细菌CGA感应病毒RNA以启动免疫力

　　在补充表1中列出了本研究中使用的细菌菌株。S。金黄色葡萄球菌菌株RN422025在37°C下生长在脑心脏输液（BHI）肉汤中，并补充氯霉素（10μgml-1）或erythl-trapercin（10μgml-1），以递增（BHI）肉汤（BHI）肉汤（BHI）肉汤（10μgML-1），以达到10μgml-pc19444.119444444。质粒40。培养物补充氯霉素（5μgml-1），以选择具有染色体整合的SSC-CBASS或SSC-CDNE03的菌株。在适当的情况下，通过添加1 mM异丙基-1-甲状腺乳糖苷（IPTG）或100 ng ML-1 ATC来诱导基因表达。 　　在补充表2中列出了本研究中使用的噬菌体。为了产生高尊敬的噬菌体库存，将金黄色葡萄球菌RN4220的隔夜培养稀释为1：100，并在BHI肉汤中添加到中期（〜90分钟），并补充了5 mmmmmmmmmmmmmm的CaCl2。将培养物稀释至0.5（〜1×108 CFU ML -1）的OD600。通过在0.1（〜1×107 PFU ML -1）的MOI中添加噬菌体或与单个挑选的斑块或冷冻库存的刮擦接种来感染培养。感染培养物在37°C下生长，并摇动并监测裂解（通常在〜3–4 h时观察到浊度的全部损失）。将培养裂解液离心（4,300克10分钟），以颗粒细胞碎片。收集上清液，通过无菌膜过滤器（0.45μm），并存储在4°C下。通过连续稀释获得的库存的量子以十倍增量并在BHI软琼脂与RN4220混合并补充5 mM CaCl2的BHI软琼脂上确定噬菌体浓度。在37°C下孵育过夜后，对单个斑块（即无细菌生长区域）进行计数，并计算了病毒滴度。 　　本研究中使用的质粒（及其构造的细节）和寡核苷酸引物分别列出在补充表3和4中。SSC-CBASS和PHAGE基因产物的编码序列分别从S. schleiferi 2142-05培养基的基因组DNA制剂中获得22或噬菌体库存41。 　　SSC-CBASS或SSC-CDNE03以及氯霉素耐药性（CMR）盒被整合到HSDR基因中（编码S. aureus rn4220中的限制性修饰系统的有缺陷的R-subunit），该插入部位先前没有影响生长42。SSC-CBASS-CMR和SSC-CDNE03-CMR分别从质粒PDVB303和PDVB301分别扩增，使用引物ODVB565和ODVB566，它们在两端的LOXP位点侧面侧面为60 bp的同源性区域。用1-2μgPCR产物将具有重新组合质粒PPM300的电抗金黄色葡萄球菌RN4220细胞电穿孔，并用氯霉素（5μgml -1）选择。通过菌落PCR和功能免疫筛选潜在的整合体，然后通过Sanger测序进行验证。 　　为了构建噬菌体φ80α26的有毒突变体，我们使用了先前描述的方法来生成φNM1γ627，φNM4γ428和φ12γ329。φ80α-VIR被隔离为自发的Escaper，在φ80α感染后形成清晰的斑块，该斑点是金黄色葡萄球菌RN4220细胞的BHI软性草坪，该细胞含有质粒PDVB08，该细胞带有质粒PDVB08，该细胞构建了IIII-A CRISPR – CAS系统，该系统靶向构成φ80αcici ci-ci-ci-ci-like-like-like-like-like-like-like-like-like-like-like-like。φ80α-VIR CI基因和Sanger测序的PCR证实了8 bp的缺失。 　　金黄色葡萄球菌菌株NRS52，NRS102和NRS110来自金黄色葡萄球菌（NARSA）存储库中的抗菌抗性网络（BEI/NIAID）在37°C下在Mueller Hinton II（MHII）的37°C下过夜（200 rpm）。第二天，将培养物稀释为1：100至10 ml新鲜的MHII，并长大了一个小时才能进入早期日志阶段。然后，通过在每种培养物中以0.8 mg ml -1的最终浓度添加环丙沙星来诱导预言。在37°C下孵育4小时后，每种培养物被旋转，上清液通过0.22μm注射器驱动的滤波器过滤。通过连续稀释到金黄色葡萄球菌RN4220的草坪上获得这些滤液的单斑，并如上所述产生了高焦噬菌体。 　　将一百微米的隔夜细菌培养物与5 ml BHI软琼脂混合，并补充有5 mM CaCl2，并将其倒在BHI琼脂板上，以在室温（〜15分钟）下固化。噬菌体裂解物连续稀释十倍，并将4μl发现到软焦点表面。干燥后，将板在37°C下孵育过夜，并在第二天可视化。手动计数单个斑块（无细菌生长的区域）。 　　