阶段，在交叉和交叉期间，神经人群的反应是否有所不同，对应于疼痛的预期水平是否有所不同。为了确定单个细胞的神经反应在第一次过境和交叉之间可能有所不同，我们使用方程式为每个神经元计算了一个可区分性指数（d'）2，其中μforward和μbackward是在第一次交叉和交叉后退过程中计算出的神经元的平均活性。σpooled是合并的S.D.从这两种情况下。为了对所有分析进行随机对照，我们平均为每个神经元100次的感兴趣的值（可区分性指数，z得分痕迹和/或发射速率），并在神经群体上创建了无效的分布。 　　我们进行了K-均值聚类分析，以根据其在第一次过境期间的活动，第一次交叉和测试后的最后一次穿越，根据其活性对Purkinje细胞进行分类。我们在每种条件的4 s边界交叉周期内这些事件中提取了每个浦肯野细胞的Ca2+活性，然后将它们串联，从而为每个Purkinje细胞提供了Ca2+活性迹线，总持续时间为12 s。随后，我们执行了Silhouette Analysis64，以确定该数据集的最佳簇数，我们发现这是两个。因此，然后我们应用K-均值聚类将所有与跨日的Purkinje细胞分类为两个簇。 　　为了在Purkinje单元中找到Ca2+事件，我们首先使用恒定值设置为迹线的最大振幅的0.1倍。然后将阈值轨迹扫描，以识别至少3帧与彼此相距至少3帧并在这些峰上进行二进制的峰。为了进行频率分析，我们计算了在边界越过的每个单元的二进制痕迹中Ca2+事件的数量，并计算了在这4 s边界交叉期间的发射频率（扩展数据图9J，L）。对于Ca2+尖峰振幅分析，我们从检测到的Ca2+事件的时间点作为振幅提取了每个单元的z得分的Ca2+痕迹的值。然后，我们在4 s边界划线的时间中选择了这些振幅以进行比较（扩展数据图9L，m）。对于Ca2+ Spike波形分析，我们使用了每个Purkinje单元的Z得分痕迹来识别每个尖峰的开始，峰值和终点，该峰值大于3 z分数ΔF/f（扩展数据图9N）。 　　用磷酸盐缓冲盐水（PBS）在心铁上灌注小鼠，然后在PBS中甲醛4％。然后解剖大脑，在4％甲醛中固定，并在30％蔗糖中冷冻保护。然后将组织在最佳切割温度化合物（OCT； 4583，组织TEK）中冷冻，并使用低温恒温器（Leica）切片。如果立即使用，将大脑切割为40μm，并在4°C下存储在PBS中。为了更长的存储，将组织切片放在基于甘油的冷冻保护剂溶液中，并存储在-20°C下。对于原位杂交，以14μm的切割组织，在Superfrost Plus载玻片（22-037-246，Thermo Fisher Scientific）上收集，并存储在-80°C下。 　　将组织与0.3％Triton X-100（Sigma-Aldrich）加5％正常驴血清中的0.1 M PBS孵育1小时，并在0.1 M PBS中阻塞。将初级和二抗在0.1 M PBS中稀释，X-100加上1％的正常驴血清。然后将切片在4°C的一级抗体溶液中孵育过夜，在0.1 M PBS中用0.3％Triton X-100洗涤40分钟，在室温下在二级抗体中孵育2小时，并在0.1 M PBS中洗涤40分钟。然后使用Fluoromount-G（00-4958-02，Thermo Fisher Scientific）安装部分。在UNC神经科学显微镜核心中，使用Zeiss ZEN软件在Windows PC上运行的Zeiss ZEN软件在Zeiss LSM 780共聚焦显微镜上获取图像。链霉亲和素结合物（Alexa Fluor 594结合，Thermo Fisher Scientific; 1：1,000）用于可视化生物细胞。 　　对于原位杂交实验，我们使用了先进的细胞诊断RNASCOPE技术（ACD Bioscience）。简而言之，5-8周大的野生型小鼠用0.1 mL的安乐醇（NDC-051311-050-01，virbac）深度麻醉，并在pbS中用0.1 M PBS进行了灌注，然后在PBS中用0.1 M PBS进行灌注。解剖大脑，在30％的蔗糖中冷冻保护过夜，然后在OCT中冷冻。将冷冻组织以20μm切成超冻土加上载玻片，并在-80°C下保存。将组织从-80°C解冻，在室温下用PBS洗涤，然后根据制造商提供的方案进行处理。我们首先使用预处理试剂盒中的溶液预处理组织以透化组织，然后与蛋白酶孵育30分钟，然后在40°C下再与杂交探针再孵育2小时。 　　为了量化PAC后发现的RACC中神经元的输出，我们分析了推定的突触前轴突末端中MRUBY的表达。