直接观察压电的构象状态

　　没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。 　　将密码子优化，合成并克隆到PCDNA3.1质粒中的小鼠压电1（E2JF22，UniProtkB输入）的编码序列已被密码子进行了优化。琥珀终止密码子（TAG）通过定点诱变，并用Q5位置定向的诱变试剂盒（新英格兰Biolabs）插入了著名的氨基酸位置。HALOTAG的编码序列是从PHTC Halotag CMV-Neo矢量（Promega）扩增的，并且MEOS3.2的编码序列从MEOS3.2-ER-5矢量（AddGene）放大。将链球菌II的编码序列（IDT）进行了高度优化和合成（IDT）。将HALOTAG和MEOS3.2序列与Strep-Tag II分别亚克隆到MPIEZO1-PCDNA3.1质粒中，并带有Nebuilder HIFI DNA组装套件（新英格兰Biolabs）。使用前通过全质粒测序验证每个质粒的序列。在Snapgene软件（Dotmatics）中查看并设计了所有DNA序列。 　　制备细胞并将其标记为IPALM和MINFLUX成像（扩展数据图2）。HEK293F细胞（Expi293，Thermo Fisher）在Expi293表达培养基（Thermo Fisher）中生长至每毫升1-2×106细胞的密度。始终，将细胞保持在37°C，在旋转器上以19毫米轨道直径的旋转器在125 rpm上摇动8％的二氧化碳。使用使用mycoalert支原体检测试剂盒（LONZA），证实了细胞不含支原体。转染前，将细胞以100克离心3分钟，将其换成含有250-500 µm的反式环流2-EN-赖斯碱（轴向异构体）（SICHEM）（SICHEM）的新鲜培养基，并转移到培养瓶中。使用40 kDa PEI（PolySciences）或Endofectin Expi293 Trection Fectiongent Reagent Reagent Reagent Reagent Reagent Reagent Reagent Reagent Reagent Reagent Reagent（GeneCopeia），将每个烧瓶以1：1的PNEU-HMBPYLS-4XU6M15和PIEZO1表达构建体的总浓度为2 µg ml-1转染。转染的细胞被允许表达24-36小时。然后将细胞迭代两次迭代并重悬于新鲜的培养基中，并培养30分钟，使多余的TCO*K与细胞弥漫。 　　为了标记细胞，将1.5×106个细胞移至1.5 ml eppendorf管，并使用含有最终浓度的1％W/V阻塞试剂（Sigma）（Sigma）或Roche Blocke Blocking Reagining Reagin（Roche）（Roche）的新鲜浓度（Rochma），将体积带到1 mL至1 ml。将细胞轻轻混合并在室温下阻塞3分钟，以100克离心2分钟，并重悬于expi293培养基中 + 1％w/v阻塞试剂 + 4 µM四氮嗪 - 雷克萨荧光647。细胞在室温下以偶尔的结束 - 固定式结束 - 端温固定结合了10分钟。为了去除多余的荧光团，将细胞固定并在expi293培养基 + 1％阻断试剂中洗涤3次，然后在未经阻断试剂的情况下进行一次Expi293培养基。在洗涤步骤中，非常注意尽可能温和。在Expi293培养基中，将细胞最终稀释至每毫升0.3×106细胞的浓度，并直接将其直接铺在盖玻片上。 　　在50 nm SiO2层（Hestzig）下，直径为25毫米的圆形盖板直径为25 mm（600±100 nm），首先是通过用100％乙醇洗涤并用纯净的空气干燥的。接下来，通过与1 M KOH孵育5分钟，将盖玻片的表面产生亲水性。将盖玻片用Milliq水洗涤，并再次用纯净的空气干燥。在EXPI293培养基中，标记的细胞在0.3×106细胞中，将400 µL铺在盖玻片上，并允许在细胞培养孵化器中37°C粘附在37°C的玻璃表面上15分钟。 　　