CCNE1扩增是合成的致死性的，具有PKMYT1激酶抑制作用

　　所有细胞系在37°C和5％CO2下生长。rpe1-htert tp53 - / - cas9（Ref.9）和rpe1-htert tp53 - / - cas9 pkmyt1 - / - 细胞在DMEM（life Technologies Catalog（Cat。）no。11965-092）中生长，具有10％fbs（WISENT CAT。猫。rpe1-htert cas9 tp53 - / - pkmyt1 - / - 细胞是通过用pKMyt1-7 sgrNA靶向外显子4的父母细胞系构建的，通过限制稀释来产生单细胞克隆。使用Western印迹证实了两个克隆为PKMYT1 - / - （Clone J3.38和J3.43）。rpe1-htert tp53 - / - cas9 ccne1-high细胞系是通过将CCNE1-2A-GFP的PiggyBac转座构造的，并选择具有中端GFP表达的克隆。FT282-HTERT TP53R175H野生型（空载体）和CCNE1高细胞系从R. drapkin24中获得，并在DMEM：F-12（1：1）中培养（Life TechnologiesCat。No。11330-032），为5％FBS，1％UltroSerg LifeScences CAT和1％caltecences cat。青霉素 - 链霉素。FT282-HTERT TP53R175H CCNE2，MYBL2和CCNB1过表达细胞系也通过CCNE2-2A-GFP的PiggyBac转座构建，MYBL2-2A-GFP或CCNB1-2A-GFP或CCNB1-2A-GFP与高GFP表达具有高级GFP表达的克隆群体的选择。FT282-HTERT TP53R175H PCNA-CB-TAGRFP表达细胞系（野生型和CCNE1高）被PCNA-CB-TAGRFP慢病毒颗粒转导，并选择了高RFP表达RFP的细胞。将293T细胞（ATCC）培养在具有10％FBS和1％青霉素链霉素的DMEM中。将HEK293T细胞（ATCC）培养在DMEM中，含10％FBS和1％青霉素 - 链霉素。HCC1569细胞（ATCC）在RPMI 1640（Life Technologiescat。No。118575-093）中培养，为10％FBS和1％青霉素 - 链霉菌素。在RPMI 1640中培养SNU8细胞（KCLB），其FBS 10％，1％青霉素 - 链霉素，25 mM HEPE。OVCAR3细胞（ATCC）在RPMI 1640中以20％的FBS培养 1％青霉素 - 链霉素和0.01 mg ml-1胰岛素。在RPMI 1640中培养A2780细胞（Sigma），其中有10％FBS和1％青霉素 - 链霉菌素。在HAM的F12（Life TechnologiesCat。No。11765-054）中培养了SUM149PT细胞（Asterand Bioscience），其5％FBS，10 mM HEPES，1％青霉素 - 链霉素，1μgML-1-1μgml-1 -1氢化皮质酮和5μgMl-1胰岛素。在45％的RPMI 1640中培养KYSE30细胞（DSMZ），其中45％HAM的F12，10％热灭活的FBS和1％青霉素 - 链霉素。将TOV112D细胞（ATCC）培养在42.5％MCDB 105，42.5％培养基199（Life TechnologiesCat。No。11150-059）中，15％FBS和1％青霉素 - 链霉菌素。在RPMI 1640中培养NUGC3细胞（JCRB），其中有10％FBS和1％青霉素 - 链霉素。将COV362细胞（Sigma）培养在DMEM中，含10％FBS和1％青霉素 - 链霉素。将DOTC24510细胞（ATCC）培养在DMEM中，含10％FBS和1％青霉素 - 链霉素。接收后所使用的细胞系未经过身份验证。所有细胞系都使用mycoalert均对支原体污染进行了阴性。OVCAR3和HCC1569细胞已显示为放大CCNE149,50，而SNU8已显示为CCNE1拷贝数增益（CCLE DATABASE（https://portals.broadals.broadins.broadinstitute.org/ccle/ccle））。据报道，由于FBXW7突变51，SUM149PT细胞具有较高的细胞周期蛋白E水平，但是我们使用的克隆不会显示此细胞周期蛋白E的增加（扩展数据图9A）。 　　对于CRISPR – CAS9基因组编辑，SGRNA被克隆在Lenticrisprv2或Lentiguide NLS – GFP中，如所述52。对于细胞中的PKMYT1过表达，将N端3×标记的PKMYT1开放阅读框（CCDS10486.1）克隆到PDONR221网关进入载体（Thermo Fisher Scientific，12536017）中。PCR进行诱变，以生成PKMYT1 SGRNA抗性版本，该版本具有核苷酸966和981（tgagttcactgccggt to CgaAttTaccGCTGGC）和激酶死突变n238a之间的核苷酸突变。通过网关技术将PKMYT1编码序列传输到用于转导的电池转导的目标矢量PCW57.1（Addgene＃41393）。对于细胞中CDK1突变体的表达，使用ECORI和BAMHI限制酶合成CDK1（T14A/Y15AF）–GFP的编码序列（T14A/Y15AF）–GFP –GFP。然后进行诱变，将每个磷酸材料还原回野生型氨基酸，以创建CDK1 -GFP，CDK1（T14A）–GFP和CDK1（Y15F）–GFP。对于延时细胞周期显微镜，从具有ECORI和BAMHI限制位点序列扩展的PCCC-TAGRFP（Chromotek）放大了PCNA-胶体杆菌-TAGRFP插入物，然后克隆到PHIV-NAT-HCD52载体中。这项研究中使用的SGRNA序列包括在补充表5中。 　　