厌氧内共生体通过反硝化产生纤毛宿主的能量

　　没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。 　　名称“ Azoamicus”将前缀Azo-（新拉丁语，与氮有关）与Amicus（拉丁语，男性名词，朋友）结合在一起；因此，给出了azoamicus（“与氮有关的朋友”），暗示了其作为硝化内共生体的作用。“ ciliaticola”将纤毛（指纤毛的原生动物）与后缀-Cola（源自拉丁语男性名词Incola，居民，居民）结合在一起，因此意思是“居住在纤毛内”。 　　我们于2016年9月和2018年10月在位于Zug湖南部湖水盆地的一个单一站（约197-m的水深）（47°06'00.8'''n，8°29'35.0'e）进行了抽样的地球化学分析。2016年9月，我们使用多参数探测器来测量电导率，浊度，深度（压力），温度和pH（XRX 620，RBR）。溶解的氧气以正常和痕量的微距（PST1和TOS7型，饲养型）在线监测，检测极限分别为125和20 nm，响应时间为7 s。2018年10月，我们使用了配备Clark型氧气传感器（准确性±3％，分辨率为0.1％）的CTD（CTD60，SEA和SUN Technology）来记录氧气剖面。 　　大量DNA和RNA分析的水是在2016年9月和2018年10月收集的。先前已经描述了2016年9月的DNA和RNA提取的样本收集46。2018年10月，用160 m，170 m和180 m的Niskin瓶（Hydro-Bios）对水采样。对于每个深度，将2 L的湖水直接在我们的船上过滤到我们的船上，使用蠕动泵上的0.22μmSterivex滤镜（Merck Millipore），随后用Rnalater保存溶液（Life Technologies）清除，并将其存储在-20°C下直至进一步处理。对于原位杂交（FISH）分析，将来自相同深度的水固定在船上，船上用甲醛（最终浓度为1.5％；电子显微镜科学），并在冷藏箱中孵育约6小时，然后过滤到3-μm聚碳酸酯滤液到Merck Filipore上。2019年5月从189 m的水深收集了使用相同方法的其他鱼类样品。 　　在2019年5月，使用10 L Go-Flo瓶（一般的海洋学），将水的水深度从189米的水深度采样，将水填充到没有顶空的2.5-l玻璃瓶中，用丁基橡胶止动物封闭并保持冷（约4°C），然后再处理直至进一步处理。在抽样过程中，通过用缺氧的湖水溢出瓶子，可以最大程度地减少氧气污染。 　　为了进行鱼类和差异干扰显微镜分析，从湖水（从2020年2月收集的186-m深度，深度为186-m的深度）中挑选了单个活的纤毛，并直接固定在显微镜载玻片上。简而言之，在室温下用0.1 mg ML-1聚赖氨酸处理10分钟，用Milliq水洗涤并干燥。纤毛通过5μm膜过滤器的散装湖水的重力流动，并在双眼显微镜下使用玻璃毛细管采摘。将采摘的纤毛在聚赖氨酸涂层的显微镜载玻片上转移到甲醛（0.1×PBS，pH 7.6中的2％）中，孵育（在室温下孵育1小时），并用milliq水洗涤。如“双标记寡核苷酸探针荧光原位杂交和显微镜”中所述进行鱼类。 　　从15个离散深度和下方的氧气底部的15个离散深度中检索了养分测量的水样（铵，NOX和亚硝酸盐）。将40毫升的水直接注入50 mL猎鹰管中，其中含有10 mL OPA试剂进行荧光铵定量47。在2018年，使用相同方法确定铵浓度，只是在采样后立即对湖水进行无菌过滤，并在-20°C冷冻直至进一步加工。对于NOX定量，将10 mL的水无菌过滤成15 ml猎鹰管，并通过商用Quaatro分割流动分析仪（密封分析）确定硝酸盐和亚硝酸盐浓度。 　　“ candidatus A. ciliaticola”特异性的16S rRNA基因引物是根据'ca设计的。A.纤毛的圆元组组装基因组序列。底漆针对16S rRNA基因的上游和下游约50 bp的基因间间隔区，导致1,568 bp-l-tong的PCR产物。对于克隆图书馆的构建，‘ca。A. ciliaticola的16S rRNA基因通过嵌套的PCR方法从2016年9月使用新设计的'Ca从160-m水深获得的元基因组测序的同一DNA提取物进行扩增。A. ciliaticola的特异性引物（EUB62A3_29F和EUB62A3_1547R），然后用一般细菌16S rRNA基因引物（8F和1492R）进行PCR扩增（补充表2）。克隆和克隆库的克隆和构建在补充方法中更详细地描述。