粘附细胞后，用预热的37°C 1×汉克的平衡盐溶液（HBSS）洗涤，不具有Ca2+或Mg2+，并固定在预热的37°C 1×HBS中，含有0.8％多聚甲醛（PFA）（PFA）和0.1％Glutararaldehardehyde。在此阶段特别注意将溶液轻轻移动，以免机械地干扰细胞。将细胞洗涤并在含有50 mM Tris（pH 7.4）的1×HBS中淬灭5分钟，然后在1×HBSS中广泛洗涤。 　　将盖玻片交换为等渗成像缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0），10 mM NaCl，3.33％的葡萄糖，100 mM Cysteamine，40 µg mL-1牛肝催化酶和100 µg ML-1葡萄糖氧化酶的葡萄糖氧化酶，然后用Aspergillus Niger frol frol frol frol frol frol vims vims and-Flinigraive and-prance vims and-typer vims and-typer vii and）通过5分钟环氧树脂（ITW性能聚合物）和凡士林（联合利华）使用KOH处理的盖玻片和密封。如前所述26，将盖玻片安装在显微镜上。准备细胞并在同一天成像。 　　简而言之，在IPALM显微镜的成像场中分离了1-2个细胞，并如前所述使用嵌入的金基金会校准该仪器。如前所述，使用自定义LabView软件进行成像26。为了捕获Alexa Fluor 647的眨眼，用30毫秒的暴露和3 kW cm-2 640 nm激发样品成像，使用三个EMCCD摄像头（IXON 897，ANDOR）捕获的60,000帧。尽管由于有效的标记效率低下和图像登记误差而未用于下游体系结构分析，但C末端标记的MEOS3.2也以561 nm激光激发和405 nm激光激活为20,000–120,000帧，以561 nm的激光激活进行成像。 　　如前所述26，使用PeakSelector（G. Shtengel和H. Hess，Hody Hughes Medical Institute，https://github.com/gleb-shtengel/peakselector）进行图像重建。嵌入在盖玻片中的金纳米颗粒被用作校准，对齐和转化为单个3D图像的基准标记。从数据中滤除了估计的X/y不确定性估计的X/y不确定性（或纳米当量）的定位。仅包括小于150 nm的盖玻片基金会的定位来分离在质膜上或附近发现的定位。将本地化作为ASCII文件导出，并将总的原始定位数据导出为TIFF文件。自定义MATLAB软件用于通过识别总原始数据图像中的珠子并消除ASCII文件中相应的珠子定位（扩展数据图4B）来删除基准珠的本地化。 　　使用标准设置在PeakSelector中以每个像素为3 nm的预处理本地化的汇总Z预测，并作为TIFF文件保存。将渲染的图像和包含预处理位置的ASCII文件加载到MATLAB中，并鉴定并分割了候选三标记的Piezo1分子。首先，在渲染图像中发现了峰，该峰通过第一个带通滤波数据并使用Crocker和Grier的算法67来识别峰来识别峰。接下来要进行峰值进行最近的邻居分析，要求每个荧光团位置必须具有两个邻居，其中心位置分开超过9和60 nm，并且群集中的每个峰都距离其他任何局部位置大于60 nm。然后将每个渲染的候选压电分子连接到相应的位置，并将局部化分段到单个颗粒中（扩展数据图4C）。通过使用求和的z投影，该方法仅限于X – Y平面中的分割。为了去除Z中的无关局部定位，从每个粒子中除去了距离粒子平均值超过75 nm的任何位置。 　　接下来，每个分段粒子都被送入Heydarian等人28的无模板单粒子平均工作流程中。简而言之，用于扫描方法用于确定分段粒子之间全能的注册过程的最佳比例参数为5 nm。