首先，使用ImageJ中的滚球算法在每个图像的MRUBY通道上进行背景减法。随后，将图像的阈值阈值为平均背景强度的4倍，将其转换为二进制格式。然后计算这些二进制图像的像素密度，并标准化为显示MRUBY表达的特定区域的大小。 　　我们在病毒注射后3-4周开始了PAC范式。PAC的调节阶段后立即对小鼠安乐死。斩首后，大脑迅速收集并浸入含有87 mm NaCl，25 mm Nahco3、2.5 mm KCl，1.25 mm NaH2PO4、10 mm -glucose，75 mm -glucose，75 mm蔗糖，0.5毫米Cacl2和7 mm mgcl2（ph 75％的cOm com com com com o2 com o2 com o2 com o2 com o2 com o2 com o2 com o2 co2 and 95％o2 and com o2 com o2 com o2 and，使用VT1200振动组（Leica Microsystems）切割300μm厚的冠状脑切片，并含有RACC。在35°C下孵育大约20分钟后，将切片储存在室温下。然后将切片转移到室内进行电生理记录。解剖后最多使用切片。实验在21–24°C下进行。 　　在实验过程中，将切片与含有125 mM NaCl，2.5 mm KCl，25 mm Nahco3、1.25 mm NAH2PO4、25 mm--葡萄糖，2 mm -gl曲解糖，2 mm Cacl2和2 mm Cacl2和1 mm MgCl2（pH 7.4 in 95％O2和5％Co2和5％CO2和5％CO2和5％CO2，ph 7.4）的生理外溶液超级融合。如先前所述，进行了RACC→PN神经元的全细胞贴片记录。65。使用P-97 Puller（Sutter Instruments）形成移液器（1B150F-4，WPI）。电阻为3–5MΩ。 　　The intracellular solution used for testing the action potential firing properties, spontaneous release and LTP induction of rACC→Pn neurons contained 135 mM K-gluconate, 20 mM KCl, 0.1 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 2 mM Na2ATP, 10 mM HEPES and 0.3 mM Na3GTP (pH adjusted to 7.28 with KOH, ~310 mOsm);在记录的一部分中，添加了0.2％的生物细胞。为了测量RACC→PN神经元的膜性能和引起动作电势触发，通过记录移液管将1 s步骤电流（-50、0、50、100、100、200、200、200、300 PA）通过记录移液管注入细胞中。将自发的EPSC记录在-70 mV时持有RACC→PN神经元时记录的EPSC。 　　对于LTP诱导，通过将硼硅酸盐Theta玻璃（2.0 mm，华纳仪器）放在RACC的II/III层中，进行双相电刺激（5-8 V，100 ms）。使用垂直移液拔器拉动玻璃，并充满灌注溶液。使用DS4双重电流刺激剂（Digitimer）以0.02 Hz刺激纤维，以测量RACC→PN神经元的诱发EPSC作为基线6分钟。TBS（在100 Hz时以200毫秒为间隔的5列脉冲脉冲，以200毫秒的间隔重复4次，以10 s的间隔重复4次），然后给予诱导LTP。LTP诱导后，将诱发的EPSC记录为另外30分钟，以与基线进行比较。没有使用阻断器来阻止抑制性突触输入。 　　用于测量AMPA/NMDA比的基于CS+的细胞内溶液，PPR包含130 mM CS-甲磺酸盐，2 mM KCl，10 mM EGTA，2 mM MGCL2，2 mM MGCL2，2 mm Na2ATP，2 mm Na2ATP，10 mm HEPES和10 mm QX-QX-314（pH pH调节）（pH调节率）3.28 〜310 〜310。为了引起RACC→PN神经元的突触反应，通过将同心双极电极（FHC）放在RACC的II/III层中，将电刺激（50-80μA，100μs）传递。选择性GABAA受体拮抗剂SR-95531（10μM； Sigma-Aldrich）用于阻断IPSC。