通过使用BigDye终端v.3.1测序试剂盒（Thermo Fisher Scientific）和引物M13F或M13R进行Sanger测序，对五个克隆的纯化质粒插入片段进行了测序。测序PCR包含3μL纯化的质粒，0.5μL10×测序缓冲液，0.5μl引物（10μM）和1μLBigdye试剂。PCR反应如下：99个循环（1°C S -1斜坡）的变性（在96°C下为10 s），退火（60°C下的5 s）和伸长延伸（60°C下4分钟）。使用凝胶过滤（Sephadex G-50 Superfine，Amersham Bioscience）纯化PCR产物，然后使用Sanger测序（3130XL遗传分析仪，Applied Biosystems）。在修剪矢量和引物序列之前，使用Sequencher V.5.4.6和标准设置对Sanger序列进行了质量修剪和组装。 　　可视化‘ca。A. ciliaticola的细胞在环境中，我们根据'ca设计了一种特定的鱼类探针。A.纤毛的元基因组组装基因组16S rRNA基因序列和进化枝EUB62A3中的序列紧密相关的序列。‘ca。A. ciliaticola的16S rRNA基因序列被进口到ARB48 v.6.1中，并使用Sina-Aligner49对齐SILVA SSU REF NR 99 132数据库。针对Ca的鱼类探针。A. ciliaticola’和Crade Eub62a3的大多数成员都是设计的（探针EUB62A3_813 5'CTAACAGCAAGTTTTTTTTTTTTTTCATCATCGTTA 3'）（补充表3）使用ARB中实现的探针设计工具，并进一步使用Mathico 50中的探针设计工具。新设计的探针EUB62A3_813靶向‘ca。A. ciliaticola’和'ca的78％。SILVA SSU参考NR 99 138中包含的Azoamicus的亚组A和B序列（9中的7个；未靶向的2个序列属于“ Ca. azoamicus”亚组B），并且没有显示非目标命中。数据库中的某些序列只有1或2个弱不匹配（<0.5 weighted mismatches) to the probe sequence. To ensure specificity in our FISH experiments and exclude the detection of nontarget organisms, we designed unlabelled competitor probes for these sequences with weak mismatches to the probe (competitor 1, 5′ CTAACAGCAAGTTCTCATCGTTTA 3′ and competitor 2, 5′ CCAACAGCAAGTTCTCATCGTTTA 3′) (Supplementary Table 3). These competitor probes were included in all FISH experiments (excluding clone-FISH). To further ensure that no nontarget organisms were present in our samples, we searched for 16S rRNA gene reads with perfect matches against the eub62A3_813 probe sequence in one metagenome (Zug 2018, 180 m). Almost all of the reads (82 out of 86) had >与16S rRNA基因序列的98％的身份。A. ciliaticola’。其余的读取共享> 94％的身份。A. ciliaticola’共同作为属于'ca的最高命中序列。Azoamicus的子组A爆炸针对NCBI NR数据库（2020年6月访问）。 　　如先前所述51进行克隆鱼。简而言之，含有'ca的纯化质粒。在正确的方向（使用M13F和1492R Primers通过PCR确认（通过PCR确认），A. ciliaticola的16S rRNA基因序列（如“克隆库的构建和sanger测序”所述）被使用电动机（de3）（de3）（de3）细胞（de3）细胞（de3）细胞（prome coc）转化为电式高素质（prome），并通过电源（de3）（prome）进行了电源（prome）（giag prome）（de3）。330μF电容，低欧姆阻抗，快速充电速率和4kΩ电阻（电压助推器）。