Lentiviral particles were produced in 293T cells in 10-cm plates by co-transfection of 10 μg of targeting vector with 3 μg VSV-G, 5 μg pMDLg/RRE and 2.5 μg pRSV-REV (Addgene #14888, #12251 and #12253) using calcium phosphate.培养基在12-16小时后刷新。转染后36-40小时收集含病毒的上清液，并通过0.2μm滤波器清除。在聚甲烯（Sigma-Aldrich，4μgml-1 RPE1-HTERT TP53 - / - CAS9和16μgml-1 FT282-HTERT TP53R175H）的情况下，进行病毒转导。< 1. 　　Primary antibodies used in this study include: histone H2A.X (phospho-S139, Cell Signalling Technologies cat. no. 2577, 1:500 for immunofluorescence), histone H2A.X (phospho-S139, Millipore Sigma cat. no. 05-636, 1:500 for immunofluorescence), CDK1 (Thermo Fisher Scientific cat. no. 33-1800, 1:1,000 for immunoblot and ELISA), CDK1-phosphoT14 (Abcam cat. no. ab58509, 1:1,000 for immunoblot and ELISA), CDK1-phoshoY15 (Cell Signaling Technology cat. no. 9111, 1:1,000 for immunoblot), PKMYT1 (Bethyl A302-424A, 1:1,000 for immunoblot), Histone H3-phosphoS10 (Cell Signaling Technology cat. no. 9706, 1:500 flow cytometry), lamin A/C (Cell Signaling Technology 4C11 cat. no. 4777, 1:500 for immunofluorescence), lamin A/C-phosphoS22 (Cell Signaling Technology D2B2E cat. no. 13448, 1:500 flow cytometry and for immunofluorescence), cyclin B1 (Cell Signalling Technologies cat. no. 2577, 1:500 for immunofluorescence, 1:1,000 for immunoblotting), α-tubulin (Millipore DM1A CP06, 1:4,000 for iimunoblotting), CDK2 (Upstate 05-596, 1:1,000 for immunoblotting), cyclin B1-phosphoS126 (Abcam ab55184, 1:500 for immunofluorescence), MCM2 (BD Biosciences 610700, 1:250 for immunofluorescence), MCM4 (Novus Biologicals H0004137-B01P, 1:500 for immunofluorescence), CHK1-phosphoS345 (Bethyl 2348, 1:1,000 for immunoblotting), cyclin E1 (Abcam ab3927, 1:1,000 for immunoblotting or Cell Marque cat. no. AC0120RUO 1:1,000 for immunohistochemistry), α-actinin (Millipore Sigma 05-384, 1:1,000 for immunoblotting), vinculin (Cell Signaling 13901S, 1:1,000 for immunoblotting), MYBL2 (Millipore MABE886, 1:1,000 for immunoblotting), MYBL2-pT487 (Abcam ab76009, 1:500 for immunoblotting). The following agarose-coupled antibodies were used for immunoprecipitation in kinase assays: CDK1 (Santa Cruz sc-54 AC) and CDK2 (Santa Cruz sc-6248 AC). The following secondary antibodies were used for immunoblotting: anti-mouse Irdye 800CW, anti-rabbit IRdye 680RD (926-32210 and 926-68071; LiCOR, 1:5,000), anti-mouse IgG–horseradish peroxidase (HRP) (Cedarlane cat. no. NA931-1ML, 1:4,000), anti-rabbit IgG–HRP (Cedarlane cat. no. 111-035-144, 