在补充了5 mM CaCl2的BHI中，将隔夜培养物稀释为1：100，并且适当的抗生素用于选择，在37°C下，摇动到中gog阶段（〜90分钟），并将其标准化为OD600 0.5。对于所需的MOI，将计算出的噬菌体量添加到每种培养物中，并将150μl的播种到96孔板的每个孔中。每10分钟在37°C的微板读取器（Tecan Infinite 200 Pro）中每10分钟测量OD600。 　　使用Direct-Zol RNA MiniPrep Plus试剂盒（R2072）从金黄色葡萄球菌细胞中提取总RNA。在使用随机六聚体的cDNA第一链合成之前，用cDNA第一链合成cDNA第一链合成之前，用Turbo DNase（Thermo Fisher Scientific）处理提取的RNA。使用快速SYBR绿色主混合（Life Technologies）和7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems）与S. Aureus S. aureus家政管理PTSG（ODVB426/427），CDNE03（ODVB610/611/611/611）或CAP15（ODVB15（ODVB426）（ODVB6114/615）一起进行QPCR。 　　Ssc-CdnE03, Sha-CdnE01, and various mutants were expressed and purified using the following approach: transformed BL21 (DE3) E. coli were grown in LB broth at 37 °C with shaking to mid-log phase (OD600 0.6–0.8), at which point the culture was cooled on ice for 10 min and induced with 0.2 mM IPTG for 16 h at 18 °C.收集细菌，重悬于裂解缓冲液中（25 mM Tris pH 7.4、300 mM NaCl，5％甘油，2 mMβ-羟基乙醇），并进行单个冷冻循环。将细胞与溶菌酶，DNase I和无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒在冰上孵育。在冰上孵育40分钟后，使用超声处理将细胞裂解。通过离心阐明裂解物，并应用于钴亲和树脂。结合后，在用含有300 mM咪唑的裂解缓冲液洗脱前用裂解缓冲液对树脂进行广泛洗涤。然后将洗脱的蛋白质用TEV蛋白酶蛋白质蛋白酶去除与反应缓冲液（25 mM HEPES-KOH PH 7.5，250 mM KCl，5％甘油，2 mMβ-cercapto乙醇）的透析中去除亲和标签。然后将切割的蛋白质通过钴树脂，以收集剩余的TAG（或未切换的蛋白质），并使用10,000 MWCO离心滤器（Amicon）浓缩。通过SDS -PAGE可视化纯化的蛋白质，并用于下游体外测定。 　　使用Whiteley等人描述的方法的变体进行核苷酸合成测定。最终反应（50 mm 3-（环己基氨基）-2-羟基-1-丙烷基磺酸（CAPSO）pH 9.4，50 mm kcl，5 mm乙酸镁，1 mm dtt，250或250 um ntps ntps trigy and ntps trigy and ntp and ntp，5 Ummand and nudim nuig lig lig lig lig lig lig ligMmande ntz添加酶。除RNA激活剂（2小时）外，所有反应均在37°C下孵育过夜。对于总RNA提取物的反应，将500 ng添加到每个条件中。补充表5中报道了用作活化剂的ssRNA寡核苷酸的序列。添加1 U的碱性磷酸酶停止了反应，该反应可去除其余NTPS上的三磷酸盐，并实现可视化环化核苷酸物种的可视化。孵育1小时后，将0.5μl的反应从PEI-纤维素薄层色谱（TLC）板的底部发现1.5 cm，间隔为0.8 cm。在1.5 m kh2po4 pH 3.8中开发了TLC板，直到缓冲区前部距顶部1厘米（〜12 cm）。将TLC板完全干燥，覆盖有保鲜膜，并暴露于磷光屏幕上，然后通过台风三人成像仪系统检测。 　　对于假定的激活剂在体外筛选，使用溶血蛋白（5 mg ML -1）在37°C下处理1小时，将RN4220细胞裂解，然后将澄清的裂解物添加到核苷酸合成反应中。使用聚乙烯乙二醇（PEG8000）沉淀富集噬菌体颗粒。然后将重悬的噬菌体用DNase和RNase处理，以确保仅保留噬菌体结构元素。