靶向SARS-COV-2 S蛋白RBD的疫苗可诱导保护性免疫

　　没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。 　　所有大肠杆菌菌株均在37°C下的非湿振荡器中培养在溶疗肉汤培养基（1％W/V tryptone，0.5％W/V酵母提取物和1％W/V NaCl）中。分别使用非湿型振荡器在27°C下，分别将spodoptera frugiperda（SF9）细胞和Trichoplusia ni（HI5）细胞分别保持在SIM SF培养基和SIM HF培养基（SINO生物学）中。将HEK293T和HUH-7细胞保存在Dulbecco的修饰的Eagle培养基（DMEM）中，该培养基（DMEM）补充了10％的胎牛血清（FBS），100单位的青霉素和0.1 mg/ml链霉素，在37°C下用5％CO2链霉素。 　　为了评估抗原性，SARS-COV-2的尖峰蛋白的RBD使用BAC-BAC杆状病毒表达系统（Invitrogen）表达。RBD区域的编码序列（针对昆虫细胞优化的密码子）跨越了残基319-545的SARS-COV-2 WUHAN-HU-1分离株（GenBank登录号MN908947），是由便利性生物学合成的。对于基因克隆，先前描述的GP67信号肽序列7首先通过BAMHI和ECORI限制位点掺入PfastBac1载体中。然后将RBD基因通过ECORI和HINDIII位点将RBD基因取代到修饰的载体中。此外，将8倍的标签进一步添加到蛋白C末端，以促进蛋白质纯化。随后将测序验证的质粒转化为大肠杆菌DH10B细胞，以产生重组bacmids。 　　对于蛋白质的表达，首先根据制造商的说明，首先使用Lipoinsect转染摄政（Beyotime Biotechnology）转染BACMID转染SF9昆虫细胞。转染后约72小时，收集了包含包装的重组杆菌病毒的细胞培养上清液。然后将杆状病毒在SF9细胞中转移了两到三次，然后被用于SF9细胞中的蛋白质产生。 　　对于蛋白质纯化，感染后约72小时收集来自昆虫细胞的培养上清液，并通过5毫升Histrap Excel柱（GE Healthcare）进行初级纯化。回收的蛋白质在SuperDex 200增加10/300 GL色谱柱（GE Healthcare）上进一步纯化。最后，将蛋白质交换为由20 mM Tris-HCl（pH 8.0）和150 mM NaCl组成的缓冲液，以进一步使用。还制备了无标签的RBD蛋白（氨基酸320–545）。蛋白质的纯度是通过SDS-PAGE确定的，并通过使用Coomassie Blue染色和使用兔抗RBD抗体（SINO Biogological）染色。 　　遵循上述方案，使用BAC-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to baculovirus表达系统，制备了ECD（细胞外结构域，氨基酸16–1213），S1（氨基酸16-685）和S2（氨基酸686–1213）结构蛋白。简而言之，将单个的编码序列亚克隆到修饰的PfastBac1载体中，将大肠杆菌DH10B中的BACMID转移到Bacmid中，并转染到昆虫细胞中，以进行重组杆状病毒套件和蛋白质表达。然后，通过SDS -PAGE和COOMASSIE蓝色染色确定，通过亲和力色谱法纯化靶蛋白，类似于RBD蛋白。 　　对于MS分析，如前所述23,24，该蛋白首先被胰蛋白酶消化。简而言之，将纯化的RBD蛋白在-20°C中用四体积的预冷丙酮沉淀过夜。用20,000克离心10分钟，收集蛋白质颗粒。在冰上干燥后，将蛋白质颗粒溶解在变性缓冲液中（5％8 m尿素为50 mm v/v NH4HCO3）。将蛋白质用20 mM DTT在55°C下还原60分钟，并在室温下用55毫米碘乙酰氨酰胺烷基烷基烷基，再加上30分钟。氨基甲基甲基化后，将蛋白质用胰蛋白酶（1:50 W/W）在37°C下消化过夜。 　　根据制造商的说明，用C18 Ziptip（Millipore）脱盐后，使用易于nano-lc 1200与Q-激活的HF-X（Thermo Scientific）相结合，通过液相色谱（LC）–MS/MS分析了消化的肽。将肽样品加载到内部包装的反相C18分析柱（30 cm长×360μmOD×75μmID，3μm粒子，dikma）上，并以330 nl/min的流速分离。柱烤箱温度为60°C。缓冲液在水中为0.2％甲酸，缓冲液B为80％ACN，甲酸为0.2％。