1:4,000), anti-rabbit IgG–HRP (abcam 97051, 1:10,000). The secondary antibody used for ELISA was anti-rabbit IgG–HRP (Jackson Immunoresearch cat. no. 111-035-144). The following secondary antibodies were used for immunofluorescence and flow cytometry: AlexaFluor 488 donkey anti-rat IgG (Thermo Fisher Scientific A21208, 1:1,000), AlexaFluor 647 donkey anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific A31571, 1:1,000), AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific A11029, 1:1,000), AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (Thermo Fisher Scientific A21244, 1:1,000). Finally, the following secondary antibodies were used for AlphaLISA assays: AlphaLISA anti-rabbit IgG Acceptor beads (Perkin Elmer cat. no. AL104C) and AlphaLISA anti-mouse IgG Donor beads (Perkin Elmer cat. no. AS104D). 　　Short interfering RNA (siRNA) oligonucleotides (siCTRL ON-TARGET Plus D-001210-03-50 and siCCNB1 ON-TARGET Plus L-003206-00-0005; Dharmacon) were transfected in Opti-MEM reduced-serum medium using Lipofectamine RNAiMAX agent (Thermo Fisher Scientific cat. no. 13778-075) following the manufacturer’s recommended protocol. Fresh medium was added to cells 16 h after transfection. Cells were used for high content imaging and immunoblotting 48 h after transfection. 　　The following drugs were used in the course of the study: RP-6306 (this study), RP-6421 (this study) AZD1775 (Selleckchem, S1525), dinaciclib (MedChemExpress, HY-10492), PF-06873600 (MedChemExpress, HY-114177), RO-3306 (Selleckchem, S7747), gemcitabine (Cayman Chemicals, 9003096) and hydroxyurea (Sigma-Aldrich cat. no. H8627). Synthesis of RP-6306 and RP-6421 is described in the Supplementary Information. Concentration and duration of treatment is indicated in the legends of the corresponding figures. 　　CCNE1-overexpression synthetic lethality screens were conducted as three parallel screens with a parental cell line and two isogenic clones overexpressing CCNE1 (C2 and C21). For the screens, RPE1-hTERT Cas9 TP53−/− parental and RPE1-hTERT Cas9 TP53−/− CCNE1-overexpressing clones were transduced with the lentiviral TKOv2 sgRNA library at a low MOI (about 0.3) and medium containing 20 μg ml−1 puromycin (Life Technologies) was added the next day to select for transductants. The following day, cells were trypsinized and replated in the same plates while maintaining puromycin selection. Three days after infection, which was considered the initial time point (t0), cells were pooled together and divided into