内质网 - 铂膜接触梯度直接细胞迁移

　　HTERT RPE-1细胞（此处称为RPE-1）（美国类型培养物收藏（ATCC），CRL-4000），HUVEC/TERT2细胞（ATCC，CRL-4053），BJ-5TA细胞（ATCC，CRL-4001）和293T细胞（Takara Bio，632180）。将RPE-1细胞保持在DMEM/F-12，HEPES，无苯酚红培养基（Gibco，11039047）中，补充了10％FBS（Millipore Sigma，F1435）。HUVEC/TERT2细胞在补充EGM2（Lonza，CC-4176）的EBM2基础培养基（Lonza，CC-3156）中培养。将BJ-5TA成纤维细胞培养在具有4个DMEM（Thermo Fisher，11995073）的混合物培养基中，并培养了1个培养基199（Thermo Fisher，11150059），补充了10％FBS。将293T细胞维持在DMEM（Thermo Fisher，11995073）中，用于慢病毒制备10％FBS。RPE-1细胞通过产生稳定的细胞系或瞬时转染来用于本研究的大多数实验。HUVEC/TERT2细胞和BJ-5TA细胞用于测量ER – PM接触梯度的稳定细胞系生成。所有稳定的转染细胞系均与原始细胞系相同。 　　使用标准的微图案协议，使用肺泡/原始系统在96孔玻璃底板（Cellvis，p96-1.5h-n）上进行线性条纹。简而言之，将96孔板进行血浆清洁2分钟，并涂有每孔60μl聚赖氨酸（Sigma，p4707）30分钟。用DI水（Invitrogen，10977023）洗涤3个台阶后，将96孔板在90°C加热直至干燥。同时，MPEG-SVA（Laysan Bio，MPEG-SVA-5000-5G）的50μl100mg ml – 1在0.1 M HEPE（pH 8.5）中新鲜制备，并将其添加到每个孔中1 h中，以使玻璃非粘合剂（无频率）。用Di水洗涤板4次，然后再次干燥以完成钝化。在此阶段，涂层的镀层可以在4°C下储存几周。在进行实验之前，新鲜制造了凝胶混合物（978.6μLDI水，20μLPLPP凝胶（肺泡，B002）和1.4μl表面活性剂（肺泡，B002）），并将其应用于96孔板（每孔50μL）中的单个孔中，并在96粒板块上放置在96粒板上，并在96粒板上放置。一旦蒸发了凝胶溶液，将96孔板移至连接到Primo系统的显微镜，以进行照相。Leonardo软件的HCS向导用于自动控制每个井的位置，并且先前设计的20μm宽的线性条带模板被导入每个孔中的激光图案。拍摄后，将96孔板用1×PBS立即洗涤3次，并用70％乙醇孵育几分钟，然后用1×PBS洗涤4次。最后，将96孔板用50μl10μgml– 1纤连蛋白（Sigma，F1141-5mg）涂覆，在1×PBS冲洗之前30分钟。在每个实验之前，总共将2,000个细胞接种到每个井中12小时。 　　通过慢病毒感染与细胞分选或尿霉素选择结合产生稳定的细胞系。简而言之，将感兴趣质粒在慢病毒转移质粒骨架中被转染至低通质293T细胞中，以及第三代慢病毒包装质粒，包括PMDLG/PRRE（Addgene，12251），PRSV-REV（Addgene，12253）和PCMV-v-v-v-vv-sv-g（Addgene，12251），842000（Thermo，11668019）。转染后48小时和72小时收集病毒上清液，并使用0.22μm滤波器（Millipore，SCGP00525）合并以进行过滤，并使用100 kDa centrrifugal滤波器（Millipore，UFC910024）浓缩。然后将浓缩病毒等分为几个冷冻管，并在-80°C下储存，以供将来使用，或直接添加到具有聚甲烯的生长培养基中（EMD Millipore，TR-1003-G）中。为了生成带有mturquoise-caax和mapper-Mvenus组成型表达的RPE-1细胞，将感染后两种荧光构建体的单个细胞分类为96孔板的单个井中，并培养以膨胀。在确认五个克隆对返回的ER – PM接触梯度的观察结果相同之后，将其中一个用于大多数研究，并用作产生其他细胞系的基础细胞系。我们选择了以低水平表达此ER – PM接触报告的细胞，以最大程度地减少其对细胞形态和细胞极化的影响。pLV-iRFP–SEC61β and pLV-PTP1B–mCherry were respectively or simultaneously introduced into stable cell line with mTurquoise–CAAX and MAPPER–mVenus to construct a 3-colour stable cell line (mTurquoise–CAAX, MAPPER–mVenus and iRFP–SEC61β) or a 4-colour stable cell line,（mturquoise – caax，mapper – mvenus，ptp1b – mcherry和irfp –sec61β）。