阈值1用于LIE代数一致性检查的五个迭代，该检查用于形成数据驱动的模板并创建一组初始的对齐粒子。添加了一个额外的处理步骤，以将这些初始排列的颗粒旋转到X -Y平面中，然后通过旋转每个最初的粒子通过2×π/3的随机整数因子来促进三倍的对称性。然后使用这些对称启用的粒子在引导步骤中创建最终的超级粒子，该步骤将每个粒子与数据驱动的模板进行了比较。 　　通过使用MATLAB函数MVKSDSICTY和2.5 nm的带宽来，通过计算最终超级粒子的内核密度估计值来可视化超级粒子（图1C，D和2C以及扩展数据图5）。绘制粒子中的局部化，尺寸和颜色与局部密度成正比。 　　通过在1％的Hellmanex III洗涤剂（Hellma GmbH）中煮沸，在水浴中煮沸10分钟，清洁了直径1.5圆形玻璃盖（华纳仪器）18毫米直径的直径10分钟。将盖玻片在Milliq水中洗涤五次，在1 M KOH中超声处理10分钟，然后在Milliq水中再次洗涤。将盖玻片交换成100％乙醇，并在室温下储存长达1周。 　　在电镀之前，将盖玻片用纯化的空气干燥。在Expi293培养基中，每ML细胞悬浮液的0.3×106细胞中，将207 µL铺在盖玻片上，并允许在细胞培养孵化器中37°C粘附在37°C的玻璃表面上15分钟。将细胞洗涤并固定为IPALM成像。 　　对于GSMTX-4实验，将板条细胞用1×HBS洗涤，然后在室温下与20 µM GSMTX-4（ABCAM）一起孵育5分钟。完全去除溶液并固定（预热的37°C 1×含有0.8％PFA和0.1％戊二醛的HBS），但请轻轻添加。允许细胞固定10分钟并在HBSS中洗涤。 　　为了富集质膜，基本上如前所述进行了富集45。简而言之，在DMSO中溶解至150毫米的新鲜的玛格酸（Nu-Chek Prep）。在最终浓度为300 µm的情况下，将玛格丽酸汤添加到温暖的expi293培养基中。将培养基交替涡旋，超声和在37°C下孵育，直到完全溶解。转染六个小时后，将培养基换成富含人口可精的培养基。在准备成像之前，将细胞培养18小时。 　　对于YODA1实验，将10 mM Yoda1（Tocris）的库存溶液添加到预热的37°C 1×HBSS中，最终浓度为50 µm。将溶液全速涡旋45 s，以完全溶解Yoda1。将细胞用1×HBS洗涤，并立即添加YODA1。将细胞在室温下孵育5分钟。接下来，除去溶液并固定（预热的37°C 1×HBS，含有0.8％PFA和0.1％戊二醛），含有50 µM Yoda1，但又轻轻地添加了。允许细胞固定10分钟并在HBSS中洗涤。 　　对于渗透肿胀实验，将板条细胞用1×HBS洗涤，然后暴露于120个MOSM修饰的Ringer溶液（48.8 mm NaCl，5 mM KCl，10 mM HEPES（pH 7.40）和10 mm -Glucose），在房间温度下为2.5分钟。接下来，将细胞轻轻交换成低音固定剂（120个MOSM修饰的Ringer，0.8％PFA和0.1％戊二醛）。允许细胞固定10分钟，并在120个MOSM修饰的Ringer溶液中广泛洗涤。所有溶液的渗透压均确定为具有蒸气压驱动器的±5 MOSM。 　　固定和洗涤后，将150 nm的金纳米圈基准（BBI溶液）应用于盖玻片上，并在室温下孵育5分钟。然后将盖玻片用HBS洗涤。 　　为了进行成像，除了20 mM Cysteamine以外，将细胞交换为等级成像缓冲液，除非IPALM。将盖玻片放在装有一个装有成像缓冲液的腔井（Globe Scientific）的玻璃载玻片上，然后按下以去除多余的缓冲液。然后使用Elite Double 22牙齿环氧树脂（Zhermack）将盖玻片密封到载玻片上。 　　为了获得清洁剂 - 溶解的小鼠压电蛋白，将expi293细胞用MPIEZO1-N-TANDEM Histag-tandem-histag-tag103-c-Halotag-twinstrep用PNEU-HMBPYLS-4×U6M15转染，中的30 ml培养在包含500 µm TCO*k的30 ml培养中。