为了记录由AMPA和NMDA受体介导的EPSC，膜电位的电压从-80 mV增加到+60 mV。为了测量PPR，使用不同的时间间隔（20、50、100、200、500 ms）的两个电刺激来唤起突触传播。将膜电位设置为-30 mV，以将EPSC和IPSC记录在相同的迹线（扩展数据图6O）或-70 mV或+10 mV中，以隔离检查EPSCS或IPSC（图2O）。 　　如上所述制备了来自PVALBCRE小鼠的切片。An intracellular solution containing high chloride concentration (140 mM KCl, 10 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 2 mM ATP, 10 mM HEPES and 2 mM QX-314; pH adjusted to 7.28 with KOH; 313 mOsm) was used for postsynaptic recordings of rACC→Pn neurons, which were conducted in the voltage-clamp configuration with a holding potential of-70 mV。 　　对于所有电压钳记录，我们在整个实验中施加了超极化测试脉冲（5 mV，100 ms）来监测串联和输入电阻。从实验中删除了15％以上的串联电阻的数据。 　　使用多灯700B放大器（轴突仪器），在10 kHz中过滤的低通滤波器，并使用Digidata 1440A低噪声数字仪（Axon Instruments）以20或50 kHz采样。使用ClampFit 10软件（Axon Instruments）进行刺激和数据采集。使用Stimfit V.0.14.9（https://github.com/neurodroid/stimfit），clampfit v.11.2（分子设备）和R V.4.0.3（用于统计计算的R项目）分析数据。使用模板匹配算法检测到SEPC，并通过视觉检查验证66。将峰值EPSC记录在-80 mV时的峰值EPSC的位置用于测量AMPAR EPSC的振幅。电刺激后50 ms测量NMDAR EPSC的振幅。单突触EPSC或IPSC的突触潜伏期是从电刺激的开始到EPSC或IPSC发作的。从EPSC的发作-70 mV的发作到IPSC的发作，在+10 mV的发作中测量了无突触IPSC延迟（图2O）。 　　对于纤维式套管植入手术，用异氟烷（4％的诱导和2％的维持）麻醉小鼠，使用加热垫保持体温。去除颅毛，皮肤灭菌和头皮切口后，我们使用上述用于操纵PN中ACC终端的坐标将编码抑制性或兴奋性OPSIN编码的病毒注射到ACC中。为了操纵OPRD1+细胞在PN中的活性，我们双侧在坐标AP：-4.0 mm，ml：±0.4 mm，dv：-5.4/-5.8 mm处将编码抑制性OPSIN的病毒注入PN中。为了操纵接收RACC输入的PN中OPRD1+细胞的活性，我们将AAV1-FLPO病毒双侧注射到RACC中，然后将另一种病毒注入PN中，以CRE和FLP依赖性方式表达抑制性OPSIN。注射病毒后，我们在三个位置进行了小型颅骨（AP：+5.10，-1.06，-3.56 mm; ml：-0.77，+2.87，-3.13 mm）。接下来，为了稳定植入，将三个不锈钢螺钉（MX-000120-01SF，组件供应公司）钻入头骨的硬脑膜。然后，我们在AP：-4.0 mM，ML：±1.2 mm处进行了两个额外的颅骨型。然后将套管（CFMLC12L05，Thorlabs或RWD）连接到支架（David Kopf仪器）上，并在10°下降低至坐标AP：+4.0 mm，ML：±1.2 mm：±1.2 mm，DV：-4.9 mm。用颅骨切开术周围的血液和碎屑迅速去除，并使用粘合剂水泥（S380 metabond快速粘合水泥系统，C＆B）来密封套管和头骨之间的间隙。将定制设计的激光切割头杆（18-24 G不锈钢，激光稳定）放在左后颅骨螺钉上，然后将牙齿水泥层（Lang Dental）涂在插座上，将牙齿和头部粘贴到颅骨上。水泥干燥后（7-10分钟），我们将动物转移到加热垫上，直到完全恢复，然后转移到他们的家笼中。 　　