将PLV-AKT – PH-MCHERRY引入了mturquoise-caax/mapper – Mvenus稳定的细胞系中，以生成mturquoise-caax/mapper – mvenus – mvenus/akt – ph-ph-mcherry稳定细胞系。对于两个强力霉素诱导的细胞系， 将PCW-RTN4 – MCHERRY或PCW-CLIMP63-MCHERRY质粒引入了3色稳定的细胞系，mturquoise-caax/mapper – mvenus – mvenus/irfp-sec61β。在成像开始时，添加了强力霉素（1μgml– 1）以诱导RTN4或CLIMP63表达。 　　将佛法的siRNA（补充表1）溶解在超纯的DNase/RNase无蒸馏水中（Fisher Scientific，10-977-023），以制备2μMsiRNA库存。将储备溶液等分为多个管，以避免重复解冻。对于96孔板中的siRNA转染实验，根据制造商的协议，将RPE-1细胞在转染前16小时接种并使用Dharmafect 1（Dharmacon，T-382 2001-03）转染。简而言之，用Opti-Mem培养基（Gibco，31-985-070）稀释20 nm siRNA和0.5μlDharmAfect1，以在单独的管子中制备10μl体积系统。在室温下孵育5分钟后，将两个管完全轻轻混合，以孵育20分钟。然后将另一个80μL的Opti-MEM培养基添加到转染混合物中，并转移到每个孔中6 h转染，然后再用完整的生长培养基代替培养基。 　　对于DNA的瞬时转染，使用标准方案使用Lipofectamine 2000。简而言之，将2–3×103 RPE-1细胞铺板，并用每种质粒的0.1-0.2μgDNA转染，在Opti-Mem培养基中稀释的0.25μlLipofectamine2000。转染混合物在4小时后用完整的生长培养基替换，转染后16-24小时成像细胞。 　　从Addgene：GFP – MAPPER（117721），IRFP –SEC61β（108125），PPTP1BD181A – MCHERRY（40270），PHAGE2 -MCHERRY -MCHERRY – RTN4A（86683），MCHERRY – CLIMP63（1362293）订购以下质粒。（22010），PBIFC – VC155（22011），EGFR – GFP（32751）和PCDNA3.1 – AKT – PH -MCHERRY（67301）。这些质粒用作放大所需片段的模板，使用Gibson组装方法（NEB，E2611L）进一步组装到目标质粒主链中。简而言之，基于PLV – Mturquoise – Caax backbone，构建了PLV – Mapper -Mvenus，PLV – MEVER，PLV – IRFP –SEC61β，PLV – PTP1B – MCHERRY和PLV – AKT -PH -MCHERRY质粒。在使用年龄/noti切割这种质粒后，PLV – MVER-MVENUS，包括Mvenus，Mapper和FKBP，包括PLV – RFP –SEC61β，PTP1B和MCHERRY的IRFP –SEC61β，用于PLV-PTP1B-MCHERRY以及PLV-MCHERRY的lig-akt-ways-ways-ways-ways-ways-ways-ways-ways-ways-ways-ways-ways-waysterphers-使用重组克隆方法mturquoise -caax插入。MCHERRY – RTN4A和MCHERRY – CLIMP63分别从其模板质粒放大并插入PCW主链中（源自PCW – CAS9，E。Lander和D. sabatini和D. sabatini，Addgene，质粒50661的礼物），以使PCW -MCHERRY – MCHERRY – RTTN4A和PCW -MCCCW -MCCCCW -MCCCCCW -MCCCCCCW -MCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCLIMP。通过用VN173片段替换GFP，从EGFR – GFP质粒设计了EGFR – YN质粒，该质粒从PBIFC – VN173扩增。PTP1B（D181A）–YC质粒是基于PPTP1BD181A – MCHERRY质粒构建的，它通过用VC155片段代替MCHERRY，并从PBIFC – VC155质粒中扩增。 　　