12–16小时后，将细胞用7 mL的培养基和丁酸钠喂入最终浓度为5 mM。48小时后，将细胞颗粒并重悬于新鲜的Expi293培养基中，并培养了一个小时，以使多余的TCO*K与细胞扩散。然后通过100克颗粒洗涤细胞，并在含有1×停止蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher）的冰冷的1×HBS中重悬于两次。将细胞在1,000克时最后一次颗粒，去除上清液，并将细胞沉淀在液氮中闪烁，并储存在-80°C下。 　　为了纯化蛋白质，将冷冻细胞颗粒直接重悬于冰冷的溶解缓冲液中（25 mM HEPES，150 mM NaCl，2 mM DTT，1％C12E9和1×Halt Halt蛋白酶抑制剂）。将混合物在4°C下旋转1小时，以溶解膜蛋白，并在45,000g下在4°C下以45,000克离心30分钟，以使颗粒非溶质碎屑和聚集体。将上清液加载到包含1毫升沉降的Talon金属亲和力树脂的柱上，并用洗涤缓冲液（25 mM HEPES，150 mM NaCl，2 mM DTT，0.1％C12E9和1×Halt Prot蛋白酶抑制剂）和His-Tagged Piezo1蛋白均与Hiss-Tagged Piezo1蛋白结合。用30 mL洗涤缓冲液洗涤树脂后，加盖了柱，并加入300 µL洗涤缓冲液，其中含有4 µM四嗪 - Alexa Fluor 647。重悬树床并在室温下孵育10分钟，远离光线。在没有蛋白酶抑制剂的情况下，将树脂在洗涤缓冲液中广泛洗涤。该蛋白在25 mM HEPES，150 mM NaCl，2 mM DTT，0.1％C12E9和200 mM咪唑中洗脱。然后将洗脱器直接加载到包含1 ml链霉素塞彭糖树脂的柱上，并用洗涤缓冲液洗涤。结合后，将树脂用30 mL洗涤缓冲液洗涤，并在含有25 mM生物素的洗涤缓冲液中洗脱。洗脱器以5,000克的速度将50 kDa分子量截止柱集中在5,000克的氨基甲基上，并用洗涤缓冲液洗涤两次。最后，使用两个40 kDa分子量截止Zeba脱盐柱进行了缓冲液，用洗涤缓冲液进行了脱位。使用A280在纳米体（Thermo Fisher Scientific）上对蛋白质浓度进行定量，分成等分试样，在液氮上闪烁，并存储在-80°C下。 　　购买了22×22毫米的玻璃盖板，用稀疏的生物素化PEG刷（微孔）预应力（微孔）。给定涂层密度，刷子表面上生物素之间的平均距离约为112 nm，与群集算法用于识别三标记的压电相同。所有步骤均在室温下执行。首先，将盖玻片与未稀释的150 nm金纳米圈基准（BBI溶液）孵育20分钟。这些金纳米球稀疏地结合在钉子刷表面上的缺陷中，但密集得多，以至于至少可以在Minflux显微镜上稳定的视野中找到至少两个金质基。然后将盖玻片用固定缓冲液（25毫米HEPE（pH 8.0），150 mM NaCl，2 mM DTT，0.1％C12E9和1％Roche阻断试剂）很好地洗涤，并在该缓冲液中孵育15分钟以阻止任何未通透的站点。接下来，将非官能化的链霉素-XX（IBA Lifesciences）稀释至100 nm的固定缓冲液，在室温下添加到盖玻片上7分钟，以粘附在PEG刷上的生物素，并用固定型缓冲液良好地洗涤覆盖物，以去除过量的链霉菌素。将闪光蛋白融化在冰上，在固定缓冲液中稀释至20 nm，并应用于盖玻片上。允许将链球菌标记的压电与固定的链霉素-XT结合10分钟，并再次在固定缓冲液中彻底洗涤盖玻片。然后将蛋白质交换成并用固定缓冲液洗涤，该缓冲液含有没有Roche阻断试剂（25 mM HEPES（pH 8.0），150 mM NaCl，2 mM NaCl，2 mM DTT和0.02％GDN）的固定缓冲液。 　　