电穿孔后，将细胞转移到SOC培养基（Sigma Aldrich）中，在37°C下孵育1小时，并将其镀到含有100 mg L -1 Kanamycin的LB板上。在37°C下孵育过夜后，采摘4个克隆，并如“克隆文库结构和Sanger测序”中所述，用PCR（Primers M13F和1492R）检查插入物的存在，然后检查凝胶电泳。随机选择一个插入阳性克隆，并在37°C的LB培养基中生长，其中含有100 mg l-1 kanamycin，直到600 nm的光密度达到0.37。使用异丙基β-1-1-硫代乙型吡喃糖苷（IPTG）（1 mM终浓度）诱导质粒插入物的转录。添加IPTG后，将细胞在37°C下孵育1小时，然后再添加170 mg L -1氯霉素，然后孵育4小时。通过离心收集细胞，在室温下固定在2％甲醛溶液中1小时，洗涤并在4°C的磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中储存，含有50％乙醇，直到进一步加工。使用'ca进行甲酰胺熔融曲线52进行。Azoamicus特定的HRP标签探针（EUB62A3_813）（扩展数据图5）。简而言之，将细胞应用于载玻片。用溶菌酶，过氧化物酶失活，杂交（10％，30％，35％，40％，45％和50％甲酰胺）和泰米酰胺信号扩增（俄勒冈州绿色488） 如前所述进行53。对于每种甲酰胺浓度，使用所有甲酰胺浓度的相同曝光时间记录了三个视野的图像，在10％甲酰胺下使用Axio Imager 2显微镜（Zeiss）进行了优化，并使用DAIME 2.154进行了分析。 　　与双标记的寡核苷酸探针（用Atto488染料终端双标记；探针的详细信息）在补充表3中（Biomers）和DAPI抗染色，如前所述55进行了反染色。简而言之，将样品（如“样品收集”中所述的切割过滤器部分或固定在载玻片上的纤毛切片或固定）在含有25％甲酰胺和5 ngDNAμl -1探头的杂交缓冲液中孵育（使用相同的浓度（用于EUB62A3_813_813竞争者1和2），在46 h h ht Amm中洗涤3 h，并在46 h h hrast中洗涤（使用相同的浓度）EDTA，159毫米NaCl）在48°C下持续30分钟。经过短暂的Milliq洗水后，将样品在DAPI溶液（1μgml-1）的室温下孵育5分钟，在Milliq水中短暂洗涤并进行气干。将过滤器切片安装在载玻片上。将样品嵌入延长的金抗固定植物（Thermo Fisher Scientific）中，并固化24小时。共聚焦激光扫描和差异干扰对比度显微镜在Zeiss LSM 780上进行（Zeiss，63×油目标，1.4数值光圈，具有差分干扰对比度的棱镜）。获得Z-stack图像以捕获整个纤毛细胞，并将鱼类探针的荧光图像投射为2D以进行可视化。使用Axio Imager 2显微镜（Zeiss）在聚碳酸酯过滤器上（孔径为32 mm，有效滤波器直径; Merck Millipore; Merck Millipore）上，使用Axio Imager 2显微镜（Zeiss）进行细胞计数。 　　对于光学显微镜，从Zug湖水（2019年5月，189 m）中挑选了活纤毛，并准备使用光学显微镜的实时纤毛成像，如前所述56在Axio Imager 2显微镜（Zeiss）上。对于图像获取和处理，使用了Zeiss Zen（蓝色版）2.3。 　　在2020年2月采样的纤毛在双眼显微镜下单独采摘，并在无菌过滤的湖水中洗涤。然后将洗涤后的纤毛液转移到多酰胺涂层的硅晶片（0.1 mg ml-1聚赖氨酸均匀的固定剂）上，在室温下10分钟）将大约200μl固定剂转移到固定的固定剂中，并在室温下固定1小时。该固定剂包含2.5％的Phem Buffer57（pH 7.4）中的2.5％戊二醛（V/V，电子显微镜级）。在自动化重点干燥之前（EM CPD300，Leica），将附着在硅晶片上的固定纤毛脱水（30％，50％，70％，80％，96％和100％）。扫描电子显微镜在Quanta FEG 250（FEI）上进行。使用FEI XTM v.6.3.6.3123在高真空条件下的加速电压下获得图像，并使用Everhart -Thornley二级电子检测器捕获。该图像代表了一个集成和漂移校正的阵列的128张图像，该阵列以50 ns的停留时间捕获。 　　从Zug湖水（189 m，2019）的双眼显微镜下，用玻璃微孔挑选了纤毛，随后在转移到裂解缓冲液中之前在无菌无核酸酶的水（Amb）中洗涤两次。