如前所述25分钟，用3％缓冲液B施加2-H梯度，持续6分钟，3-48％缓冲液B，持续100分钟，48-100％缓冲液B，100％缓冲液B，持续6分钟和2％的缓冲液B在过去的2分钟内，如前所述2分钟，如前所述25分钟。MS Spectra以M/z 700–2,000的速度获取，在M/z 200的分辨率为60,000。将自动增益控制设置为2×105，最大填充时间为50 ms。对于MS/MS扫描，选择具有2.0 m/z隔离窗口的前20个最强大的母离子，并使用高能量碰撞离解碎片，并以阶梯化的归一化碰撞能量为20％，30％和30％。MS/MS的自动增益控制值设置为5×105的目标值，分辨率为3,000，最大填充时间为250 ms。排除z = 1、8或未分配的荷兰的母离子，强度阈值为3.3×104。动态排除周期为20 s。离子转移毛细管的温度设置为280°C。喷雾电压设置为2.8 kV。 　　为了识别完整的N-糖肽，使用GPSEEKER9搜索所有原始文件。为了搜索匹配的前体和片段离子，同位素峰值丰度截止，同位素峰值质量比（m/z）偏差和同位素峰值丰度偏差分别设置为40％，20 ppm和50％。完整的N-糖肽谱匹配的搜索包括以下参数：Y1离子，TOP4；肽主链匹配的片段离子的最小百分比≥10％；N-聚糖部分的最小匹配片段离子≥1；topn命中，n = 2，top1命中（s）的p得分最低；g骨架，≥1;和GF评分，≥1。给定的N-糖材的G型支架定义为肽骨架b/y片段离子对的数量，每对可以独立地定位于n-糖材。给定的N-聚糖序列结构的GF得分定义为结构诊断片段的数量，每个结构都可以独立地将结构与具有相同单糖组成的所有其他假定结构区分开。在对所有RAW数据集进行数据库搜索后，将N-糖肽谱匹配组合在一起，并选择完整的N-糖肽P分数最低的N-糖肽作为最终ID。 　　在蛋白质组发现器中使用semest（版本2.3； Thermo Fisher Scientific）进一步搜索了RAW MS文件。前体肽质量耐受性为10 ppm，片段离子质量公差为0.02 Da。允许两个缺失的分裂。半胱氨酸氨基甲基化是作为固定修饰设置的。HexNAC（S/T），Hex（1）HexNAC（1）（1）（S/T）和其他潜在的O-糖基化修饰，并将常规氧化蛋氨酸和蛋白质N末端乙酰化的常规氧化设置为可变修饰9,23。渗滤剂以1％的误解率（FDR）进行。B离子和Y离子进一步手动确认了所有潜在的O-糖基化位点。 　　为了确定糖基化的丰度，均计数糖基化肽的MS/MS光谱及其相应的未修饰肽的数量。在不同位置的糖基化和具有相同序列的肽上的不同聚糖同工型的糖基化合并。 　　如前所述，由Biacore 8K（GE Healthcare）进行了表面等离子体共振（SPR）的测量。在传感器芯片蛋白A上将人ACE2 -FC捕获至100个响应单元（RUS）A。对于动力学分析，RBD蛋白在芯片上以双重稀释序列（1、2、2、4、8、16、32 nm）的形式跨芯片，并以另一个通道设置为对照。HBS-EP+运行缓冲液以300 s的速度分离至抗原表面的每个样品以30μl/min的流速分离。使用再生缓冲液（甘氨酸pH 1.5）进行传感器芯片的再生60 s。确定了关联（KA）和解离（KD）速率常数，以及亲和力值（KD）。 　　如前所述，制备了铝制成分的蛋白疫苗。简而言之，在不同的浓度下加入纯化的重组RBD蛋白，与氢氧化铝凝胶混合，并在5°C下孵育1小时。蛋白质的浓度为1-100μg/mL，氢氧化铝凝胶的浓度为1-100μg/ml。 　　将BALB/C和C57BL/6小鼠（6-8周龄）注入肌肉内，以不同的剂量（每只小鼠0.1-20μg）的重组RBD和不同的间隔注射。例如，在第0天对小鼠进行一次注射，并在第7天收集血清，在第0和第7天进行了两次疫苗，在第21天收集了两次疫苗，而第21天和第14天则收集了两次剂量。我们还研究了第21天或长期的第三次疫苗。单独注射额外的对照小鼠氢氧化铝，重组RBD或PBS。在开始免疫之前收集免疫前血清，并在每次提升后7天收集血清。我们还用RBD疫苗对转基因HACE2小鼠免疫，发现与野生型小鼠相比，小鼠对RBD蛋白的抗体水平相似（扩展数据图4）。 　　使用前，将血清保持在4°C。