The coated coverslip was placed onto a glass slide containing a cavity well (Globe Scientific) filled with imaging buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10% glucose, 0.02% GDN, 20 mM cysteamine, 40 µg ml−1 catalase from bovine liver and 100 µg ml−1 glucose oxidase from A. niger, type VII) and压下以去除多余的缓冲区。然后使用Elite Double 22牙齿环氧树脂（Zhermack）将盖玻片密封到载玻片上，并安装在Minflux显微镜上。如上所述进行成像。 　　使用带有Minflux驱动程序的IMSpector软件（Abberior Instruments），在商业Minflux 3D显微镜上获取了所有MinFlux数据。选择了三个或三个或更多的金基金来稳定的视野。使用金牌基金会和主动反馈校正的近红外散射的主动稳定系统用于锁定选择的空间设定点。可以确保在每个AXIS32中，相对于MinFlux界面软件设置的稳定设定点的测量样品位置的平均标准偏差小于3 nm。选择了细胞底部的25–225 µm2视场进行MINFLUX成像。在视野内，超过50％的可见荧光团被用640 nm激光器以2-4％的功率驱动到黑暗状态。样品用6％640 nm激光功率成像，在整个成像过程中，手动提高了9％。然后，在几个小时内将405 nm激光功率从0逐渐增加到12–18％。将样品成像为12-48小时。对于每种条件，对至少三个独立的生物学和实验重复进行了成像。在样品平面处测量640 nm激发激光器的每百分比设置功率约为4.30 µW，并且在样品平面上测量了405 nm激活激光激光仪约为每百分比设置的功率。请注意，在MINFLUX靶向程序中，激光功率在上次迭代中的最终倍数升至六个。 　　从最后一个定位迭代中的原始最终有效本地化直接从Minflux Imspector接口导出为.mat文件。然后，使用自定义MATLAB分析软件来识别和隔离三个本地化的群集。为了尽可能一致且无偏见，除一种特殊情况外，所有数据均以相同的参数进行分析（见下文）。首先，对数据进行过滤以删除超过10 nm的标准偏差，并包含每个迹线三个以上的局部偏差。此步骤从背景和较大条纹中取出了局部化，这可能是由于扩散的荧光分子穿过成像平面。接下来，基本上如前所述33。该算法使用两步的DBSCAN聚类（MATLAB中的DBSCAN2），然后是期望最大化的GMM，将3D局部化分配给荧光团的位置。在这里，第一个DBSCAN步骤的epsilon为30 nm，需要五个邻居才能获得核心点（分子= 5）。第二个DBSCAN步骤的Epsilon为6-7 nm，具体取决于数据中的噪声量，分布= 5。初始GMM Fit Sigma设置为5 nm。荧光团中心位置估计为GMM拟合的平均值。 　　然后，将每个鉴定出的荧光团位置都进行分开的DBSCAN聚类和最近的邻居分析步骤。DBSCAN步骤确定了三个荧光团位置的簇，具有EPSILON = 100 nm，MINPTS = 3。最近的邻居步骤要求每个荧光团位置必须具有两个邻居，并且它们的中心位置在6至50 nm之间分开。在特殊情况下，对于图4B，将最近的邻居步骤调整为最小和最大距离，分别在5和60 nm之间，以捕获互相距离，该距离略长于50 nm。请注意，在单元格中在位置103处测得的最可能的互相距离与50 nm的最大邻居距离相同（图2E和4B）。接下来，分割了三个荧光团位置的簇。根据原始局部化的分布，对数据进行了Z过滤，以仅分离质膜结合的压电分子。最后，将含有超过120°的互轴角的候选簇滤出以消除非特异性痕量条纹。对于每个鉴定出的三个分子簇，平均相互距离是从荧光团中心位置直接计算的。 　　