根据制造商的说明，使用Masterpure DNA纯化试剂盒（Ambion）提取DNA，最终洗脱为1×TE缓冲液（25μL）。总体而言，从四个单独的纤毛（S1 – S4），五个（C5）和十个合并纤毛（C10）以及无纤毛（对照）中提取DNA。然后使用PRCR使用引物对EUB62A3_29F/_1547R和CIL_384F/_1147R分别放大16S（Ca. A. ciliaticola'）和18S rRNA基因序列（纤毛宿主）。PCR反应（20μL）与'ca。如“克隆库结构和Sanger测序”中所述，进行了A. ciliaticola的特异性引物（EUB62A3_29F/_1547R），并进行了以下修改：5μL模板，58°C，将其58°C退火温度和40个扩增循环。具有纤毛特异性引物（CIL_384F/_1147R）的PCR类似于以下修饰：55°C退火温度，50 s的伸长和35个扩增周期。使用第一轮中的2μLPCR反应，在第二轮PCR（在相同条件下）在第二轮PCR（在相同条件下）中进一步扩增了与引物对EUB62A3_29F/_1547R的PCR反应。对于每个PCR步骤，如补充方法中所述，使用凝胶电泳对产物的成功扩增。随后使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）根据制造商的说明对PCR反应进行纯化，并在无菌无核酸酶的水（25μL）中使用最终洗脱（Ambion）。随后使用Sanger测序对纯化的PCR反应进行了测序，并按照“克隆库的构建和Sanger测序”进行处理，并进行了以下修改：EUB62A3_29F，EUB62A3_1547R（EUB62A3_1547R）（死亡温度58°C）或CIL_384F，CIL_384F，CIL_384F，CIL_1147（CIL_1147）。用内共生特异性引物扩增的两个单丝脱位DNA提取物显示出微弱的（S4）或NO（S2）谱带，未对其进行测序。 　　先前已经描述了2016年收集的湖水样品的批量DNA和RNA提取以及元基因组和元转录组测序。46。对于2018年以来的样品，将过滤器清除了rnalater，并用无核酸酶的水冲洗并从sterivex弹药筒中取出。然后根据制造商的说明，使用动力水RNA或DNA隔离试剂盒（Mobio Laboratories）从单独的过滤器中提取RNA和DNA。 　　对于宏基因组测序，按照Nebnext Ultra II FS DNA库预备套件的Illumina（新英格兰Biolabs）的建议，DNA库是由DNA库制备的。通过2×250 bp读取模式在Illumina Hiseq2500 Suequencer（Illumina Inc.）上进行测序。对于元文字测序，除去rRNA（细菌的核糖零rRNA去除试剂盒（Illumina）），并根据Illumina（新英格兰Biolabs）的Nebnext Ulta Ulta II Uripa定向RNA库预备试剂盒制备RNA测序文库。通过1×150 bp读取模式在Illumina Hiseq3000 Suequencer（Illumina）上进行测序。图书馆的准备和测序由Max Planck Genome Center Cologne（http://mpgc.mpipz.mpg.de/home/）进行。可以在补充表4中找到每个元基因组和元文字数据集的详细信息。 　　'ca的基因组。A. ciliaticola’ was reconstructed from a metagenomic dataset sampled in 2018, as follows: metagenomic reads (MG_18_C) were trimmed using Trimmomatic58 v.0.32 as previously described46 and assembled using metaSPAdes59 v.3.13.0 and k-mer lengths of 21, 33, 55, 77, 99 and 127. From this assembly,与先前重建的'ca相似的重叠群。来自2016年的元基因组样品的纤毛基因组（在补充方法中提供了更多详细信息）通过BLASTN（身份> 95％）鉴定出来，并使用BBMAP60 v.35.43（MinID = 0.98）将元基因组读数映射到重叠群。随后使用Spades v.3.13.0重新组装了映射的读取，并具有不匹配的校正器和覆盖阈值（ - - 保养-cov-cutoff 60），导致组装单个重叠群（292,647 bp）（292,647 bp）（292,647 bp），通过将相同的重叠结束（127 bp）缩短（127 bp），从而构成了循环的（127 bp）（127 bp）。