可视化无序的核运输机械原位

　　在Dulbecco修改后的Eagle培养基（41965-039，Thermo Fisher）中维持COS-7细胞（87021302，Sigma），并补充了10％V/V胎牛血清（F7524，Sigma，Sigma），1％青霉素 - 链霉菌素（1％） - 1％ - 链霉菌素（1％）（25030-081，Thermo Fisher）和1％丙酮酸钠（11360-070，Thermo Fisher）在37°C和5％CO2下，每2-3天通过每2-3天传递至15-20个通行证。cos-7细胞由制造商认证，并通过形态验证，并定期测试了支原体污染，结果负面结果。 　　转染前24小时24小时，将细胞化为胰蛋白酶（胰蛋白酶-EDTA； 25300-054，Thermo Fisher），并播种成35毫米成像盘中（81158，IBIDI）。The cells were transfected at a confluency of 60–70% with plasmids of interest listed in Supplementary Table 1 in Supplementary Information (for amber suppression with synthetic organelles, for example, pcDNA3.1-hsNUP98TAG-BoxB and pcDNA3.1-TOM20-FUS-λN22-PylRS(AF)-tRNA at a mass ratio of 1:1) using jetPRIME according to the manufacturer’s协议。4-5小时后，更换培养基，并分别添加了分别添加了分别添加了分别添加的，分别添加了分别添加了分别添加了分别添加，添加了分别添加了分别添加了分别添加的，分别添加了分别添加了分别添加，添加了分别添加了分别添加，分别添加了50μm反式环流2-EN-赖斯（TCO*a; scichem; scichem;用于细胞内标记）或T叔甲氧氧甲撇子 - 赖斯 - 赖斯 - 赖斯（Boc; iris Biotech;用于对照测量值）。 　　转染后20–24小时，将COS-7细胞用补充有50μMBOC和10 mM HEPE的新鲜培养基洗涤，并在37°C下孵育2小时，以消除过量的TCO*A。然后，将细胞与250 nm细胞渗透的染料（Janelia fluor 549-三嗪（Tocris），Janelia fluor 646-甲嗪（Tocris），硅烷基胺 - 甲胺 - 甲嗪（螺旋铬）（螺旋形）或Tamra-temrazine（点击化学工具））的培养基377°°C中培养。标记后，将细胞用新鲜培养基在37°C的2小时内洗涤四次。在补充10 mM Hepes的无苯酚红色培养基中，在室温下立即成像细胞。成像盘的盖子在细胞成像的持续时间内保持关闭2小时。 　　转染后20–24 h，用传输缓冲40（TB； 20毫米HEPES，110 mm KOAC，5 mm NAOAC，2 mm mm毫克，2 mm mg（OAC）2，1 mm EGTA和1 mm EGTA和2 mm DTT，pH 7.3，对PEG6000（5 mg ril-1）备份，将COS-7细胞洗涤两次（TB; 20 mm HEPES，110 mm KOAC，5 mm NAOAC（OAC）2，1 mm EGTA和2 mm dtt，pH 7.3用20μgml -1 digitonin（A1905，Applichem）在TB中2分钟。透化后，用TB将细胞洗涤两次，以去除digitonin，并用含有33.3 nm Azdye594-四嗪（单击化学工具）和66.6 nm LD655-四嗪（Lumidyne Technologies）的染料溶液标记，TB中有2分钟。在这里，我们优化了供体染料和受体染料之间的摩尔比为1：2，以减少仅供体的人群。为了去除残留染料，将细胞在结核病中洗涤并在37°C下孵育30分钟。在室温下立即成像细胞。成像盘的盖子在细胞成像的持续时间内保持关闭2小时。 　　如上所述，将COS-7细胞转染，透化并用100 nm LD655三嗪标记。最后一次洗涤后，将成像盘安装在定制的共聚焦显微镜上。轻轻去除洗涤缓冲液后，将0.5μm的70 kDa FITC – dextran（53471，Sigma）添加到TB中，将其添加到盘中，孵育10分钟，并成像细胞。 　　