根据巫师基因组DNA纯化试剂盒（A1120）制备了RN4220的基因组DNA。根据制造商的方案，使用聚乙烯乙二醇沉淀和CSCL梯度在噬菌体颗粒纯化后分离噬菌体的基因组DNA。使用直接-Zol RNA Miniprep Plus套件（R2072）从有或没有感染的金黄色葡萄球菌细胞中提取总RNA。 　　为了纯化SSC-CDNE03环核苷酸产物进行质谱分析，将核苷酸合成反应条件缩放至1 ml，其中含有5μMSSC-CDNE03、250 UM ATP，250 UM GTP，250 UM GTP，CABRNA，大约5 ng的Cabrna，约50 mm Capso ph 9.4，50mm kcl，5mMMMMMMMMMMM。缓冲。将反应在37°C下温和摇动24小时孵育24小时，然后在37°C下快速CIP（NEB）处理4小时。孵育后，通过10,000 MWCO离心滤波器（Amicon）过滤反应以去除蛋白质。 　　所有用于色谱的溶剂和试剂均为液相色谱 - 质谱法。超高性能液相色谱 - 分辨率质谱（UPLC-HRMS）数据是在由Sciexos软件控制的Sciex Excionlc UPLC上获得的。Chromatography was carried out on a Waters XBridge BEH Amide Column XP (2.1 × 150 mm, 2.5 µm), under the following conditions: 100% B from 0.0 to 1.0 min, from 100% to 70% B from 1.0 to 8.9 min, 60% B from 9.0 to 13.0 min, 100% B from 13.2 to 20.0 (A: 10 mM ammonium formate + 0.1% formic acid; B: 90%10 mM甲酸铵中的乙腈 + 0.1％甲酸缓冲液），流速为0.40 ml min -1和0.5 µl的注射体积。HRMS分析以MS1和MS2扫描的范围为M/Z 100-1,200范围内的正和负电喷雾电离模式进行；对Q2-MS2实验进行的最大候选离子为7，碰撞能量为5 V，温度为500°C。对于电喷雾离子化高分辨率质谱（ESI – HRM）实验，在5,500 V中设置了喷雾电压，Q2碰撞在30 V时，散布为10 V，而ESI – HRM的喷雾电压在4500 V中设置为4500 V，并在4500 V中设置了Q2 collutive in 35 collitution collution collution collutive in 35 collitution collistation and Spractation and Spraction and spractation and and spret。注射前，将溶液离心（13,000 rpm×3分钟）。分析了所有化合物的ESI模式的分子离子，但是ESI模式下的片段化表现出更好的一致性，因此用于结构分析。使用Mestrenova软件（14.3.0）进行了数据分析，使用ProteOwizard的MSCONVERT转换了数据输出，使用GNPS分子网络的平均MS2光谱从GNP中获得了MS2镜图。 　　使用用α-32P-ATP或α-32P-GTP标记的SSC-CDNE03反应进行核酸酶P1裂解分析。将放射性标记的核苷酸产物与核酸酶P1（80MU; N8630，Sigma）在缓冲液（30 mm乙酸钠pH 5.3、5 mm ZnSO4和50 mM NaCl）中孵育30分钟，在37°C的情况下在Quick CIP（NEB）的情况下37°C。如上所述，在PEI-纤维素TLC分析之前，在95°C下通过热灭活2分钟终止反应。 　　中型S期中的十毫升。金黄色葡萄糖RN4220培养物在MOI 10时被噬菌体感染至OD600 0.5。在第一次爆发完成之前，允许感染进行30分钟。将细胞在4,300g的4300克中颗粒5分钟，并用液氮闪烁。将沉淀重悬于150μlPBS和50μL溶血蛋白（5 mg mL -1）中，并在37°C下孵育30分钟。使用Direct-Zol RNA MiniPrep Plus试剂盒（R2072）从金黄色葡萄球菌细胞中提取总RNA。简而言之，将450μltrizol添加到裂解物中，剧烈涡旋并以16,000克离心30 s。总共将650μl的100％乙醇添加到上清液中，并彻底涡旋。整个体积通过Zymo-spin IIICG柱，然后在室温下用DNase I进行15分钟的列治疗。