Drugs used in the study were dissolved into DMSO (Santa Cruz, sc-358801) to prepare stock solutions, including the PI3K inhibitor LY294002 (Cayman, 70920), the PTP1B inhibitors CAS765317-72-4 (EMD Millipore, 539741-5mg) and MSI-1436 (MedChem Express,HY-12219A）和强力霉素盐酸盐（Sigma，D9891）。所有药物均根据其数据表处理，并等分以避免重复解冻过程。在相应的实验中指示每种药物的工作浓度。 　　PTY（P-TYR-1000）Multimab Rabbit单克隆抗体混合物（1：500，细胞信号技术，8954），抗Esyt1抗体（1：200，Sigma，Sigma，HPA076926）和Climp63单克隆抗体（G1/296）WAST（1：500）ENCICENCES，ENS SCISS SCICENCES，ENSS SZO SCICIES，ZO SCICIES，SCICIES，ZO SCICIENCES，ENS SZO SCICIES，ZO SCICIENCE，ZO SCICIENCIS 3用作免疫染色实验的主要抗体。Secondary antibodies included goat anti-rabbit IgG(H+L) Alexa Fluor 568, Invitrogen (1:2,000, Thermo Scientific, A-11011), goat anti-rabbit IgG(H+L) Alexa Fluor 647, Invitrogen (1:2,000, Thermo Scientific, A-21245) and goat anti-rabbit IgG(H+L) AlexaFluor 700，Invitrogen（1：2,000，Thermo Scientific，A-21038）。抗ESYT2抗体（1：1,000，Sigma，HPA002132），PTP1B抗体（1：1,000，BD Bioscience，610139）和RTN4抗体（1：1,000，Thermo Scientific，MA5-32763），MA5-32763）被用作西部抗体实验的主要抗体。 　　将细胞在96孔玻璃底板中播种，并带有预制的线性条纹，以进行免疫染色实验。siRNA转染或抑制剂处理后，在室温下使用4％多聚甲醛在PBS中固定细胞，并用PBS洗涤。然后将细胞用0.1％Triton-X 100透化10分钟，然后在PBS洗涤和阻塞缓冲液孵育1小时（10％FBS，1％BSA，0.1％Triton X-100和PBS中的0.01％NAN3）。然后将细胞与原代抗体在4°C下阻止缓冲液中孵育过夜，然后在室温下进行PBS洗涤和二级抗体孵育1小时。成像之前，再次用PBS洗涤细胞。 　　自动荧光显微镜用于执行活细胞延时成像以跟踪细胞迁移（图2G，H，3E，F和扩展数据图3C，F – I和7D，E）。将细胞播种在96孔玻璃底板中，涂有胶原蛋白（Advanced Biomatrix，5005-B，30μgml– 1稀释至少1 h），并用0.1μgml– 1 Hoechst 33342（Invitrogen，H3570，H3570）染色，在30分钟之前，在30分钟之前，在30分钟的生长培养基或Opti-mem中，在37°C下染色。将96孔板通过配备有LED光源（Lumencor Spectra X）和Hamamatsu Orca-Flash4.0 V3 SCMOS摄像头的TI2-E反倒显微镜（Nikon）转移到具有37°C，5％CO2环境的活细胞腔中，进行24小时的长期成像。使用以下采集参数：间隔，每12分钟；×20（Nikon CFI PLAN APO LAMBDA，0.75 NA）物镜；89903-ET491 BV421/BV480/AF488/AF568/AF568/AF647 Quinta频段集（Chroma Technology）用于多通道荧光图像或仅用于HOECHST成像的BV421；16位模式，带2×2 binning；在5％的光强度下暴露于80毫秒的时间，以降低Hoechst成像的光毒性。通过NIS元素软件对原始图像进行了阴影校正，以校正不均匀的样品照明，并使用充满无细胞成像介质的井作为背景自动荧光减法。 　　Unless otherwise indicated, imaging was performed using a SoRa spinning-disk confocal microscope (Marianas system, 3i), equipped with a Zeiss Axio Observer 7 stand, ORCA-Fusion BT sCMOS camera (Hamamatsu), CSU-W1 SoRa confocal scanner unit (Yokogawa), and 405, 445, 488, 514, 561 and 637 nm LaserStack（3i）。