为了允许进口复合物形成，首先将0.5μMIBB– MBP – GFP货物与1μmimportin-β在ICE上预孵育10分钟，然后与其余的传输混合物（5μmRangDP，4μMNTF2，4μMNTF2和2 mM GTP）结合使用，以前在TB中进行了Importin-β，Ran-β，ran和nT的puit puit puit puit puit puit puit as ran和ntf2。之后，如上所述，将完整的导入混合物添加到透化和标记的COS-7细胞中。 　　为了确保在每种成像盘的FLIM – FRET测量的2小时时间窗口中起作用，对新鲜标记的细胞进行了被动排除测定和主动传输反应，并在TB中在TB中在室温下2小时孵育2小时后，在标签步骤后2小时（扩展数据图3C，DC，d）。 　　如上所述，在TB中用100 nm LD655三嗪在TB中标记后，COS-7细胞在PBS中立即用2％PFA固定10分钟，或在室温下固定2小时，然后固定。用PBS两次洗涤后，将细胞用0.5％Triton X-100在PBS中透化15分钟。然后，将细胞用PBS洗涤两次，并与阻塞缓冲液（PBS中的3％BSA）孵育90分钟。随后将细胞用抗KPNB1抗体（AB2811，ABCAM； 1：1,000）和抗小鼠Alexa Fluor 488二抗抗体（A-11001，Thermo Fisher; Thermo Fisher;在1：1,000）进行免疫标记。免疫荧光表明，透化后的内源性进口蛋白β在核包膜上共定位，并在Flim-Fret测量的2小时时间内保留（扩展数据图3E，F）。 　　HOMO SAPIENS NUP98 FG结构域（1-505个氨基酸，有或没有GLE2结合结构域（Glebs; Glebs; 157-213氨基酸），在两个FG域之间的结构化结构域）被克隆到PQE-14his-14his-TEV量中。我们还设计了一个没有Glebs的构造，因为当迅速将缓冲液条件从液滴测定中的变性变为天然时，结构化的Glebs结构域可能会误导并触发聚集（请参阅“体外液滴测定和Flim -Fret -Fret测量”）。Glebs结构域不在细胞内实验探测的残基段之外。除非另有说明，否则我们将NUP98构造用于体外实验。 　　在37°C和200 rpm的含有50 µg ml -1的卡纳米霉素的含有或不带有gle的Nup98 FG构建体的大肠杆菌BL21 AI细胞生长在有或没有Glebs的情况下，并用0.02％（W/V）（W/V）Arapinose和1 mmmmmmmmmmmmiptg诱导蛋白质表达。在18°C下表达16小时后，通过离心收集细胞，并在含有6 m GDMCL，0.2 mM Tris（2-羧乙基）磷蛋白（TCEP）（TCEP）（TCEP）（TCEP）（TCEP）的裂解缓冲液中裂解，并在20 mm Imidazole和50 mm-tris-Hcl at ph 8中心溶液。4°C去除细胞碎片，并将上清液与Ni珠在4°C下孵育2小时。将带有裂解物的Ni珠装载在聚丙烯管（Qiagen）中，用2 m GDMCl和20 mm咪唑洗涤两次，pH 8，并用含有2 m gdmcl和500 mm咪唑的缓冲液洗脱，pH 8。在室温下与TEV蛋白酶过夜。将蛋白再次与Ni珠一起在2 m GDMCL和50 mM Tris-HCl，pH 8中孵育，以去除具有Ni珠亲和力的裂解的His-Tag，TEV蛋白酶和非特异性蛋白。收集了含有NUP98 FG结构域的流通液，并通过2 m GDMCL，0.2 mM TCEP和50 mm TRIS-HCl，TRIS-HCl，pH 8分数和STSD-Page-Page-Page-Page-Page-Page-Page-Page blue分析了2 M GDMCL，0.2 mM TCEP和50 mm TCEP和50 mM TRIS-HCl，进一步纯化的。使用3 kDA MWCO离心滤器（Merck Millipore）将纯级分汇合并浓缩在4 m GDMCL中约15 mg ml-1，并通过BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher）测量浓度。蛋白质被闪烁并储存在-80°C下。 　　For labelling, the purified NUP98 FG domain with single or double cysteine mutations was exchanged to 4 M GdmCl, 1× PBS, 0.1 mM EDTA and 0.2 mM TCEP, pH 7. Labelling with Alexa Fluor 594 maleimide (A10256, Thermo Fisher) and LD655-maleimide (Lumidyne Technologies) was done at the molar ratio of1：2（染料：蛋白质）在4°C下过夜。