对于抑制性（ENPHR3.0）或兴奋性（CHR2）OPSIN的光遗传光刺激，将伪造物连接到561 nm（黄色）激光二极管（MGL-FN-561，OPO ENEMENT）或494 nm（蓝色）激光二极管（MBL-III-473，Opto Engine LC），使用Opto Engine LC，AT旋转关节（胸部）。使用快门控制器（SR470，Stanford Research System）控制激光输出，该快门控制器连续递送黄光，以抑制性OPSIN和4毫秒的蓝光脉冲以20 Hz的速度用于兴奋性OPSIN。通过光纤在光纤尖端调节到〜5 mW，以抑制，在光纤的尖端上进行抑制，以激发光纤。 　　对于下面描述的所有行为分析，在测试前将小鼠适应研究人员和测试环境至少30分钟。 　　PAC设备由两个相邻和视觉上不同的腔室组成，使用两个单独的热板（Bioseb）作为地板。PAC是一个7天的行为测定法，由三个阶段组成：习惯（第1-2天）和预测试（第3天），调理（第4-6天）和测试后（第7天；图1A）。在习惯和预测试阶段，两个腔室的地板都设置为30°C，并且小鼠可以自由探索两个隔室3分钟；他们在测试前的表现与他们在测试后日的表现进行了比较。在调节阶段，将小鼠开始的腔室的地板设置为48°C。小鼠逐渐了解到腔室1很痛苦，并且将腔室2关联到30°C，并缓解疼痛。在测试后，两个腔室的地板都设置在48°C，以评估预期疼痛缓解引起的任何镇痛作用。使用MATLAB（R2019B，Mathworks）控制的相机（ACA1300，Basler）记录小鼠的性能3分钟。使用基于机器学习的算法DeepLabCut67或Ethovision XT15（Noldus）分析了录制的视频。我们量化并比较了边缘横梁的潜伏期，在每个腔室中花费的时间以及有条件和无条件的小鼠的单一行为（舔，饲养，跳跃）（图1）。 　　为了研究PAC诱导的安慰剂镇痛是否需要内源性阿片类药物活性，我们在调节阶段（第4至6天；扩展数据图1G – I）或在测试后的测试中，在调节阶段（每千克5 mg）注射了盐水或纳洛酮（N7758，Sigma-Aldrich）（每公斤5 mg）（每公斤5 mg）。注射后，将小鼠送回他们的家笼至少30分钟，以减少注射诱导的压力。注射盐水的小鼠用作对照。 　　病毒注射两周后，对诱O的小鼠进行了调整后的PAC分析（在第4-6天而不是3分钟的调节阶段），以标记编码疼痛缓解期望的RACC神经元。在进行PAC试验之前，在调理阶段的最后一天（第6天）向TRAP2小鼠注射4-羟基莫昔芬（每公斤50 mg，皮下）。注射后，允许小鼠在PAC设备中保留30分钟，然后返回其家笼。然后，2周后，我们灌注了小鼠并解剖了大脑，以确定RACC和其他大脑区域中的突触蛋白 - 菌落表达。接受相同过程但两个腔室设置为30°C的小鼠被用作对照。 　　为了检查有害机械刺激期间RACC→PN神经元的Ca2+活性（扩展数据图7），我们以大约30 s的间隔轻轻地用25 g针的底爪底帕表面（扩展数据图7a）。作为对照，使用钝端的针头在无害的机械刺激过程中测量RACC→PN神经元的Ca2+活性。使用由MATLAB（R2019B，MATHWORKS）控制的相机（ACA1300，Basler）记录整个过程，并与Miniscope同步。 　　为了检查有害热刺激期间RACC→PN神经元的Ca2+活性（扩展数据图5），我们使用了Hargreaves测试。将小鼠放在加热至25°C的玻璃表面上的塑料室中，可以将辐射热源（麻醉学部，加州大学圣地亚哥分校）聚焦在后爪上。我们使用MATLAB（R2019B，MATHWORKS）控制的相机（ACA1300，Basler）记录了小鼠的性能，并与Miniscope同步。 　　使用八个von弗雷丝（sto），范围从0.007到6.0 g评估机械戒断阈值。用足够的力垂直于腹侧 - 媒体后爪表面施加细丝，以引起细丝的轻微弯曲。阳性反应的特征是爪子在4 s内迅速退出刺激纤维。上下方法用于确定机械阈值（50％撤回阈值）68。 　　为了评估机械灵敏度，我们使用了六个von frey丝（0.07、0.16、0.4、1.0、1.4和6.0 g）。用足够的力垂直于腹侧 - 媒体后爪表面施加细丝，以引起细丝的轻微弯曲。每个丝施用1 s。积极的反应的特征是爪子从细丝中迅速而立即撤出。每个丝施用五次。计算了反身戒断反应的频率。 　　如上所述，将小鼠适应了测试环境。将板温度设置为48°C或52°C，以测量热痛阈值。将鼠标放在板上，并在舔和/或咬伤后的潜伏期进行评分。为了防止组织损伤，分别为48°C和52°C的板设置了3分钟或1分钟的截止。 　　