two sets of technical replicates. Cells were grown for a period of 18 d and cell pellets were collected every 3 d. Each screen was performed as a technical duplicate with a theoretical library coverage of ≥400 cells per sgRNA maintained at every step. Genomic DNA was isolated using the QIAamp Blood Maxi Kit (Qiagen) and genome-integrated sgRNA sequences were amplified by PCR using NEBNext Ultra II Q5 Master Mix (New England Biolabs). i5 and i7 multiplexing barcodes were added in a second round of PCR and final gel-purified products were sequenced on an Illumina NextSeq500 system at the LTRI NBCC facility (https://nbcc.lunenfeld.ca/) to determine sgRNA representation in each sample. Later, another screen was conducting using the next-generation TKOv3 library in RPE1-hTERT Cas9 TP53−/− parental and RPE1-CCNE1 (C2) cells using the same procedure outlined above. 　　The RP-6306 resistance screen was performed in two FT282-hTERT TP53R175H CCNE1-high clones (C3 and C4) using TKOv3 sgRNA library at a MOI about 0.3. The screen was conducted in technical duplicates, and library coverage of >每个步骤都保持每个SGRNA的100个单元。在感染后2天加入含紫霉素的培养基（2 µg mL-1）以选择转导剂。选择持续到感染后96小时，这被认为是初始时间点（T0）。从第6天（T6）以对应于单个LD80的剂量（分别为40 nm和80 nm的克隆C3和C4），将RP-6306添加到细胞中。从T10开始，将RP-6306剂量调整为克隆的60 nm，随后在T12，T16和T18中刷新了含药物的培养基。屏幕以T21终止。为了鉴定缺失引起对RP-6306的抗性的基因，从存活的细胞中分离出基因组DNA并如上所述进行处理。使用先前描述的https://github.com/hart-lab/drugz进行了样本数据分析。 　　CRISPR依赖性数据14,53（CERES分数）和基因级副本编号Data54使用Broad Institute的DepMap门户从2021 Q1 DEPMAP发布中下载。如果细胞系的拷贝数值大于1.58（相对于倍磁相对于倍元，则为“ wt”，则将其表征为“ CCNE1扩增”，如果它们的拷贝数值大于2×总拷贝数），则“ wt”的拷贝数值小于或等于1.58；从分析中删除了没有CCNE1拷贝数数据的细胞系。从依赖关系数据集中的总共808个细胞系中，删除了6个，将20个分类为CCNE1扩大，并将782个分类为WT。Wilcoxon秩和测试用于比较两组之间每个基因的依赖性得分。在图1b中，基因耗竭的中值差异绘制在X轴上与Y轴差异的标称P值。提供了标称P值。分析的结果可以在源数据中以表格格式找到。 　　将细胞接种在6孔板中，RPE1的300个细胞为300个细胞，而400个细胞为FT282。单细胞长大，直到每个菌落形成大于50个细胞的不同菌落。将菌落用PBS冲洗，并在20％（v/v）甲醇中用0.4％（w/v）的晶体紫色染色30分钟。将污渍吸出，并用双倒数的H2O冲洗两次板并进行气干。使用Gelcount仪器（牛津Optronix，Gelcount）计数菌落。 　　RPE1-HETT CAS9 TP53 - / - ，FT282-HTERT TP53R175H及其各自的CCNE1-高异构对生成对96孔板（CorningCat。No。5595）在96孔的板中播种，以RPE1-HTERT CAS9 TP53 tp53 tp53-ccc9 tp53-ccc9 tp53-ccc9 tpec9 ppe cat。所有其他。24小时后，使用自动D300E数字分配器（TECAN）以0.15 nm至3 µm的含量处理细胞。每3-4天对培养基和药物进行一次刷新，并使用Incucyte S3 Live细胞成像仪（Sartorius）对细胞汇合进行了高达6次的双倍次数。相对于未经处理的对照的百分比汇合度用于评估测试化合物诱导的生长抑制作用。使用在线Synergyfinder v2.0工具55分析了RP-6306与羟基脲或吉西他滨之间的协同作用。 　　将细胞接种到玻璃盖板上，并如图传说中所示。在收集之前，将细胞用20μMEDU（5-乙基-2-脱氧尿苷，Life TechnologiesCat。No。A10044）脉冲30分钟，然后用PBS洗涤并在PBS中用4％多聚甲醛（PFA）固定在室温下15分钟。然后用PBS冲洗细胞，并使用0.3％Triton X-100/PBS透化30分钟。