为了找到重组RBD激活的途径，将重组RBD疫苗注入CD4 - / - ，CD8A - / - ，CASP1 - / - ，sting1 - / - ，sting1 - / - ，TLR2 - / - ，TLR2 - / - ，TLR4-，TLR4-，TLR4--/ - （来自Jackson and nlr），（所有），nlrr and（来自Jackson and nlrr and），（IL1B - / - （东京科学大学）小鼠。所有涉及小鼠的研究均获得四川大学动物护理和使用委员会的批准。 　　对于兔子的免疫，将40只兔（4-6个月大）注入肌肉内，并以不同的剂量（每只兔子1-40μg，1-40μg，n = 6兔）的重组RBD疫苗或单独使用20μg重组RBD蛋白（n = 6）的重组RBD疫苗，也单独使用20μg的RBD蛋白（n = 6）。（n = 4）作为对照组。每次疫苗接种后7天收集血清。所有涉及兔子的研究均得到成都国家安全评估中心的动物护理和使用委员会的批准。 　　每种抗原提升后，从小鼠的恢复轨道丛中收集血液样本。在室温下凝结1-2小时后，将血液样品在4°C下以3,000 rpm离心10分钟。收集上部血清层并存储在-20°C下。重组RBD（或S2蛋白作为对照）用于在50 mm碳酸盐涂层缓冲液（pH 9.6）中以1μg/ml的最终浓度在4°C涂上1μg/ml的最终浓度。第二天，将板用含有0.1％Tween-20（PBST）的PBS洗涤3次，并添加含有1％BSA的溶液，然后加入PBST中的1％BSA，然后在室温下孵育1 h。加入串行稀释的小鼠血清，并在37°C下孵育1小时，然后用PBST洗涤板3次。在阻断溶液中稀释了1：5,000，将包括山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗体和抗小鼠IgG1/IGM HRP偶联抗体（抗小鼠IgG1/IGM）抗体（1：5,000）稀释并添加到井中（100μL/井）。在室温下孵育1小时后，将板用PBST洗涤五次，并用3,3'，5,5'-四甲基甲基苯胺（TMB）开发10分钟。用1.0 m H2SO4停止溶液的50μL/孔停止反应。在450 nm的微板读取器上测量吸光度。为了测量重组蛋白诱导的RBD特异性抗体的滴定，将血清样品连续稀释并通过滴定测量。 　　这些研究得到了四川省人民医院机构伦理委员会的批准。中华人民共和国国家卫生委员会还要求对患者进行数据收集和分析。为了研究S蛋白作为人类疫苗的RBD的潜在免疫原性，从感染了SARS-COV-2和20个健康供体的16例患者中收集了血清样品。如上所述，用ELISA检测到血清抗体与RBD的结合。简而言之，重组RBD蛋白用于涂层96孔微量定板。用1％BSA阻塞后，加入1：5稀释的血清，并将板在室温下孵育1小时，然后用PBST进行四次洗涤。用HRP偶联的抗体（抗人IgG/IgM抗体）以1/2,000的稀释度检测到结合的抗体。为了检测IgM，将血清样品添加到IgG吸附剂中，并收集上清液以通过离心进一步检测。使用2019-NCOV核酸检测试剂盒，通过RT-QPCR证实了SARS-COV-2感染。该病例系列和健康捐助者的使用得到了四川省人民医院的机构道德委员会的批准。所有参与者获得了知情同意。 　　为了研究细胞介导的免疫反应，将用S蛋白或PBS的RBD免疫的小鼠安乐死以分离淋巴细胞。淋巴细胞用于分析ELISA分析中的IL-4和IFNγ表达。简而言之，从免疫或PBS处理的小鼠脾脏中分离出的淋巴细胞在RPMI 1640培养基中培养，培养有10％（v/v）FBS，100 u/ml青霉素，100μg/ml抗霉素，1 mm丙维酸盐（所有gibco），50°ML和50μmmβ（均为50°MMβ）Sigma-Aldrich）。同时，添加1μg/mL RBD蛋白来激活细胞。这些细胞（每孔1×106）在37°C下孵育72小时。没有RBD蛋白培养的细胞用作阴性对照。收集上清液进行ELISA测定法以分析细胞因子水平。通过通过流式细胞术分析这些培养的​​淋巴细胞的表型来鉴定针对重组RBD蛋白的潜在记忆淋巴细胞（参见“流式细胞仪”）。 　　我们获得了四川省人民医院机构伦理委员会的批准。中华人民共和国国家卫生委员会还要求对患者进行数据收集和分析。 　　如前所述28，通过流式细胞仪对RBD – FC的结合测定进行了ACE2。简而言之，收集ACE2+ HUH7细胞（人肝癌细胞系），并用汉克斯平衡盐溶液（HBSS）洗涤。在存在或不存在血清的情况下，将重组SARS-COV-2 RBD-FC融合蛋白以0.1μg/ml的终浓度（在第7天通过RBD疫苗接种的小鼠在第7天免疫的小鼠中的血清，在第7天接种后，在第一次疫苗接种后，首次疫苗接种的小鼠和PBS作为对照组的小鼠的血清）在不同的稀释液中。