将反应用10 mM DTT在4 m GDMCL和1×PBS，PH 7中淬灭。未反应的染料被用3 kDA MWCO离心滤器洗涤，并用SuperDex 200进一步纯化了标记的蛋白质。按照上述和最终的浓度选择了SuperDex 200。蛋白质被闪烁并储存在-80°C下。 　　The custom-built FLIM–FRET imaging setup (Supplementary Fig. 6) was equipped with picosecond pulsed laser diode heads including the wavelengths of 485 nm (LDH-D-C-485, PicoQuant), 560 nm (LDH-D-TA-560, PicoQuant) and 660 nm (LDH-D-C-660, PicoQuant).激光头是通过多通道Picsecond二极管激光驱动器（Sepia II PDL 828，picoquant）控制的。将梁耦合到单模偏振光纤（KineFlex-P-2-S-S-405/640-2.5-2.5-p2）和纤维耦合器（60FC-4-RGBV11-47，Schäfter + Kirchhoff）。光束穿过Glan-Laser偏振器（Thorlabs），并被引导到激光扫描系统（Flimbee，picoquant）中。将扫描系统中的三个Galvo镜子成像到具有200毫米管镜头的物镜的反焦面（×60 Sr Plan Apo IR，1.27 Na; Nikon）。将荧光发射聚焦到针孔（用于细胞测量值的100μm，液滴测量值50μm，单分子FRET测量值100μm），然后使用50/50极化束splitter（Thorlabs）分离成平行和垂直成分。Each component was further separated by two sets of beamsplitters (ZT561 RDC and T647 LPXR, Chroma), passed through three sets of bandpass filters (green channels: 525/50 BrightLine HC; orange channels: 609/57 BrightLine HC, Semrock; red channels: ET700/75m, Chroma), and focused onto the single-photon counting detectors (green channels和橙色通道：PMA混合40，红色通道：τ-Spad，picoquant）。来自光子检测器的信号通过TCSPC系统（Hydraharp 400，picoquant）记录，以16 ps的时间分辨率记录。数据采集​​是通过Symphotime 64软件v2.6（PicoQuant）进行的。 　　förster半径R0是一对荧光团之间的距离，该荧光团效率为50％，计算为AS43， 　　在哪里取向因子，n是折射率（细胞测量值的n = 1.375），体外冷凝液的n = 1.426）是供体的量子产量，没有能量转移，是供体排放和受体吸收的供体积分的重叠积分，在波长下，由43，43，43，the Bife the Wavellength。 　　供体在波长处的辐射发射强度在哪里，是受体的灭绝系数。分别使用供体或受体的单标记细胞在Leica SP8 Stellaris显微镜上测量了供体的发射光谱和受体的激发光谱扫描。然后，使用吸光度光谱仪（Duetta）将获得的光谱与TB中的游离染料测得的光谱进行了比较，未检测到光谱移位。当染料可以自由旋转时，可以假定约为三分之二，因为我们所有的染料在共轭组和发色团之间都有C5柔性接头。在这里，我们假设接近平行的激发和发射偶极子。我们还测量了NPC内用供体染料标记的样品（0.27±0.015）的样品的荧光各向异性，在FG凝结物的体外（0.28±0.003）中，在单一分子水平（0.15±0.003）上的溶液中的荧光染料（0.28±0.003）（0.28±0.003）。在所有情况下，发现测得的各向异性小于0.3，并且在这种状态下，距离测量结果的误差均低于10％。