开始位置是在用Orifinder61 v.1.0生成的GC差异曲线最大值附近的基因间间隔区域设置的。这两个独立组装的圆形元基因组组装基因组（从2016年和2018年元基因组（补充方法））具有99.99％的身份。对于所有随后的分析，从2018年数据集重建的基因组均由覆盖范围较高。 　　使用Prokka62 V.1.13.3的修改版本进行基因组注释，以允许对与TRNA基因重叠的基因注释。使用NCBI非冗余蛋白或保守域数据库的搜索对关键代谢基因的注释进行了手动检查和完善。使用转运蛋白自动注释管道Web Service64和Transporter分类数据库进行预测并分类跨膜转运蛋白。使用伪Finder66 V.0.11和标准设置预测假基因。使用DNAPLOTTER67 V.18.1.0创建圆形基因组图。 　　为了进行比较分析，蛋白质编码的CD在昆虫内共生基因组中编码（C. ruddii PV，AP009180.1和B. aphidicola bcc，CP000263.1），J.Libera的线粒体（NC_021127）和自由生活的相对，A. ciliaticola’（L. Clemsonensis，CP016397.1）从NCBI GenBank下载。另外，使用prokka注释获得了纤毛内共生抗体C. taeniospiralis（PGGB00000000.1）的蛋白质编码CD。使用Eggnog-Mapper V.1 Web Service68进行映射模式钻石和标准设置进行功能类别的分类。CA的功能C（能源生产和转换）的分类。A. ciliaticola’进行了修改，还包括Norb和Nirk，这些Norb和Nirk分别分为不同的类别（分别为Q和P）。 　　'ca的多序列比对。A. ciliaticola’和其他质体和细菌ATP/ADP易位酶是使用MuscleWS69 v.3.8.31生成的，其jalview70 v.2.11.1.1.0中实现了默认设置。 　　如前所述46，将原始的元转录光照明读取和去除rRNA序列的去除。然后将非RRNA读数映射到'ca的基因组。A. ciliaticola使用Bowtie271 v.2.2.1.0和标准参数。使用SAMTools72 V.0.1.19和每个功能的成绩单（基于Prokka注释）生成分类和索引的BAM文件，使用Edge-Pro73 V.1.3.1和标准设置量化。随后，使用公式将基因转录定量为每百万74（TPM）的转录本： 　　要分配每个功能（i）TPM值，其中C =特征数，L =长度（以Kb为单位）和J =所有功能。 　　读取覆盖范围可视化和绘图是使用DeepTools276 v.3.2.0中实现的PygenoMetrackS75（平均覆盖率）进行的。 　　全长16S rRNA基因序列是从'ca的圆形元基因组组装的基因组中检索出来的。A. ciliaticola使用Rnammer77 V.1.5，使用SILVA增量Aligner49（Sina 1.2.11）对齐，并使用ARB48 v.6.1进口到Silva SSU NR99数据库45（版本132）。通过NCBI非冗余核苷酸数据库和JGI IMG/M 16S RRNA公共组装的宏基因组（2018年7月检索），通过BLASTN鉴定了其他密切相关的16S rRNA基因序列，并进口到ARB中。使用RAXML78 v.8.2.8计算ARB中与速率异质性的伽马模型和100个bottraps的GTR替代模型，使用RAXML78 v.8.2.8计算了16S rRNA基因序列的最大可能样式的系统发育树。对齐不受加权面膜或过滤器的约束。对于扩展数据中显示的完整树，图4，附加‘ca。A. ciliaticola的序列是从克隆库中获得的，并使用ARB中实现的简约“快速添加”算法添加了单个纤毛。 　　对于纤毛系统发育，使用MAFFT79在线服务版本7（参数： - addFragments），将塞子测序获得的序列添加到Eukref-Ciliphora30 plagiopyoplela子组对齐中。使用Thyloflash80 v.3.0从其中一个湖ZUG元基因组（MG_18_C）获得了分配给岩绿体的额外组装全长18S rRNA基因序列，也添加到对齐中（参数： - add）。