对于Mturquoise，Mvenus和MCHERRY 3色活细胞成像，使用了445、515和561 nm激发的CSU-W1二分法。根据实验，每5 s，30 s或2分钟获取图像。将底平面设置为具有最大ER – PM接触信号的聚焦平面。确定的焦点2功能用于长期焦点控制。For mTurquoise, mVenus, mCherry and iRFP 4-colour live-cell imaging, the CSU-W1 dichroic for 445, 515 and 561 nm excitation was used for mTurquoise, mVenus and mCherry imaging, whereas the CSU-W1 dichroic for 405, 488, 561 and 640 nm excitation was used for iRFP imaging.对于固定细胞成像，用0.27μm的步长捕获Z堆栈图像。通常，根据实验捕获9或13个光学切片。对于光遗传实验，使用了配备了额外的“矢量”照相设备的3i旋转盘共聚焦显微镜。手动定义迁移细胞的前区域被488 nm激光照亮，每2秒钟以1％功率进行连续激活。每2分钟，在蓝光照明之前，将每次实验预先模仿20分钟，进行60分钟的成像。 　　对配备488、561和647 nm激光器的总内反射显微镜（Nikon）进行成像，并在洛克菲勒大学的生物成像资源中心进行高数值孔径。稳定表达IRFP-CAAX和EGFP-SEC61β的细胞被种下96孔玻璃底板，带有预制的线性条纹，并固定用于E-Syt1免疫染色，如上所述。捕获了来自衰落场的信号并用于定量。 　　样品制备和冷冻成像是在纽约结构生物学中心（NYSBC）进行的。简而言之，将1–2×102的野生型RPE-1细胞播种到Quantifoil R1/2，200网地金em网格上，并带有如上所述制备的预图的线性条纹。播种后约12-16小时，从孵化器中取出带有网格的菜肴，并将EM网格在细胞的相对侧面污点1-2 s，并用Leica GP2（Leica Microsystems）冻结。使用配备了现场发射枪，GIF量子LS LS LS Post-Polumn Energy Filter（Gatan）和K3峰顶电子探测器（GATAN）的Titan Krios Electron显微镜（Thermo Fisher Scientific）可视化冷冻图案网格。电子显微镜在纳米探针模式下以300 kV的形式以×19,500的放大倍数（样品水平为4.53Å）。使用剂量对称方案49收集冷冻-ET倾斜系列，其倾斜范围为-52°至 +52°，在序列的目标降解量为-8 µm和序列中的3°增量，总剂量为126eÅ-2。 　　核醇（晚期Biomatrix，5005-B，3 mg ML – 1）用于3D胶原凝胶迁移测定。在凝胶化之前，所有与胶原蛋白有关的步骤均在冰上进行。八个部分的胶原蛋白溶液与冰冷的10×PBS的1部分一起混合，制备2.4 mg ML – 1胶原蛋白储备溶液，使用无菌0.1 M NaOH将其pH调节至7.0-7.5。接下来，将60μl的0.5 mg ml – 1胶原蛋白溶液（储备溶液稀释到冷1×PBS中）被添加到96孔板中，并在37°C下剩下2小时以进行聚合。将凝胶用PBS洗涤3次，将50μl的RPE-1细胞以每毫升2×104细胞的密度添加到每个孔中，持续2-3小时。孵育后，从井中除去40μl培养基，并加入60μl胶原蛋白。将带有胶原蛋白在细胞顶部的96孔板在37°C的顶部再孵育2-3小时，并以6次完整的生长培养基再次洗涤，并在37°C孵化器中培养24小时，然后成像。 　　使用基于以前的工作9,50的自定义MATLAB R2021管道对延时成像进行自动分析。有关如何量化信号的详细信息和参数如下所示。 　　根据实验，将细胞自动从核信号或PM信号分割。对于2D细胞迁移测定，使用自动落荧光显微镜捕获的核信号（HOECHST染色）用于基于高斯算法的拉普拉斯式的分割。使用当前框架和先前框架之间的最接近的纽布尔算法跟踪检测到的核。为了提高跟踪精度，核质量（核强度和核面积的产物）也被用作恒定度量，以调整两个相邻帧之间的匹配。跟踪后，将每个核的X和Y坐标导出以进行细胞速度和MSD计算。细胞速度被量化为旅行时间的总行进距离的值。MSD被量化为（xy（t）– xy（0））2的平均值，其中xy（t）是时间点t和xy（0）的单元位置是初始位置。对于1D细胞迁移测定，使用旋转磁盘共聚焦显微镜捕获的PM信号（CAAX荧光强度）用于基于OTSU算法的修改版本进行分割。