帕金森氏病的HES细胞衍生多巴胺能神经元的I期试验

　　简而言之，从Wicell Research Institute获得了未分化的WA09（H9）细胞（通道28）的大师库。这些细胞是在CGMP条件下制造的，以建立通过Waisman Biomantustrucy进一步认证的工作细胞库。细胞通过了一系列测试，包括通过短串联重复（STR）分析，核型和标记表达以及对不定病毒和支原体的测试进行测试。完整的协议在以前的出版物中描述了34。MSKCC的细胞疗法和细胞工程设施（CTCEF）进行了与HES细胞区分开的MSK-DA01细胞的CGMP生产。将WA09细胞解冻并扩展在Geltrex涂层的瓶/培养皿中，并在Essential 8基底培养基中补充10-14天。每3-5天以1：4至1：6之间的比例通过分配（干细胞技术）分配细胞（干细胞技术）。对于MSK -DA01的分化，将单细胞WA09洗涤并在Geltrex上以N2和B27（不含维生素A）为2 mM-谷氨酰胺，10 µM SB431542，250 NM LDN193189（LDN193189（LDN193189），0.7MM -sb431542，0.7mm -sb431542，0.7mm -sb431542，在N2和B27（无维生素A）的神经质培养基中以400,000个细胞镀在Geltrex上。500 ng ml-1 SHH，带10 µm y-27632。此后每天更换培养基，而无需添加Y-27632。在第4天，添加了7.5 µm CHIR99021。第6天更换了相同的介质。在第7天SB，LDN和SHH被从介质中撤回。在第9天进行了相同的培养基。在第10天，神经巴萨培养基（带有B27），带有2 mM L-l-谷氨酰胺，20 ng ml-1 bdnf，20 ng ml-1 gdnf，200 µm抗坏血酸，抗坏血酸，500 µm Dibutyryl-camp，1 ng ml-1tgfβ3和3 µm，On day 11, cells were dissociated to single cells with Accutase for 30–40 min and replated on plates coated with poly-ornithine (15 µg ml−1, Sigma Aldrich), fibronectin (1 µg ml−1, Akron Biotech) and laminin (2 µg ml−1, Trevigen) at 800,000 cells per cm2 using the same medium as on day 10. On day 12, 切换培养基为10 µm DAPT，并撤回CHIR99021。每天进行完整的培养基变化，直到收集在第16天。在分化的第16天，MSK-DA01细胞与ACCUTASE分离30-40分钟，并通过40 µM细胞过滤器过滤。将细胞颗粒重悬于每毫升干式养蜂物800万细胞的细胞密度，并将其放置在受控的冰柜（Thermo Fisher Scientific）中以进行冷冻保存。冷冻保存的小瓶存储在安全的GMP设施冰柜中，并通过DataTron系统24/7监测。 　　该试验包括两个队列：一个低剂量（队列A；每个壳菌90万个细胞）和一个高剂量（同类b;每个壳壳）队列（扩展数据图1）。入学序列是依次发生的，首先进入低剂量队列，然后在30天停顿后进入高剂量队列，以供数据安全监测委员会评估。合格的参与者（补充表1）至少年龄50至78岁（加拿大）或至少60至78岁（美国），在筛查和Hoehn -Yahr得分为0到3（加拿大）或以0至3的得分或3至4（United States）的得分（美国）得分为0到3（加拿大）之前，确认了PD的诊断3至20年。协议中描述了完整的包含和排除标准，该标准在补充信息中提供。 　　参与者在手术前参加了筛查，基线和术前就诊。移植后，参与者在第10天进行了术后评估。在整个研究期间，在现场就诊期间进行了一系列问卷和临床评级量表，移植后5年的总随访。参与者在每次访问之前在家中完成了PD日记，并且在整个试验中都对不良事件进行了评估。 　　根据协议，主要终点是SAE的发生率。安全成功标准被定义为：两名或更少的人群参与者，发展了两个或多个与手术有关的SAE，存在移植细胞或免疫抑制；两名或更少的参与者都会发展出与移植细胞的存在有关的肿瘤或异常组织过度生长。两名或更少的参与者都会发展出一种被认为是威胁生命的脑内出血。在任何一个队列中，一个或零死亡。次要目标（补充表2）包括立体定向移植的可行性；在PET成像上通过18F-DOPA摄取移植细胞的存活；运动障碍社会统一帕金森氏病评级量表（MDS-UPDRS）的运动效应不得分（MDS-UPDRS）第三部分，分数下降，调整后的PD日记有时（没有发育不良的准时及时及时患有非陷入困境的运动障碍）；SAE和不良事件的发生率以及安全性和耐受性。 　　对临床和剂量信息视而不见的研究人员在单个成像部位进行了18F-DOPA PET研究和分析。 　　参与者在基线时进行了三维PET成像，在移植后的12和18个月中进行了三维宠物成像。图像是在高分辨率的高敏性宠物断层摄影仪上获取的（GE Discovery IQ-5环/CT扫描仪，通用电气医疗系统；参数：全尺寸 - 半含量最大最大= 5 mm，轴向视野= 26 cm，切片厚度= 3.3 mm，79片）。