在细胞测量中的R0确定为77.1Å，用于体外冷凝水的测量值为77.3Å。请注意，明显的缩放指数对于R0测量中的误差是可靠的（见补充图7）。 　　优化了激光激发的平均功率，以在合理的时间内从细胞中收集足够的光子，但避免了荧光寿命测量中的光子堆积和其他伪影。每天使用新鲜制备的Ki和erythrosine b66溶液测量仪器响应函数。通过测量的仪器响应函数预先对准平行和垂直探测器的时间偏移。使用以下成像设置进行细胞测量：像素大小为100 nm，图像大小为256×256像素，像素停留时间为150μs，时间分辨率为16 ps。在T3模式下检测到荧光光子，并从垂直探测器和平行探测器中分别收集。 　　为了测量Flim – Fret，首先使用660 nm激光激发检查标记的细胞的形态，以确保核中不存在GLFG体（通常在细胞中表达过度表达NUP98的迹象）。然后用660 nm激光激发检查核边缘的每个像素的受体强度，以进一步评估突变体NUP98的表达水平，以确保选择具有相似表达水平且不高表达突变体NUP98的细胞。具体而言，我们根据标准确定了这样的受体强度范围，即在核边缘上，相对FRET效率（即接近度比分别为ia和id是总受体和供体荧光强度，而受到560-NM激光元的激发）与受体强度为Pixel per a 6660-lase septraliate afteron Indector In cixel Indector Indece and s 660-lase septrials coptor n and cixel Indector Indector Indection。通过对表达单木突变剂NUP98并用供体和受体染料混合物标记的细胞的受体光漂白测定，这种强度阈值得到了进一步验证。如图2B所示，供体染料的平均荧光寿命在受体光漂白之前和之后没有变化，这表明无法检测到未检测到分子间的FRET。 　　在用660 nm激光激发检查突变体NUP98的表达水平后，我们使用560 nm激光激发将所选的细胞成像5分钟，平均功率为40μW，然后在40 MHz时为40μW，然后使用660-nm激光激发，平均功率为40 mHz，平均功率为35μW。接下来，使用660 nm激光激发光漂白，平均功率为40 mHz，持续2分钟。使用560-nm激光激发，在40 mHz时平均功率为40μW，将供体信号再次测量5分钟。 　　使用基于MATLAB68中的软件包PAM开发的自动分割管道对记录的图像进行处理。根据每个像素的强度和平均寿命，使用阈值算法选择核边缘作为感兴趣的区域（ROI）。分别从选定的ROI中提取了受体光漂白之前和之后的时间分辨供体荧光强度曲线。通过将平行和垂直荧光衰减（分别）（分别）69组合来计算总荧光衰减。 　　在其中考虑了高数值孔径物镜引起的极化混合的因素，而G是平行和垂直极化之间检测效率差异的因素，由，由 　　对于参考样品，分别在平行和垂直通道中，检测到的荧光衰减分别为DPAR和DPER。 　　为了确定和，测量了YFP的荧光衰减，并测量了已知荧光旋转弛豫时间（ρ= 16 ns）70的荧光衰减，并用方程式（5和6）全局拟合。 　　当测量Tris溶液（2,2'-二吡啶基）二氯硫代（II）氯化物（[RU（BPY）3] CL2）时，G因子被确定为垂直和平行供体通道平均强度的比率。对于每个突变体，添加了大约100个细胞的总荧光衰减以进行进一步拟合分析（请参阅补充文本中NPC中NUP98 FG的FLIM分析方法的部分，并拟合缩放定律）。 　　将纯化和标记的NUP98 FG结构域与未标记的蛋白质混合，摩尔比为1：5,000在2 m GDMCL中的1：5,000和1×PBS和1×PBS，pH 7。此混合物中，将1 µl与24 µL TB与24 µl TB迅速混合，并与5 mg ml-1 Peg6000 coblesed Covered Covers Pecround（815150）（8150）（81507）混合（81507）。共聚焦显微镜。该系统中NUP98的最终总浓度为10 µm，标记为2 nm。溶液中剩余的GDMCL的痕量为80 mm（可以忽略不计）。 　　对于相距分离的冷凝物上的被动排除测定和促进/主动转运测定，未标记的NUP98和LD655标记的冷凝物与上述比率混合，以避免与荧光呈荧光标记的Cargos（即，FITC或GFC）的串扰。将蛋白质与结核病混合5分钟后，在TB中仔细替换了0.5μm70 kDa FITC – dextran，或在转运混合物中的0.5μMIBB-MBP-GFP中，如所述的标记细胞中所述，避免了避免干扰盖玻片上的冷凝物和立即受到盖子上的冷凝物的描述。 　　