将细胞在室温下孵育30分钟。用HBSS将细胞洗涤3次，然后用抗人IgG-Fitc结合物（Sigma-Aldrich）以1:50稀释染色30分钟。洗涤后，将细胞用PBS中的1％甲醛固定，并使用Novocyte流式细胞仪（ACEA Biosciences）进行处理。使用FlowJo V10软件分析结果。 　　为了评估SARS-COV-2感染的中和，将Vero E6细胞（5×104）播种在96孔板中并过夜。在添加细胞之前，将50％组织培养感染剂量（TCID50）的SARS-COV-2与来自免疫小鼠或猴子的稀释血清预孵育。在37°C孵育1小时后，将混合物添加到Vero E6细胞中。在感染后的第3天，在显微镜下记录了细胞病作用，并计算了导致完全或EC50抑制的血清稀释液的中和滴度28。 　　如先前所述的13,16,29，通过测量ACE2转染的HEK293T细胞的感染来进行使用伪病毒的中和测定。简而言之，HEK293T细胞用编码编码密码子优化的SARS-COV-2 S蛋白，绿色荧光蛋白（GFP）载体（Plenti-EGFP）和GAG/POL表达质粒的质粒转染，使用Polyerthyimide（Sigma-Aldrich，700193）。转染6小时后，将培养基替换为新的完整培养基。然后，收集转染后48小时，收集了含有EGFP表达伪病毒的培养上清液，通过0.45μm的孔径尺寸过滤器（Millipore，SLHP033RB）进行过滤，浓缩用超滤光的中心管浓缩，并在1 ml处存储在-800°C处。通过将HEK293T细胞与编码密码子优化的SARS-COV-2 S蛋白，plenti-EGFP载体和gag/pol表达质粒共转移HEK293T细胞来产生表达EGFP的假型病毒。转染后48小时收集含有假病毒的上清液，并在各种稀释液或对照血清中与免疫小鼠，兔子或猴子的血清预孵育。在37°C下孵育1小时后，将混合物添加到ACE2转染的HEK293T细胞中，以检测病毒感染性。第二天和感染后48小时更改培养基，通过荧光显微镜和流式细胞仪确定感染细胞中的EGFP表达。 　　使用涂有S蛋白的SARS-COV-2假病毒测量ACE2转染HEK293T细胞中的50％中和活性。该假病毒是基于VSV G Pseudotype病毒（G*ΔG-VSV）的主链生成的。简而言之，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，L3000015）将表达SARS-COV-2 S的PCDNA3.1.S2转染到HEK293T细胞中。然后，转染后24小时，HEK293T细胞使用四种感染的多种感染感染G*ΔG-VSV。2小时后，将转染的细胞用PBS洗涤，加入新鲜培养基，并将细胞孵育24小时。收集含有假病毒的培养上清液，通过0.45μm孔径滤波器（Millipore，SLHP033RB）过滤，并存储在-80°C下直至使用。SARS-COV-2伪病毒表达人ACE2的HEK293细胞在三倍稀释系列中确定来自小鼠，兔子或猴子的血清中。SARS-COV-2假病毒的主链由VSV G Pseudotype病毒（G*ΔG-VSV）提供，该病毒包含萤火虫荧光素酶的表达盒，而不是VSV Genome30中的VSV-G。 　　所有涉及非人类灵长类动物的程序均由中国医学科学院医学生物学研究所的机构动物护理和使用委员会审查和批准，并在Kunming国家高级生物安全灵长类动物研究中心的ABSL-4设施中进行。实时SARS-COV-2使用了十二种成人非人类灵长类动物（5-9岁）进行挑战研究。将动物分配给以下组：（1）用40μgRBD蛋白和氢氧化铝辅助辅助剂的每剂量免疫（n = 4）；（2）用20μgRBD蛋白免疫，每剂量用氢氧化铝（n = 3）免疫；（3）用PBS处理（对照治疗，n = 3）;（4）单独用氢氧化铝辅助治疗（n = 2）。非人类灵长类动物在第0天和第7天通过两次注射，然后在第一次疫苗接种后第28天通过鼻内（0.5 mL，106 pfu/ml）进行SARS-COV-2挑战。RT – QPCR测定法用于测量病毒hrna和sgRNA（后者指示病毒复制）。通过RT – QPCR测量肺组织，喉咙拭子和肛门拭子中的病毒载荷。所使用的引物和探针序列源自n基因（正向，5'- gggggggaCttctcctgctagaat-3';反向，5'-cagacattttgctctcctcaagctg-3'; probe，5'-fam-fam-ttgctgctgctgctgctgctgcttgcttgacttgacagatt-tamra-3'），根据序列的序列。