PAC的调节阶段后，在小鼠的左后爪上进行了扁豆内注射（20 µL）的2.5％福音。在PAC设备中记录了30分钟的小鼠行为，或者使用四台相机的设置可实现每个侧角的同步捕获。使用Ethovision XT15（Noldus）对注射后的后爪花费的时间进行评分，或使用DeepEthogram自动评分，即无偏见的基于像素的机器学习算法69。 　　对于低通量，高深度SCRNA-seq，我们使用智能seq V4超低输入RNA试剂盒进行测序（SSV4； Takarabio），如前所述70。为了将高深度分析集中在神经元上，我们使用了SNAP25-IRES2-CRE； AI14（SNAP25-TDT）小鼠，这些小鼠表达了神经元中的荧光记者TDTOMATO。从两只8周龄的SNAP25-TDT小鼠（一名雄性和一名雌性）中微解析PN。将小鼠用异氟烷麻醉，并灌注包括CACL2（0.5 mm），葡萄糖（25 mm），HCl（96毫米），HEPES（20 mm），MGSO4（10 mm），MGSO4（10 mm），NAH2PO4（NAH2PO4（NAH2PO4），NAH2PO4（1.25 mm），Myo-insyl（3毫米）的HEPES（20 mm），MGSO4（10 mm），3毫米）的人工脑脊液灌注（12毫米），NMDG（96毫米），KCL（2.5毫米），NaHCO3（25毫米），钠s酸钠（5毫米），吡啶钠（3毫米），牛磺酸钠（0.01毫米）和硫脲（01毫米）和Thiourea（2毫米），与碳原料（95％O2和5％CO2）起泡。将PN微解剖并嵌入2％琼脂糖中，切成250 µm的曲线，然后用振动剂将PN切成250 µm的切片，然后在室温下用pronase（1 mg ML-1）进行酶促消化，在室温下70分钟，并在室温下使用耐火的粘贴管进行三尿，以产生单核悬架。使用荧光激活的细胞分选基于DAPI-TDTOMATO+，将活的单个PN神经元分离为含有SSV4裂解缓冲液的八孔条，然后存储在-80°C下。为了制备单细胞转录组库，将聚腺苷酸化的RNA反转录为全长cDNA，并根据SSV4方案进行18个PCR扩增周期。将单细胞库进行索引，并使用Nextera XT DNA文库制备套件制备用于Illumina测序。在HISEQ 2500测序仪上对多路复用的库进行了测序，以生成100 bp配对的读数，每个单元格的深度为250万个读取。使用Star（v.2.7.3a）71将单细胞FASTQ文件与MM10鼠标基因组（GRCM38）对齐。 　　对于高通量，低深度单核RNA-seq（SNRNA-Seq），我们使用了10倍铬3'V3系统（10x基因组学）。我们从两名8周龄的雌性C57BL/6J小鼠中对PN进行了微分解。将PN组织合并，并在干冰上闪烁。如前所述进行单核分离72。将组织放入含500 µL冷冻洗涤剂裂解缓冲液（0.10％Triton X-100，0.32 M蔗糖，10 mm HEPES（pH 8.0），5 mm Cacl2，5 mm Cacl2，3 mm mgac，0.1 mm mm edta，1 mm dithioterol（1 mm dithiothiotolol（Dttiti）dttitiperol（Dttti）dtttta dtttta dttttta dtttiTiperol（Dtttiti））的组织中（0.10％Triton x-100，0.10％Triton X-100，0.10％Triton X-100，0.10％Triton X-100，0.10％Triton X-100，0.10％）五个中风与“松散”杵进行匀浆，然后用“紧密”杵（kimble）进行十杆。然后，将1 ml的蔗糖缓冲液（0.32 M蔗糖，10 mM HEPE（pH 8.0），5 mM CaCl2，3 mm MGAC，0.1 mM EDTA，1 mM DTT）添加到DOUSE均质均匀液中，并将组合溶液通过40μm细胞过滤器的液体饲养到含有40μm的细胞纤维中，含有0.32 mL succccccccccre。通过过滤器，将另外1 mL的0.32 m蔗糖缓冲液通过，并在4°C下以3200g的3200g离心10分钟。将沉淀用3 mL的0.32 M蔗糖缓冲液重悬于30 s（Ultra-Turrax分散器，设置1）。接下来，将12.5毫升的1 M蔗糖缓冲液（1 M蔗糖，10 mM HEPES（pH 8.0），3 mM MGAC，1 mM DTT）在匀浆下方吸管，并在4°C下以3,200g的3,200g在3,200G中心切开管。