为了测量NUP98 FG冷凝物上的Flim – Fret，我们专注于前5分钟，因为在这段时间内冷凝物的表现更类似于液体样（例如，FG-滴滴迅速合并，如扩展数据图9a所示）。我们应用了相同的构象分布模型（即高斯链模型），以适合我们在细胞测量中使用的FG冷凝物的寿命曲线（请参阅补充文本）。 　　使用560 nm激光激发在40 MHz时平均功率为70μW，将成像的冷凝物测量5分钟，成像设置如下：像素大小为200 nm，图像大小为256×256像素，像素含量为100μs和时间分辨率为16 ps。在T3模式下检测到荧光光子，并从垂直探测器和平行探测器中分别收集。根据Sypphotime 64软件中的强度和平均寿命选择FG-DROPLET作为ROI。从ROI像素中提取时间分辨的供体荧光强度曲线进行分析。 　　为了确保未检测到分子间的特征，将单半胱氨酸的NUP98标记为供体染料或供体和受体染料的混合物。然后将标记的蛋白与未标记的蛋白质混合，其浓度与上述液滴测定相同。仅供体的供体荧光寿命和供体 - 受体混合物没有差异，这表明无法检测到分子间的FRET（扩展数据图9B，C）。 　　为了分析单细胞的寿命衰减，通过将傅立叶变换应用于测量的衰减数据，将每个选定的核边缘的原始强度曲线i（t）绘制为相sor图中的一个点。 　　相量图的X和Y坐标分别为M和φ是相对于激光激发的调制和相位延迟，而激光激发的重复速率是F的重复速率，即40 MHz，T是采集的重复频率，即25 NS。为了建立绘制的相位点的正确标度，首先通过将傅里叶变换应用于测量的仪器响应函数跟踪并将其设置为零寿命71，首先校准相曲线图的坐标。然后，使用相同的校准参数相应地对获得的FLIM数据中的每个相位点进行校准，以便相对于校准标准参考最终相位图。上面的过程是在MATLAB中使用自编写的代码执行的。 　　用上述定制的共聚焦显微镜进行了单分子fret测量。用560 nm和660 nm激光照亮样品，以脉冲交织激发模式的重复速率为32 MHz。记录光子计数的分辨率为16 ps。将纯化的和双标记的NUP98稀释为最终的蛋白质浓度，在补充10 mm Fresh DTT的1×PBS中，在50 pm的最终蛋白质浓度中稀释。供体染料的平均功率为70μW，平均功率为20μW，供体染料的平均功率为70μW，平均功率为660 nm激光激发。通过Symphotime 64软件（PicoQuant）进行数据采集。 　　使用PAM软件包68分析获得的数据进行突发搜索，并在BurstBrowser中进一步分析了所确定的爆发。突发中的FRET效率E定义为AS72， 　　化学计量s定义为AS67， 　　在供体激发时检测到的受体荧光在哪里，供体激发后的供体荧光是受体激发后检测到的受体荧光，而γCOR是受体和供体通道检测效率的因素。在对供体荧光泄漏到受体通道（α= 1.00）和直接受体激发（δ= 0.30）中的泄漏进行校正之后，并确认不同突变体之间量子产率的最小变化，从明显的fret效率，eapp，eapp和明显的稳定量表中提取γcor参数。与1/sapp相比的图块的线性拟合会产生截距A和斜率B，与以下方式相关的γcor构成 　　我们确定了1×PBS中标记的NUP98的γCor参数为2.51。单分子转移效率直方图在扩展数据中显示。每个数据集显示了零品格效率的仅供体的物种（由于不完整的标记或发射非活性受体，例如由于漂白而引起的）和fret群体。选择FRET种群并配备不对称的高斯功能，以确定人口的中心，同时在高品格效率下考虑非线性效应。拟合的值被视为平均FRET效率，该效率定义为AS73， 　　其中ρ（r）描述了占用间距离的距离分布。一个典型的单分子货物（SMFRET）实验不包含足够的信息来检索模型距离分布，因此必须选择一个模型以适合。在这里，我们采用了高斯链模型，该模型假设单体占零体积和排除的体积效应。尽管它很简单，但通常用于分析IDPS30,74。距离分布函数采用高斯链型AS73给出的形式 　　根平方的占用距离。通过将拟合的拟合与从模型得出的计算的平均FRET效率进行比较，可以为每个突变体获得。 　　我们进行了MD模拟，以模拟NPC和在体外重新建立的NUP98 FG冷凝物中FG-NUP的大规模构象和运动。为了确保有效的采样，我们使用了粗粒聚合物模型，其中每个氨基酸由一个没有局部结构的单个珠子表示。 　　该模型通过几乎完整的FG-NUPs组合了最近解决的人类NPC的脚手架结构7。在我们的模型I中，我们不包括NUP153和POM121，其锚位置尚未置信度很高（请参见补充表2）。