SARS-CoV-2 E gene subgenomic mRNA, indicative of virus replication, was assessed by RT–qPCR as previously described31, using the following primer and probe sequences (forward, 5′-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC-3′; reverse, 5′-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3′; probe,5'-FAM-CGAAGCGCAGTAAGGATGGTGTGTGT-QUENCHER-3'）。 　　对于石蜡包裹的切片，收集组织，固定在10％中性缓冲的福尔马林中，并嵌入石蜡中，并制备5μm的切片，以用于标准的降催血蛋白和曙红染色。 　　与老鼠研究相关的所有程序均由北京联合医学院实验室动物科学研究所的机构动物使用和护理委员会审查和批准。使用HEPA过滤器的隔离器在动物生物安全3级设施中进行小鼠研究。使用特定的无病原体HACE2小鼠进行了将小鼠感染的小鼠感染的实验，该小鼠由北京联合医学院实验室动物科学研究所建立了一个菌落。通过将小鼠ACE2启动子进行微注射的转基因，从ICR小鼠中驱动人ACE2编码序列到受精OVA的原核，从而产生转基因小鼠，如其他Where32。国立食品和药物控制机构提供了具有C57BL/6背景的转基因HACE2小鼠。 　　如先前所述23,34，对脾脏T细胞进行了过养治疗。具有C57BL/6背景的HACE2小鼠在第三剂候选疫苗或用PBS治疗作为对照的小鼠后9天，从具有相同C57BL/6背景的小鼠中分离出5×107的脾T细胞。 　　先前已经描述了使用血清的过继疗法26。使用免疫血清进行免疫血清的产卵疗法，使用来自免疫小鼠的0.1 mL合并血清。此外，具有ICR背景的HACE2小鼠从小鼠中接受了0.8 ml血清，这些小鼠用单剂量的疫苗接种了7天，随后受到Live SARS-COV-2的挑战。在挑战现场病毒挑战后5天，将这些小鼠安乐死。随后评估了肺组织中的病毒负荷，肺组织病理学变化和体重变化。通过RT – QPCR测量肺组织中的病毒载荷。肺组织的切片被降血石和曙红染色，并使用光学显微镜进行评估。 　　如先前所述35，用流式细胞仪评估T细胞。用S蛋白或PBS的RBD免疫的小鼠安乐死，并收集淋巴细胞。在RPMI 1640培养基中培养淋巴细胞，该培养基提供10％（v/v）FBS，100 U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1 mM丙酮酸（全部来自Gibco），50μmβ-甲醇，β-甲醇，20 U/mL IL-2（均为20 U/ml IL-2）同时，添加1μg/ml的S蛋白RBD以激活细胞。在染色之前4-6小时给予Brefeldin A（BD Biosciences）以阻断细胞内细胞因子分泌。然后将细胞在PBS（Gibco）中洗涤，并用抗CD8，抗CD4，抗CD44，抗B220和抗MHC-II抗体在4°C下染色30分钟（全部来自Biolegend）。之后，将细胞固定并透化以促进用抗IFNγ和抗IL-4抗体（全部来自Biolegend）的细胞内染色。在Novocyte流式细胞仪（ACEA Biosciences）上获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo V10软件进行分析。 　　使用Prism 8.0（GraphPad软件）进行统计分析。使用Tukey的多ANOVA与Tukey的多ANOVA进行了多个时间点的比较，并进行了Tukey的多个ANOVA。使用单向方差分析进行了多组之间的比较，然后进行Tukey的多次比较后测试。使用未配对的学生的t检验进行了两组之间的比较。p值<0.05被认为是显着的。*p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。NS，并不重要。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。