5.0 MCI静脉注射18F-DOPA后，收购开始了大约80至100分钟。参与者在扫描前12小时停止了Antiparkinsinian药物，并根据FDA处方信息在18F-DOPA注射前的120分钟内口服了150毫克的碳纤维。18F-FDOPA PET图像重建使用Vuepointhd VIP（VPHD）方法，一种3D迭代OSEM（有序子集期望最大化）算法，具有4个迭代和12个子集，用于衰减和散射。图像分辨率在所有方向上约为5 mm。 　　我们创建了针对每个时间点计算的纹状体与枕形比（SOR-1）图像的先验组平均值，以及基于先验的VOI分析。SOR-1图像（图3）得出以提供对整个时间点上纹状体上均值的均值变化的解剖学可视化。进行了基于VOI的分析，以提供纹状体内预先指定区域内18F-DOPA摄取信号的组×时间定量（即植入细胞的后梭菌，外科手术目标区域；尾状细胞，控制区域，无植入细胞）。 　　使用SPM12软件（https://www.fil.ion.ucl.ac.ac.uk/spm），将每个参与者的18F-DOPA PET图像重新对齐，然后一起注册到高分辨率T1结构MRI扫描（见下文）。注册的PET图像被转换为​​特定的18F-DOPA摄取的体积图（图像/枕骨计数-1; SOR-1），将枕皮层用作参考。处理前后的18F-DOPA吸收的SOR-1图像被空间标准化为标准的蒙特利尔神经学研究所解剖空间（https://mcin.ca/research/neuroimaging-methods/atlases）。然后在每个时间点从这些图像中产生整个队列的组平均值，并使用主文本中报道的SOR-1量表显示（图3）。 　　使用SPM12在天然空间中，将每个参与者的18F-DOPA PET图像重新对齐，然后一起注册到本机空间中的高分辨率T1结构MRI扫描（见下文）。在没有执行空间归一化的情况下，将18F-DOPA PET图像保持在天然空间中。使用FSL Software48（https://fsl.fmrib.ox.ac.ac.ac.ac.uk/fsl/docs/docs/docs/docs/docs/unstall/index）实现的自动处理程序在MRI扫描中进行了分割，将尾状核和壳骨的解剖结构进行了分割。然后，使用半自动化的手术分离前和后壳的区域，其中涉及MRI扫描中前；在每个纹状体VOI中自动计算18F-DOPA计数，包括尾状核，前和后壳和枕皮层（每个半球的直径为16 mm）。然后使用FSL与用作参考的枕骨皮质进行FSL计算18F-DOPA摄取（区域18F-DOPA计数/枕骨计数-1）。低剂量和高剂量队列显示了前壳，后壳和尾状的单个数据点（扩展数据图3）。此方法先前已被验证为49,50，并成功地用于胎儿细胞移植的PET成像研究25,42,51,52。 　　术前，术后，术后和1、3、6、12和18个月，使用标准化的采集方案对大脑（1.5 Tesla和3 Tesla）进行了MRI研究（1.5 Tesla和3 Tesla）。 　　在2021年5月3日至2022年3月30日之间，评估了17名参与者的资格；由于筛查失败而被排除在外。将其余的12名参与者顺序招募到低剂量（n = 5）或高剂量（n = 7）队列中（扩展数据图1）。在最后一位参与者完成18个月访问时，中位数（最小）随访时间为21.2个月（18.5，24.7），所有参与者仍在进行临床随访。参与者的中位年龄为67.0岁（四分位数1（Q1），Q3：64.5，70.0）;67％是白人，男性为75％（补充表3）。诊断以来的中位数（Q1，Q3）时间为9.0（5.9，11.5）年。在基线上，所有参与者的得分为2；11名参与者的Hoehn – Yahr得分为3，一名参与者（低剂量队列；加拿大）得分为2。 　　参与者最常见的茶（扩展数据表6）是神经系统疾病（八名参与者中的11个茶；扩展数据表7），感染和侵扰（七个参与者中的10个茶）；扩展数据表8）系统/器官类。在感染中，每种口腔疱疹和尿路感染都被认为与免疫抑制有关。没有茶与bemdaneprocel有关。除了两个严重的茶（一个秋天被视为与治疗无关，胃肠道出血的SAE无关），其他所有秋天的严重程度是轻度或中度的（扩展的数据表4）。 　　所有参与者的所有安全数据均在移植后1年对主要终点进行正式分析。在移植后的1年和18个月中，还评估了次要和探索性终点。由于参与者的数量少，没有进行推论统计测试。描述性统计（平均（标准偏差（S.D.））或百分比（计数））由队列制成。 　　该审判是根据协议和所有适用的地方政府法律，法规和指导进行的，包括与赫尔辛基宣布的基金会的政策，国际医学协会宣布人类使用的技术要求协调技术要求。纪念斯隆·凯特林癌症中心和威尔·康奈尔医学的机构审查委员会审查并批准了临床方案（与文章提交）和患者同意书。所有参与者均签署了知情同意。（MSKCC：6/8/2021的第18-518号第18-518号； WCM IRB NO：1810019690 2019年1月14日）。数据安全监测委员会和机构审查委员会监视了试验的进度和数据处理。MSKCC和WCM的三机构人类胚胎干细胞研究委员会（ESCRO）于2019年10月11日批准了这项研究和同意。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。