首先，从压电1（Uniprot进入Q8CD54）和Piezo2（UniProt进入EJ2F22）氨基酸序列中分离出压电重复域5的序列位置。使用结构作为指导鉴定了跨膜结构域，并将其分为不同的链（补充文本）。使用PDBEPISA工具43计算了Piezo重复结合能。对于每个结合界面，与每个压电重复域的接触，在有或没有细胞外回路的贡献的情况下，确定了接触每个压电重复域的每个结合界面，确定了界面-ΔG时的总溶剂化自由能增益。 　　从蛋白质数据库（PDB）获得了来自冷冻EM的结构模型，并在文章中注明了PDB登录号。为了生成三聚体Alphafold II模型，将单体E2JF22预测超级置于PDB 6B3R的三个Piezo1亚基上。由于相对于AlphaFold模型中的压电叶片缺乏限制，因此将CED删除，而未包括在结构分析中。 　　将细胞完全按照Minflux成像制备，但将1 µM的细胞 - 佩里亚荧光549 – HALO配体（Promega）添加到四嗪 - 埃拉克斯荧光647标记混合物中。所有图像（扩展数据图2B）均在具有NIS Elements软件和图像设置（激光功率，增益，分辨率，分辨率，像素式停留时间，×60 1.4 Na Na Na Imimion Immersion Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Apolomat目标和像素尺寸设置）上获取的尼康AX共聚焦显微镜和图像设置（激光功率，增益，分辨率，pixel停留时间）在所有条件下都相同。对于所有图像，将亮度和对比度调整均匀地应用于整个图像。 　　For verification of proper function of tagged proteins, TAG-substituted PIEZO1 constructs and pNEU-hMbPylRS-4×U6M15 were transfected at a 1:1 ratio in the presence of 250 µM TCO*K with Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) into Piezo1-knockout HEK293 cells (CRL-3519, American Type Culture Collection) plated onto聚赖斯涂层的盖玻片。对于野生型对照实验，MPIEZO1-IRES-EGFP（质粒＃80925，Addgene）与PNEU-HMBPYLS-4×U6M15以1：1的比率共转染。根据美国类型培养物的指南培养细胞，并通过使用mycoalert支原体检测试剂盒（LONZA）验证将不含支原体。记录之前，允许细胞表达24-48小时。 　　对于标记细胞的实验，首先将细胞用DMEM和20 mM Hepes洗涤。所有标签均在室温下进行。接下来，将细胞在DMEM，20 mM HEPES和1 mg ML -1 Roche阻断试剂中被阻塞5分钟。阻塞后，将细胞用DMEM，20 mM HEPE，1 mg ML -1 Roche阻断试剂和4 µM四嗪 - Alexa Fluor 647标记10分钟。然后将细胞用DMEM，20 mM HEPES和1 mg ML -1 Roche阻断试剂洗涤，并交换为DMEM和20 mM HEPES。在荧光显微镜上可视化确认了标记。 　　使用Multiclamp700A放大器和Digidata1550（Molecular Devices）（Molecular Devices）以HEK293 Piezo1-Knockout细胞的机械激活电流记录在全细胞电压夹模式下，并使用PCLAMP软件（版本10.7）直接存储并在线存储并在线数字化。在-80 mV下记录电流，以20 kHz采样，并以2 kHz过滤。