倒在上清液后，将颗粒重悬于1 ml的重悬于1 ml的溶液中（0.4 mg ml -1 BSA，0.2Uμl -1 RNase抑制剂（Lucigen）在1×PBS中），通过35 µM细胞过滤器过滤，并通过35 µM细胞过滤，并稀释至225个细胞的最终浓度。 　　将单核悬浮液加载到两个10倍基因组芯片上（Chromium V3）。SNRNA-Seq库是根据制造商提供的协议构建的。用PHIX控制库（5％）将多路复用的SNRNA-SEQ库施加峰值，并在两个NextSeq 550高输出流量电池运行中测序。原始测序文件与MM10小鼠基因组（GRCM38）对齐，并使用Cell Ranger Pipeline转换为基因表达矩阵（Cell Ranger v.5.0.1，默认参数）。包括内含子读数以提高测定敏感性。 　　使用Seurat（V.4.0）73分析了SCRNA-SEQ数据。对于10倍基因组学数据集，除去了少于5个核表达的基因和基因少于200个基因的核被去除。对于SSV4数据，除去了少于5个细胞中表达的基因和基因少于1,000个基因的细胞被去除。为了将分析集中在神经元上，我们进行了广泛的初步聚类，以定义主要细胞类型，并去除缺乏神经元基因表达（SNAP25和RBFOX3）或表达的常规神经胶质细胞标记的细胞和核（MBP，PDGFRA，PDGFRA，GFAP，CSF1R和PECAM1）。最终数据集包含来自10倍实验的4,720个神经元核（每个细胞中位数中位数为8,669个中位数转录；每个细胞中位基因中位数3,816个）和212个神经元细胞，来自SSV4实验（481,098个中位数转录物），每个细胞中位数中位数转录； 9,956个中位数; 9,956个中位基因; 9,956个中位数。将每个SCRNA-SEQ数据集进行标准化，并使用以下参数分别转化为常见量表：NCELLS =单元格总数的一半；变量。Features=每个细胞表达的基因中位数。由SCT-PEARSON残差usinng Seurat的Find Integrationancners和IntegatedAta函数使用默认参数集成了结果数据集。 　　我们通过手动评估哪些主要成分有助于实质性变化（Seurat中的肘部功能）来确定在随后的聚类分析中使用哪些主要成分。为了增加簇的鲁棒性，通过通过最近的neighbour值（Seurat中的FindNeighbors功能）迭代来识别最佳最接近的邻居参数（K）并计算平均剪影得分74。卢万聚类的K-Near-near-neybour值产生最高的平均轮廓得分。成对的簇无法通过二项式测试可靠地通过单个基因区分（Q）< 0.01; log-effect size >2.0）溶解并根据主成分（PC）空间中的欧几里得距离重新分配到最近的簇74。使用此方法进行了初始的聚类，以检测主细胞类型（例如，神经元，小胶质细胞，星形胶质细胞）。基于神经元特异性基因（SNAP25，RBFOX3）和神经递质囊泡转运蛋白（SLC17A6，SLC17A7，SLC17A7，SLC32A1）的富集，对神经元主要细胞类型进行了聚类的群集。 　　与所有其他细胞相比，使用二项式测试使用二项式测试鉴定了细胞型特异性标记基因，以确定在给定簇中的细胞中哪些基因在给定簇内表达的基因75。将在特定细胞群（N）中表达的给定基因（G）的表达频率与其余种群中的表达频率进行了比较。因此，该测试的P值如下：，其中γ是表达感兴趣基因（mg/m）的细胞的比例频率。补充表1中提供了群集特异性标记基因的完整列表。 　　使用R V.4.0.3（用于统计计算的R项目）进行统计分析。所有值报告为平均值±S.E.M.使用双面Wilcoxon Rank-SUM测试，两侧Wilcoxon匹配对签名级测试或Tukey Post hoc hoc测试的双面匹配签名测试或单向ANOVA对统计显着性进行了测试。p <0.05被认为很重要。图中指出了0.05至0.1之间的P值。在涉及电纤维刺激的实验中，将刺激伪像被遮挡以显示目的。在图2中。1H，J和4E，在每组中检查了两只小鼠，并产生了相似的结果。在扩展数据图中。8e和9a – c，以相似的结果进行了三个独立的重复，并显示了代表性的图像。在扩展数据图中。2a – e和8g，进行了两次独立的重复，结果相似。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。