对于结合染色质的MCM测量，将细胞预先提取15分钟在冰上使用CSK缓冲液（300 mm蔗糖，100 mM NaCl，3 mM MGCL2，10 mm Pipes pH 7.0，0.5％V/v Triton-X 100）在PFA固定之前。将细胞用PBS洗涤，并在阻塞缓冲液中孵育（10％山羊血清（SigmaCat。No。G6767），0.5％NP-40（Sigma-Aldrich，Cat。I.I3021），5％W/v saponin（Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich，cat。845510），稀释为30分钟）。加入含有原代抗体的新鲜阻塞缓冲液2小时。将细胞用PBS冲洗三次，然后用二抗和0.4μgml-1 DAPI（4,6-二氨基-2-苯基吲哚，Sigma-Aldrich，cat。no。D9542）封闭缓冲液。用PBS冲洗后，使用4％PFA/PBS再次固定免疫复合物5分钟。用PBS冲洗细胞，并与EDU染色缓冲液（150 mm Tris-Cl pH 8.8、1 mM Cuso4、100毫米抗坏血酸和10μmAlexafluor 555叠氮化物（Life Technologies，Cat。A20012），与PBS Covers lastrong of groade lasters lasters lasters lasters lasters Morted（life Technologies，cat。A20012）一起使用。使用Zeiss LSM780激光扫描显微镜（Oberkochen），使用ZEN 2.3 SP1软件获得了ZEISS LSM780，使用Zeiss LSM780，则使用ImageJ V2.0.0进行了。 　　为了对核γH2AX进行高通量分析，根据实验，将每个井3,000个细胞接种在96孔板中，并培养长达72小时。固定细胞，透化并以与上述免疫荧光相同的方式染色。井中充满了200μlPBS，并在Incell Analyzer 6000自动显微镜（GE Life Sciences）的Incell Analyzer Chenter Center（LTRI）中获取图像，并具有20倍物镜。使用Cell -Profiler 3.1.9和Rstudio V1.2.501957进行图像分析（补充图4）。 　　在37°C和5％CO2上保持PCNA-CB-TAGRFP表达细胞，而使用配备有NA 0.75 20×Uplansapo物镜（OLYMPUS）的Deltavision Elite System进行反向卷积的宽视野显微镜检查，SCMOS 2,048×2,048×2,048摄像头（Leica Microsyss）。每10分钟在23小时内每10分钟以2μm的z步长通过整个单元格（7个部分），并使用Softworx（V6.0，Leica Microsystems）进行反浏览。显示最大强度投影（每个像素为0.330μm）。 　　通过在NP-40裂解缓冲液中孵育（50 mm Tris-Cl pH 7.4，250 mm NaCl，5 mm EDTA，1％NP-40，1.02％NAN3，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒鸡尾酒（RocheCat。No。11836170001），以30分钟为单位，提取了10分钟。在2×样品缓冲液中稀释4°C通过SDS蛋白直接在2×样品缓冲液中煮沸。TBST，使用Odyssey扫描仪（LICOR）实现了五分钟。 　　将细胞用20μMEDU（Life Technologiescat。No。A10044）脉冲30分钟，通过胰蛋白酶消化收集，重悬于单个细胞中，在PBS中洗一次，并在4°C下以600g的含量在600g中颗粒。所有随后的离心均以这种方式进行。在室温下将细胞固定在4％PFA/PBS中15分钟，在沉淀之前，添加过量的冰冷PBSB（PBS中的1％BSA，PBS中的1％BSA，0.2μm过滤）。将细胞重悬于透化缓冲液（PBSB，0.5％Triton-X 100）中，并在室温下孵育15分钟。添加了多余的阻止缓冲液（PBSB，0.1％NP-40），颗粒颗粒，重悬于含有原代抗体的缓冲液中，并在室温下孵育1小时。添加了含有二抗的过量阻止缓冲液，将细胞颗粒，重悬于阻塞缓冲液中，并在室温下孵育30分钟。添加了过量的阻止缓冲液，将细胞固定并在PBSB中洗涤一段时间。将细胞重悬于EDU染色缓冲液（150 mM Tris-Cl pH 8.8、1 mM CUSO4、100 mM抗坏血酸和10μMAlexafluor555叠氮化物（Life Technologies，Cat。A20012））中，并在室温下孵育30分钟。添加了多余的PBSB，将细胞颗粒并在PBSB中洗涤一段时间。将细胞重悬于分析缓冲液中（PBSB，0.5 µg mL-1 DAPI，250 µg µl-1 RNase A（Sigma-Aldrich，Cat。No。R4875）），并在37°C下孵育30分钟或在4°C下孵育30分钟或左。使用FACSDIVA V8.0.1在Fortessa X-20（Becton Dickinson）上的LTRI流式细胞仪设施上分析细胞，并使用FlowJo V10收集和分析了至少9,000个事件。 　　将细胞颗粒重悬于250μLEBN缓冲液中（150 mM NaCl，0.5％NP-40，80 mMβ-甘油磷酸甘油（Sigma-Aldrich，cat。no。50020），15 mM MGCL2，20 mm Egta，20 mm Egta，1 mg ml-egta，1 mg ml-l-1 ovalbumin（550）no 550 sigma-alicmma-aldrichicmmadrichicmmmadrichichicmadich harichichice，sigmadrich ichicmmadrichich，sigmadrichichice，cat。蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche，Cat。No。11836170001）pH 7.3），在冰上孵育5分钟。通过在液氮和37°C的水浴中的两个冷冻 - 丝循环诱导细胞裂解，并在4°C下以13,000g离心10分钟来清除裂解物。蛋白质浓度通过布拉德福德测定法（Thermo Fisher Scientific Cat。编号1856209）确定。对于激酶的免疫沉淀，将200μg提取物在750μlEBN缓冲液中稀释，并将10μg的CDK1或CDK2原代抗体琼脂糖珠偶联物添加到提取物中，并在4°C旋转过夜。通过在4°C下以2,500G离心5分钟，在2,500G下以2,500G离心，在750μLEBN中洗涤2×，然后在1 mL EB（80 mMβ-甘油磷酸甘油，15 mM MGCL2，20 mM MGCL2，20 mM EGTA，1 mg EGTA，1 mg mg mL-1 ovalbumin）中洗涤2×。最后洗涤后，将免疫沉淀物重悬于500μLEB中，并分成两个样品。一个样品用于免疫印迹分析，另一个用于激酶测定。去除最终洗涤后，将免疫沉淀物恢复在11μL组蛋白H1激酶测定缓冲液中（80 mMβ-甘油磷酸磷酸，15 mM MGCL2，20 mM EGTA，1 mg ML-1 ml-1 ovalbumin，10 mm Dtt，10 mm DTT，10 mm dtt，0.15μg-drh-un-noal-n no no no noal cat h1 sig sig h1 n.-sig sig and cat n.-sig nicn.sicma nicn.sicman nick y1 nich carny nick y1 grame nick y1。H1917），22μMATP，0.05μCIμl-1γ32P-ATP（Perkin Elmer neg502a250uc），pH 7.3），在室温下孵育30分钟。通过添加5μL6×样品缓冲液（60％甘油，6％SDS，0.03％Bromophenol Blue，1,500 mM Tris-Cl pH 6.8，DTT 60 mM DTT）淬灭反应，并通过SDS – PAP解决。将凝胶暴露于磷光成像筛网中1-2 d，并使用台风FLA 9500（GE Healthcare Life Sciences）成像。使用ImageJ v2.0.0定量32p-H1频带强度。 　　将总共​​1.5×106 FT282-HTERT TP53R175H或HCC1569细胞播种在10厘米菜肴中。二十四小时后，将RP-6306以500 nm的最终浓度添加24小时。Karyomax Colcemid（100 ng ml-1）（Thermo Fisher Scientific Cat。编号15212-012）在治疗的最后2小时中被添加到培养基中，并收集细胞，如下所示。生长培养基存储在锥管中。用1 mL胰蛋白酶处理细胞两次治疗5分钟。离心生长培养基和2 mL的胰蛋白酶化孵育（250G，5分钟，4°C）。然后用PBS洗涤细胞，并在37°C下重悬于75 mM KCL中15分钟。再次离心细胞，除去上清液，并通过滴加1 ml固定剂（冰冷的甲醇：乙酸，3：1）固定细胞，并具有柔和的涡旋。然后添加另外9 mL固定剂，并将细胞在4°C下固定至少16小时。固定后，将突管酶放在载玻片上，并用气干过夜。为了可视化有丝分裂细胞，将载玻片安装在含DAPI的延长金安装介质中（Invitrogen，Cat。No。P36930）。图像是在带有ZEN 2.3 SP1软件的Zeiss LSM780激光扫描共聚焦显微镜上捕获的。 　　由MYBL2和FOXM158结合的114个蛋白质编码基因的启动子用于创建MMB-FOXM1转录特征。为了消除其表达与TCGA样品中其他基因集较差的基因相关的基因，使用log2片段每千座外显子每百万映射的片段（FPKM）基因表达值用于计算签名中11个基因的成对长矛人相关性。平均相关值低于0.4的基因被消除，导致60个基因精制的MMB -FOXM1签名。每个TCGA样品的精制签名得分是通过在签名中所有基因的中值log2 fpkm值计算得出的。 　　将细胞播种在10厘米菜肴中（2.5×106 FT282-HTERT TP53R175H野生型或2×106 CCNE1高克隆细胞（C3和C4））。第二天，通过胰蛋白酶消化收集细胞，在PBS中洗一次，然后颗粒。颗粒在液氮中被刺激。使用BGI香港的Novaseq进行完整转录组的RNA提取和测序。使用FASTQC V0.11.9软件（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/projects/fastqc/）评估了配对端库中的RAW FASTQ文件，以确定读数的质量；阅读长度为150 bp。然后将FASTQ文件与人类基因组的Gencode GRCH38 V36初级组装对齐，并使用鲑鱼V1.4.059和命令行标志“ - validatemappings”和“ - gcbias”进行量化，以获得读取计数。使用R60中的BioConductor套件EDGER v3.30.3处理原始计数。在至少两个样品中以百万计（CPM）> 0.1表示的基因考虑使用M值（TMM）进行归一化，以去除图书馆特异性的伪像。对于随后的分析，将VOMOMY转化应用于RNA-Seq计数数据，以在Log2量表上获得归一化的表达值。测序读数的原始计数以FASTQ格式的质量得分和归一化的转录物丰度测量值已沉积在NCBI的基因表达Omnibus61中，并且可以通过GEO Seriesion登录号GSE171453访问。 　　使用Package Heatmap3 V1.1.9在R中生成热图。通过使用Pearson相关度量计算距离和使用完整方法来计算距离，从而进行了无监督的分层聚类。