根据制造商的方案将色谱柱洗涤，并将RNA在100μl无核酸酶的水中洗脱。 　　如上所述，表达并纯化了HIS6 – MBP标签或HIS6标签的SSC-CDNE03以及SHA-CDNE01。仅纯化的HIS6 -MBP标签就可以作为阴性对照。将约0.2 mg的蛋白质固定在钴resin上后，将色谱柱用裂解缓冲液进行了大量洗涤，然后再添加5 ml含有1 mM MGCL2的裂解缓冲液，5单位RNaseout（Thermofisher，10777019），10777019），并从含有或不含Phage phage phage的培养物中提取了100μg的RNA。将RNA与标记的SSC-CDNE03在色谱柱上孵育40分钟，然后用5卷裂解缓冲液洗涤色谱柱。用HIS6标记的TEV蛋白酶处理该柱，以释放SSC-CDNE03并结合RNA。为每个样品收集洗脱蛋白，并与TRI试剂合并（Zymo Research，R2050-1-200）。然后根据Direct-Zol RNA Miniprep Plus套件（R2072）制造商的协议提取RNA。最终的RNA产物在2％琼脂糖1×TAE凝胶上运行，并用Sybr Gold或Bromide染色。将洗脱的蛋白质样品作为对照组收集，以通过SDS -PAGE可视化。 　　使用Illumina Truseq绞合的mRNA（> 100 nt）或小RNA（<100 nt）文库制备套件进行cDNA文库制备。简而言之，使用Illumina制造商的协议进行了从CD-NTase下拉测定法中分离的RNA的逆转录，或者如下：在cDNA第一链Synthesis中用turbo dnase（Thermo Fisher Scientific）处理RNA，并使用随机的hexamers使用随机的近置转录酶进行了cDNA FirstStrand Synthesis。用Q5 DNA聚合酶在15°C下进行2小时进行cDNA的第二链合成，然后在RNase H和DMSO的存在下进行75°C 10分钟。Chemical fragmentation was then performed using the Illumina manufacturer’s protocol, or alternatively as follows: cDNA was sheared to 150-bp fragments using an S220 Covaris Focused-Ultrasonicator (peak incident power: 175 W, duty factor: 10%, cycles per burst: 200, treatment time: 430 s, temperature 4 °C) in S-Series Holder microTUBEs (PN 500114).分别通过Qubit 4.0荧光计和Agilent Bioanalyzer/Tapestation进行cDNA文库的定量和质量检查。将12 pm的索引cDNA文库加载在单读（150个循环）或配对末端测序（2×75循环）的Illumina Miseq仪器上。Bowtie2通过Galaxy开源界面43用于将测序读取与噬菌体和宿主基因组相结合，然后使用Geneious Prime可视化。使用自定义的Python脚本将输出SAM对齐转换为CSV文件，该文件包含沿给定参考基因组在每个核苷酸位置处的对齐读数的数量。 　　使用Viennarna 2.0 package31分析RNA二级结构，并通过Snapgene界面进行可视化。 　　根据Thermo Scientific Transcriptaid T7高产量转录套件协议（K0441）进行IVT。使用OCR190/193（sense cabrna），OCR191/192（反义CabRNA）和ODVB691/OCR193（TERSS74F Phage Escaper RNA），使用OCR190/193（sense cabrna），OCR190/193（sense cabrna）（sense cabrna）（sense cabrna）（sense cabrna）（tense cabrna）（sense cabrna）（tess cabrna）（terss74f Phage Escaper RNA），对CABRNA的线性dsDNA和TERSS74F PHAGE ESCAPER RNA序列进行了PCR扩增。将目标序列放置在T7启动子的下游，该启动子被倒置用于反义转录反应。对于高产量的体外转录反应，将1μgPCR产物与转录辅助酶混合和NTP结合使用。