当填充基于CSCL的细胞内溶液时，记录电极的电阻为1.5–3MΩ：133 mM CSCL，1 mM CaCl2，1 mM MGCL2，10 mm HEPES（带CSOH），5 mm EGTA，4 mm MG-MG-ATP和0.4 mm Mg-ATP和0.4 mm Na-Gtp。细胞外浴溶液由133 mM NaCl，3 mM KCl，2.5 mm CaCl2，1 mM MGCl2，10 mm HEPES（带有NaOH的pH 7.3）和10毫米葡萄糖组成。使用与记录的细胞相关的角度为80°，距离细胞约5 µm，使用火抛光的玻璃移液器（尖端直径为3-4 µm）来实现机械刺激。探针向细胞的位移是由夹克控制的压电晶体微层（E625 LVPZT控制器/放大器，Physik Instrumente）驱动的。探针的速度为1 µm ms -1在朝向运动的斜坡阶段，刺激的持续时间为125毫秒。对于每个单元，每10秒以5 µm的初始位移，每10 s应用每10秒以1 µm增量的速度进行一系列机械步骤。探针尖端明显接触细胞的步骤被用作确定明显阈值的基线（上方触摸观察到第一个响应的细胞的微米）。 　　将位移步骤（0.5 µm增量）的家族应用于细胞，并将机械激活的电流记录到阈值响应以上的2–3 µm，以避免丢失细胞。将YODA1从DMSO中的20 mm储备溶液中稀释，积极地进行涡旋，并在5分钟内使用以避免溶液中的沉淀。手动施用Yoda1（10 µm），而无需沐浴灌注，并将细胞暴露5分钟，然后冲洗。在Yoda1之前获得了两次机械活化电流的家族，在Yoda1中进行了两次至3次，在冲洗过程中多次获得。 　　对于YODA1和低渗电生理学，将Swell1-Knockout HEK293F细胞68培养在Freestyle 293培养基中，并保持与Expi293细胞一样。使用mycoalert支原体检测试剂盒（LONZA）证实了细胞不含支原体。用MPIEZO1-IRES-EGFP（质粒＃80925，Addgene）转染细胞，使用浓度为1 µg mL-1的内fotin 293转染试剂（Genecopeia）转染细胞。在记录之前，允许细胞表达48小时，并将其铺在聚赖氨酸涂层的玻璃盖上。 　　使用Axopatch 200B放大器和Digidata 1440a（分子设备）记录全细胞电流，并使用PCLAMP（版本10.2）进行分析。在+80 mV处记录电流，以20 kHz采样，并以2 kHz过滤。将记录电极拉动并抛光至初始电阻为4-8MΩ时，填充了含有以下几点的移液器溶液：110 mM CSCL，40 mM CSF，10 mM EGTA和20 mM HEPE（pH 7.4）。 　　对于YODA1实验，浴溶液包含以下内容：140 mM NaCl，2.4 mM KCl，10 mM HEPES（pH 7.4），10 mM-葡萄糖，4 mM MGCL2和4 mM CACL2（307±5 MOSM）。用在浴溶液中制备的50 µm Yoda1唤起响应。 　　对于渗透肿胀实验，浴溶液中含有40 mM NaCl，2.4 mM KCl，10 mM HEPES（pH 7.4），10 mM -glucose，4 mM MGCL2、4 mM CaCl2、4 mM CaCl2和185 mm -MM -MANNITOL（310 MOSM±5 MOSM）。用含有40 mM NaCl，2.4 mM KCL，10 mM HEPES（pH 7.4），10 mM-葡萄糖，4 mM MGCL2和4 mM CaCl2（122±5 MOSM）的低音浴溶液诱发反应。所有溶液的渗透率均以蒸气压渗透压计（Wescor）测量。 　　可视化数据，并在MATLAB（MATHWORKS）和PRISM（GraphPad）软件中进行统计测试。分子结构在Molstar查看器（https://molstar.org/viewer/）和Chimera（UCSF）软件中可视化。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。