将基因表达值进行平均并在整个行上缩放，以指示上述标准偏差（红​​色）或以下（蓝色）的平均值，表示为行z得分。与父母野生型细胞相比，进行了GSEA62，以鉴定FT282-HTERT TP53R175H CCNE1 CC3和C4克隆在FT282-HTERT TP53R175H CCNE1 C3和C4克隆中共同调节的基因的富集。使用1,000个基因集的排列进行分析，并获得归一化的富集评分（NES），以反映FT282-HTERT TP53R175H CCNE1-CCNE1-HIGH CCNE1-HIGH C3和C4 CLONE中基因集过多的程度。 　　For the ADP-Glo​​ assay (Promega cat. no. V9103) human recombinant PKMYT1 (full-length human GST–PKMYT1 recombinant protein; Thermo Fisher Scientific A33387, lot 1938686), was diluted in enzyme assay buffer (70 mM HEPES, 3 mM MgCl2, 3 mM MnCl2, 50 μg ml−1PEG20000，3μM邻苯二甲酸钠，1.2 mM DTT），在5μl体积中，并在384孔板中镀以384孔板（最终浓度为18.5 nm），然后添加5μl酶测定法。在添加5μl30μMATP（在酶测定缓冲液中稀释）之前，将酶 - 二碳酸化合物在室温下孵育15分钟，以使最终ATP浓度为10μm。在30°C孵育1小时后，加入15μlADP-GLO试剂并在室温下孵育40分钟。最后，加入30μl的激酶检测试剂，将板在室温下孵育30分钟，并使用Envision Plate读取器（Perkin-Elmer）测量发光。通过将发光值乘以4来测量每孔0.25 s的发光，并获得每秒的速率。 　　为了确定RP-6306在PKMYT1或WEE1纳米型目标参与分析（Promega）中的亲和力，HEK293T细胞用pkmyt1（Promega NV1871）或WEE1（Promega NV2231）（Promega NV2231）的nanoluc Fusion Vector转染HEK293T细胞（PROMEGA NV1871）（PROMEGA NV2231）（PROME NV2231）（PROME dNA）试剂（Promega E2311）在无苯酚红（Thermo Fisher Scientific，11058021）中的Opti-Mem中，并孵育过夜。将细胞用胰蛋白酶，计数和17,000个细胞在96孔板中铺在带有K-5细胞可渗透激酶纳米型TE示踪剂（Promega N2482）和RP-6306的96孔板中，并在37°C下孵育2 h。添加了细胞内TE纳米GLO底物/抑制剂（Promega N2160），并使用Envison Plate读板读取器（Perkin-Elmer）测量受体发射（610 nm）的强度（610 nm）。 　　将HCC1569细胞铺在96孔TC处理的培养板中（每个孔30,000个细胞），并在一夜之间生长。第二天，使用带有三倍稀释液的Tecan D300E数字分配器分配RP-6306。添加化合物后，将细胞板以300克离心10 s，然后将其放在孵化器中2小时。将细胞裂解在补充了1倍蛋白酶（RocheCat。No。11836170001）和磷酸酶抑制剂（Sigma-AldrichCat。No。4906837001）和1 mm PMSF的α裂解缓冲液中。将板以500克旋转20分钟，以促进裂解。然后用铝箔密封板，并在-80°C下冷冻至少1小时。将裂解物在37°C中解冻10分钟，每种裂解物的10μl被重复地转移至384个井测定板。对于CDK1-PT14和总CDK1或CDK1-PY15和总CDK1，在最终浓度为5 nm或1 nm处添加抗体，密封并在4°C下储存过夜。抗兔IgG受体和抗小鼠IgG供体珠均以20μgml-1的最终浓度添加，并在室温下在黑暗中孵育2小时反应。使用Perkin Elmer Invision多模板读取器测量发光，并在680 nm处激发，并在615 nm处发射。 　　饲养小鼠，并在Repare Therapeutics（加拿大蒙特利尔Neomed Site）进行实验，该治疗疗法是加拿大动物护理理事会（CCAC）认可的Vivarium。根据Neomed机构动物护理委员会（NIACC）批准的协议进行了研究。在温度控制的环境（22±1.5°C，30–80％的相对湿度，12 h：12 h light：12 h Light：dark）中，在单个HEPA通风高压灭菌的笼子（Innocage IVC，Innovive）中检查时检查小鼠并在单个HEPA通风的高压灭菌笼（Innocage IVC，Innovive）中检查小鼠。为小鼠提供高压灭菌的玉米面床上用品，辐照食品（Harlan teklad）和过滤的水。它们还提供了嵌套材料（KetchumCat。No。087）和塑料庇护所作为富集。补充新鲜的床上用品，筑巢材料和水，每周更换。在使用前至少5天，将小鼠在动物设施中被适应，并用不可磨灭的墨水鉴定。在周期的光阶段进行实验。 　　HCC1569，OVCAR3和SUM149PT细胞分别以5×106细胞的形式植入雌性CB17-SCID，SCID-beige和Nod-Scid小鼠的右侧（5-7周大； Charles River； Charles River），1：1 Matrigel：Medrigel：Medrigel：Medrigel corning corning corning calning cat。当肿瘤达到100-150 mm3的肿瘤时，使用studentLogV4.4软件中的“分层”方法根据肿瘤体积和体重随机分配小鼠（n = 8），并开始使用RP-6306进行处理。 　　