在我们的II模型中，我们包括NUP153和POM121（请参阅补充表3）。如所示，将FG-NUP嫁接到狭窄状态（PDB ID：7R5K）的NPC支架上，如所示7。NUP98仿真模型包括Glebs域，该结构域之外的残基段之外的距离在模拟或实验中探测了距离。 　　我们使用了Fene潜在的UFENE53来描述CG珠之间的无序FG-NUP，Lennard-Jones（LJ）相互作用ULJ以及潜在的限制NUP98链。总势能是 　　一对珠I和J之间的LJ电势的长度和相互作用尺度分别是并且分别是。后者通过热能KBT进行标准化，其中KB是玻尔兹曼常数，t是系统温度。我们固定了支架和FG珠之间的相互作用强度，这确保了链条不会粘在脚手架上。FG珠之间的相互作用强度均匀地给出。i，j = i+1的总和延伸到FG-NUP的粘合珠上。键收缩和拉伸由排斥的LJ和对数项控制，其最大键限为RFE =1.5σ，KFE = 80 kbt。为了模仿支架下方的膜包膜，我们在NUP98-FG和POM121-FG上施加了轴向限制，超过了RC =81σ= 48.6 nm的半径，其中和Kc = 80 kbt。 　　我们使用LAMMPS软件包75来模拟聚合系统。用langevin恒温器（在kbt = 1）用阻尼系数为10τ进行热效。我们为所有单体和特征时间尺度使用了均匀的质量。对于单链和冷凝水模拟，所有模拟的时间步骤均设置为0.01τ，而NPC模拟的时间步长为0.001τ。我们使用了带有四个不重叠块的块平均块来估计不确定性。在NPC支架附加的FG-NUP的MD模拟中，FG-NUP的残基移植到支架上（有关详细信息，请参见补充表2和3），脚手架本身被冷冻。 　　我们通过将单个NUP98 FG链的CG模型（1-499）与马提尼2.2水平的粗晶片77,78匹配，确定了键长σ。以几何可扩展性为重点，我们在遥远氨基酸之间的弱非键相互作用的极限工作。对于单链的马提尼式模拟，我们使用了α-尺度（α= 0.1）79，对于CG模型，FG珠之间的粘合强度较弱（= 0.1）。Martini MD模拟使用Gromacs 2020.6进行（参考文献80,81）。NUP98的前499个N末端氨基酸使用Martinize.py Python Script77,78转化为马提尼粗粒粒模型。建造了一个长度为30 nm的立方模拟盒，并用粗粒的马提尼酒和10％的抗冻水溶解。添加离子以中和系统。最初，使用速度缩放恒温器和Berendsen Barostat83在温度t = 300 k和压力p = 1 atm的情况下，分别在NVT和NPT集合中分别对系统进行了能量最小化，然后在NVT和NPT集合中平衡500 ns。恒温器的时间常数为1 ps，而Barostat的时间常数为5 ps，可压缩性为3×10-4 bar -1。对于在NPT集合中长期生产的长期生产，我们使用了速度缩放恒温器和帕林内罗 - 拉赫曼Barostat84，分别为1 ps和12 ps。如图9b所示，马提尼酒模型的端到端距离的概率分布在与带有CG模型的位置相同的位置，并且两个模型的平均端到端距离相等。在下文中，我们固定了Fene键长。 　　在第二步中，我们通过将模型与NUP98 FG链（1-499）冷凝物形成的测得的热力学特性相匹配，调整了FG珠（）之间的相互作用能量27,54。如图10a所示，在360×90×90σ3的模拟框中模拟了500个链条。我们调整了相互作用强度，以匹配NUP98 FG凝结物的实验测量浓度27,54（参见扩展数据图10b）。我们注意到，以这种方式，我们还非常适合稀释相的测得的浓度，从而获得了自由能。进行冷凝物和NPC系统的模拟分别超过1.8×106τ和6×104τ。我们使用VMD软件可视化所有Systems85。 　　我们计算了跨NUP98 FG链和模拟轨迹的标记位点之间的根平方距离，以与SMFRET和FLIM-FERT的实验进行比较。与实验一样，我们将一个位点保持固定（NPC中的NUP98的氨基酸位置221），并扫过C末端残基。对于孤立的NUP98 FG（1-499）链，结果显示在补充图9C中。我们发现，最好用NUP -NUP相互作用强度为0.5来解释实验，该强度主要在折叠状态下（补充视频8）。根据单链回旋的半径（补充图9a），线圈 - 圆锥形转变的中点为= 0.44。我们得出的结论是，水溶液中的分离的NUP98 FG链主要崩溃。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。