借助线性条纹，仅选择了孤立的单个细胞进行后续分析。随后的帧之间最近的邻居算法用于细胞跟踪。基于固定时间的整体质心距离确定细胞速度。一阶多项式功能用于基于XY坐标拟合细胞轨迹，以确定细胞方向，该方向是平滑的，以最大程度地减少随机质心运动的影响。 　　为了跟踪ER – PM触点，每20 s捕获映射器报告信号并进行TopHat滤波（3像素半径），然后根据上述CAAX信号进行细胞分割。使用OTSU算法的修改版本，由映射器信号从单元前的40％位于单元格位置的映射器信号确定。这种促进了在细胞前部对ER – PM接触的识别，这比背面的鉴定要变暗得多。使用最接近的邻居算法在随后的帧之间连接点点，并将映射器质量设置为可调节不匹配的点的常数变量。点的速度取决于它们在持续时间内的行进距离。映射器点的寿命被计算为从外观到消失或最后一帧的持续时间。将映射器质量定量为映射器强度和映射器区域的乘积。 　　扩展数据中显示了Kymograph和平均梯度分析的示意图图1D。简而言之，每个时间点的CAAX信号用于掩盖单个细胞和细胞周围的3μm环。后者用于包括具有较高相对PM贡献的区域。为了最大程度地减少细胞之间细胞形状差异的影响，将每个细胞掩模和环面膜分为20个相等的段，从细胞正面到后部。细胞正面被自动识别为尖端端，该端端距离细胞面膜的质心最远。归一化生物传感器强度，生物传感器大小或细胞掩模中的生物传感器质量的每个像素值分配给20个段之一。计算从正面到背面的每个段中的平均值，以在随后在Kymograph中表示的每个时间点创建轮廓。在大多数图中还显示了不同时间点或不同单元格的梯度曲线的平均值。除非另有说明，否则Kymograph曲线的时间序列显示为热图，X轴代表时间，每个垂直线代表特定参数在特定时间的空间分布的20个箱。对于映射器传感器的Kymograph剖面，使用了全细胞掩模，而环膜用于PAN-TYR信号。 　　对于映射器的生长速率分析（图4H），使用CAAX信号来定义细胞边界，并按照所示在细胞前部附近选择一个利益的区域（ROI）（扩展数据图5F）。随着电池的迁移，ROI移动并越来越位于背面。ROI中每个映射器点的映射器与CAAX的比率进行了量化并绘制了与ROI位置相比。为了比较图4i的前部与背部的生长速率差异，平均生长速率分为前部和后部部分，后部由线性回归函数分别拟合以计算斜率。前部段定义为关系位置从0.2到0.5，而后部则是从0.5到映射器点显示最大平均强度的位置。 　　在图2中。2D和4F以及扩展数据图5B，E，极性陡度是从归一化映射器到CAAX或映射器到迁移细胞中SEC61β谱的计算。图2D中的平均极性得分是通过将平均值（平均值（前20％） - 平均值（返回20％））标准化为平均值（返回20％）来量化的。在图4F和扩展数据图5B中，测量了后部和前面50％之间的映射器信号，并计算了前后的比率，以表示极性陡度。 　　原始的倾斜电影经过运动校正和CTF校正（v.1.09）51。倾斜系列堆栈是从翘曲中导出的，其中倾斜系列与Aretomo软件包52对齐。对齐的倾斜系列是通过Aretomo中的加权投影或使用Tomo3D53重建的。为了增强在可视化中的断层图的对比度，用ISONET54对CTF进行了加权和同时的迭代重建技术断层图。在蜻蜓（V.2022.2）的几个断层片片上手动进行初始分割，以训练蜻蜓（V.2022.2）55或使用Tardis-pytorch56在反voldoverved的Tomograms上使用Tardis-Pytorch56。校正分段并使用蜻蜓手动标记。随后使用表面形态计分析Toolkit57对分割进行处理和分析。使用表面形态计分析工具包计算前后ER的弯曲度，并选择是因为它是曲率的两个主要组件的未分配组合，并且由于表面正常向量没有符号而被使用。 　　使用GraphPad Prism 8.0或MATLAB R2021分析统计结果，并显示为平均值±S.D。或平均±S.E.M.如所示。使用未配对的两尾学生的t检验或单向ANOVA和Scheffe的/Dunnett Post hoc比较进行了比较。对于PTYR至CAAX或映射器到CAAX梯度曲线显着性测试，在图1和2中使用了20％的前后比。1b，c和2f，i和扩展数据图8a，d，g，而峰值的指数在图1和图2中使用。3c，d和5i和扩展数据图7f，h。对于所有分析， *P< 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001 were considered significant. NS indicates statistical non-significance with P >0.05。每个实验至少进行三个独立时间进行。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。