使用IQ-TREE WebServer（http://iqtree.cibiv.univie.ac.at）运行iq-tree81 1.6.11的系统发育树（http://iqtree.cibiv.univie.ac.at）具有默认设置和自动替代模型选择（最佳拟合模型：tim2+f+i+g4）。使用Life v.4 Web Service 82使用互动树对系统发育树进行可视化。 　　对于ATP/ADP易位酶的系统发育树，使用NCBI BLASTP Web-Service83访问了NCBI RefSeq（250个最高命中）和NCBI NR（15个上命中率）（均为2019年6月访问）氨基酸序列。A. ciliaticola’（ESZ_00147）作为查询。还添加了补充表8中列出的其他表征核苷酸转运蛋白的氨基酸序列。去除重复项后，使用usearch84 v.8.0.1623将序列聚集在95％的身份下，并使用muscle69 v.3.8.31对齐。如18S rRNA基因系统发育树所述，使用IQ-Tree（最佳拟合模型：LG+F+I+G4）的系统发育树结构和可视化进行了可视化。 　　进行了孵育实验，以提供与纤毛宿主相关的硝化活性的实验证据。建立了三个孵育，其中包含（a）没有纤毛（过滤的分数），（b）富含纤毛（富集的馏分）和（c）散装湖水的湖水。对于这些实验，在12°C的杂物袋中，使用10μm聚碳酸酯过滤器（Merck Millipore）在12°C的N2大气下使用湖水进行分级。通过0.5 l水的重力过滤获得富集和过滤的馏分，直到将0.25 l上清液保留为止。因此，在富集的馏分中，将0.5 L湖水的纤毛浓缩在0.25 l的湖水中。在过滤的馏分中，将大于10μm的生物（包括纤毛）过滤掉。将富集的水（加过滤器）和过滤后的水都转移到分开的血清瓶（无顶空）中，并用丁基橡胶止动物封闭。对于散装孵化，未经过滤的水直接填充成N2大气下的250 mL血清瓶中。 　　通过测量15n-硝酸盐和15n-硝酸盐修订的同位素比率质谱的孵育（等级精度运行Ionos V.4.04，Elementar）中的15n-硝酸盐修订孵育来评估硝化电位。设置了250毫升血清瓶的30毫升氦顶空，并用氦气脱气10分钟，以确保缺氧条件并减少N2背景。以99％的标记百分比提供了15N标记的硝酸盐和亚硝酸盐（分别为20μM和5μM终浓度； Sigma Aldrich），并在黑暗中将水在4°C下孵育30小时。在孵育期间，通过撤回3 mL气态顶空的时间间隔进行顶空的子样本，并同时用氦气替换去除的体积。将这种气体样品转移到12 mL驱虫剂（LABCO）中，这些升级器已预先填充氦气量化的水，并存储直至分析。在同位素比率质谱仪上测量气体样品中的30N2，并根据实验时间过程中空间中的30N2线性增加的斜率计算了反硝化速率。校正了30N2产生的速率，以稀释由子采样和测得的15N标记百分比引入的顶空。‘约在固定后的微观计数，FISH杂交（EUB62A3_813）和DAPI染色后，通过在“双重标记的寡核苷酸概率”中所描述的，通过微观杂交和DAPI染色来评估不同孵化瓶中的纤毛纤毛丰度。 　　没有使用统计方法来预先确定样本量，并且实验未随机化。在实验和结果评估中，研究人员并未对分配视而不见。 　　在图1a中，扫描电子显微镜图像是从1个实验获得的n = 6个记录图像的代表。在图1B中，差分干扰对比图像是从1个实验获得的n = 6个记录图像的代表。 　　在图2C中，扩展数据图2i。鱼荧光图像（EUB62A3_813探针）代表了n = 33个记录的图像，这些图像是从3个生物学重复样品的5个独立实验中获得的。 　　在图2C中，扩展数据图2F，h，j。DAPI荧光图像代表了n = 21个记录的图像，这些图像是从3个生物复制样品的5个独立实验获得的。 　　在扩展数据图2a中，鱼荧光图像（Arch915探针）代表了从1个实验获得的n = 6个图像。在扩展数据中，图2B，D，F420自荧光图像代表了n = 11个记录的图像，这些图像是从1个样本的3个独立实验中获得的。在扩展数据中，图2c，g，鱼荧光图像（EUB-I探针）代表了从2个生物学重复样品的3个独立实验获得的n = 15张图像。在扩展数据图2E中，鱼荧光图像（非338探针）代表了n = 15个记录的图像，这些图像是从2个生物学重复样品的3个独立实验中获得的。 　　在扩展数据图5A中，6个鱼荧光图像（EUB62A3_813探针）中的每一个都代表了1个实验中的n = 3个图像。 　　对于所显示的荧光图像，分析的细胞的数量通常比最终记录的细胞数量高得多（n> 100）。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。