使用PDX的体内研究是在冠状生物科学上进行的。收集新鲜的原发性人肿瘤组织并切成小块（大约2-3毫米的直径）。这些肿瘤片段在肿瘤发育中以下接收到雌性BALB/C裸鼠（5-7周大）的右侧，然后通过植入植入术中传递到疗效研究中参与的小鼠队列中。使用研究LOGGV4.4软件中的分层方法，平均肿瘤大小达到约150（100-200）mm3时，根据生长速率随机分为治疗组（n = 6）。在执行之前，Crownbio的机构动物护理和使用委员会（IACUC）对涉及PDX模型的动物护理和使用的程序进行了审查和批准。在研究期间，根据《实验动物护理评估和认证协会》（AAAALAC）的法规进行了动物的护理和使用。 　　RP-6306以0.5％的甲基纤维素和口服给药，每天两次（BID，0-8 h）最多21天。吉西他滨每周一次在盐水中腹膜内服用。每周三次监测动物的肿瘤体积，临床体征和体重。使用数字卡尺测量肿瘤体积，并使用0.52×L×W2的公式计算，其中L为长度，W是宽度。评估了对治疗的反应，以评估肿瘤生长抑制（％TGI）。肿瘤生长抑制（TGI）定义为：TGI =（（（tvEvehicle/last - tvehicle/day0）） - （TVReated/last - tvTeareated/day0/day0））/（TVVehicle/Last -tvVehicle/Day0）×100％基于第0天和最后一日的治疗组计算。电视是肿瘤体积，下标表示治疗组和抽样时间。根据NIACC和IACUC批准的动物方案，一旦小鼠肿瘤量超过2,000 mm3，就会安乐死。体重变化（BW）使用公式：％BW变化=（BWLAST-BWDAY0/BWDAY00）×100。计算BW的变化是根据相对于第0天的个体体重变化而计算的。相对于车辆对照或其他测试组的统计学意义。与单向方差分析相对于车辆对照组或其他测试组建立了最小的Anova，然后是Fisher对Fisher的最小差异测试对多组的测试。在数据收集和分析过程中，研究人员并未蒙蔽。 　　在异氟烷麻醉下，通过心脏穿刺收集全血，并转移到含有0.1 M柠檬酸的管（3：1柠檬酸：血液）中，并在-20°C下储存，进行LC -MS/MS分析。从小鼠侧面去除肿瘤，并清除周围的小鼠基质。在预先填充的珠磨管中收集了50毫克至100毫克的肿瘤片（Fisher Scientific，Cat。No。15-340-154），然后在液氮中闪烁。将来自媒介物和化合物处理的小鼠的其他肿瘤碎片置于手术切除2-5分钟内的10％中性缓冲福尔马林（NBF）中，在室温下将NBF固定在NBF中18-24 h，并嵌入石蜡中。 　　使用四量乙腈通过蛋白质沉淀进行全血样品的提取。使用超源LX2 Ultimate 3000液相色谱系统分析样品提取物，该系统耦合到以正模式运行的Thermo Alto AltiS Triple Triple Electrospray质谱仪（Thermo Fisher Scientific）。使用2×50 mm，2.8 µm Pusnuit XRS C8 HPLC柱（Agilent）进行分离。水的反相线性梯度 + 0.1％甲酸和1：1乙腈：MEOH用于洗脱RP-6306和内标。针对十分线性标准曲线和三个级别的质量控制样品进行定量样品。使用体外衍生的血/血浆比= 1.2，将RP-6306的全血浓度转化为游离的未结合等离子体浓度，而CD-1小鼠菌株的分数未结合（FU）等离子体= 0.185。 　　扩展数据中的组织学图9由HistoWiz进行。简而言之，将福尔马林固定的组织通过20％，80％，95％和100％乙醇序列脱水，在二甲苯中清洗，嵌入石蜡中，然后以4μm切片。对粘结抗原检测进行了γH2AX，CDK1-PT14和细胞周期蛋白B1-PS126的免疫组织化学。根据制造商的协议，使用了键合聚合物精炼检测（Leica Biosystems）。染色后，将切片脱水，并使用Tissuetek-Prisma和Coperslipper（Sakura）覆盖膜。在Aperio AT2（Leica Biosystems）上进行全片扫描（40倍）。使用Halo进行图像定量分析。H得分由公式给出：H-SCORE =（弱阳性细胞的1×百分比） +（中等阳性细胞的百分比为2×百分比） +（占强阳性细胞的百分比为3×百分比）。扩展数据中的组织学图10c是通过新基础学进行的。简而言之，将福尔马林固定的石蜡包裹的肿瘤样品分割为4μm，安装在带电的载玻片上，并在60°C下烘烤1小时。对细胞周期蛋白E1的免疫组织化学是在键-III Autostainer（Leica Biosystems）上进行的。根据制造商的协议，使用了键合聚合物精炼检测（Leica Biosystems）。然后从仪器脱水，清除并盖上覆盖的仪器中取下载玻片。在Aperio AT2（Leica Biosystems）上获得了明亮场图像（20倍）。 　　将肿瘤样品在MSD Tris裂解缓冲液（Meso量表发现CAT。NO。R60TX-2）中均匀，并补充了1×Halt蛋白酶（Thermo Fisher ScientificCat。No。78429）和磷酸酶抑制剂（Thermo Fisher ScientificCat。No。78426）使用Beadematization hor homegogentor smogen smogen smogensogen（Omnizopentor somploge hor ishogeniase）。在4°C下以14,000g的速度与捕获抗体（CDK1）覆盖，在4°C下孵育过夜，然后在室温下（60μg）在室温下添加2.5 h的室温板干，使用次级抗兔HRP偶联物孵育1小时，然后与TMB过氧化物酶底物溶液孵育10分钟（Thermo Fisher ScientificCat。No。N600）。用作空白以控制日期可变性。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。