在37°C的4 h孵育期之后，根据Direct-Zol RNA Miniprep Plus套件（R2072）制造商的协议纯化了笔录。为了刺激结构化RNA产物的重新折叠和形成，将纯化的IVT样品在95°C的热块中加热5分钟，在热块中缓慢冷却至室温在1小时内。在指示的情况下，IVT产物进行热处理（折叠）或未处理。 　　如前所述，对体外蛋白核酸络合物的形成进行了分析。将1μm的Cabrna或Escaper RNA与SSC-CDNE03孵育，浓度为0、1或10μm。在反应缓冲液中进行复合形成：50 mM Capso pH 9.4，50 mm KCl，5 mm乙酸镁，1 mm DTT。将反应（20μL）在4°C下孵育25分钟，然后使用1×TB缓冲液作为运行缓冲液在2％琼脂糖凝胶上分离。用溴化乙锭染色琼脂糖凝胶，并使用Amersham ImageQuant 800（Cytiva）对复合形成进行可视化。通过将移位带的平均强度分配到移位和解开带的平均强度之和，计算每个样品中绑定的RNA的比例。使用斐济（测量工具）产生信号的平均强度。 　　将单独携带SSC-CDNE03或完整的SSC-CBASS操纵子植入的金黄色葡萄球菌RN4220的隔夜培养在BHI中稀释1：100，在BHI中补充了5 mM CaCl2、10μM丙丙丙肽（PI）的10μM丙丙（PI），以及适当的抗生素，用于选择的抗生素，以37°C左右（shaking and Shaking the Shaking the Shaking to Shaking to Shaking tosy）（OS）（OS 7 0. 90级）（〜90）（〜90 cial）（〜90 cial）（〜90 counce）（〜90 counce）（〜90 cia）〜90分。然后在MOI 10中用噬菌体感染细胞，并在收集之前再在37°C下再生长10分钟（4,000 rpm，5分钟），并在200μl1×PBS中重悬于2×108个细胞中。在碘化丙丙基丙烯酸丙二醇荧光中与DNA或RNA结合后，增强了20至30倍的兴奋性max = 540 nm/发射max = 617 nm，这一过程需要破坏细菌膜。因此，通过将细胞添加到96孔板中，并使用多孔荧光扫描仪在615 nm的每个井中报告了SSC-CAP15的CGAMP诱导的SSC-CAP15膜破坏。用六个独立的克隆（生物学重复）进行实验，每个克隆都有三个技术重复。 　　SSC-CDNE03序列的氨基酸序列用于播种NCBI非冗余蛋白和保守域数据库（基于组成的调整，E-Value阈值0.01）的NCBI非冗余蛋白和保守域数据库的搜索。从此搜索中鉴定出的推定结构域包括2'，5'-寡核苷酸（2-5 A）合成酶（NT_2-5OAS）域的C末端核苷酸转移酶（NT）结构域（残基61-204; e-value 2.63×10-15）和n-term term nucderantrain nucletirticyyyltratiryyyyyltrantiryyyyyyltrantiryyyyyy（nt_2-5OAS）域（NT_2-5OAS）域（残基61-204；酶）结构域（残基5-158; e-e-value 8.01×10-4）。使用AlphaFold（ColabFold）预测了SSC-CDNE03的结构。按照结构确定，使用DALI进行了等级1模型与完整PDB数据库的成对结构比较。ConsURF数据库用于可视化SSC-CDNE03的保守结构特征。使用Pymol进行了用Apo-OAS1（PDB：4RWQ）和OAS1：DSRNA（PDB：4RWO）的结构比对和表面静电的产生。 　　将野生型φ80α-vir传递在金黄色葡萄球菌RN4220的液体培养物上，该液体含有质粒（PDVB434）（PDVB434），编码GFP基因的GFP基因，该基因侧翼是500-核苷酸上游的500-核苷酸和下游同源性臂，分别与φ80αGP18和GP19相应。为了隔离单独的斑块，在BHI软琼脂中含有II-A型SAU CRISPR – CAS靶向质粒（PDVB435）的RN4220的草坪上的裂解培养上清液，以反选择野生型噬菌体和of of of fillype phage phage phage phage phage phage phage phage phage phage phage：gfp。通过PCR扩增GP18和GP19基因，并通过Sanger测序确认GFP插入。 　　使用Cellasic Onix2微流体系统将带有SSC-CBASS或缺乏CAP15的金黄色葡萄球菌细胞加载到微流体室上。细胞被困在腔室中后，在恒定流量下为5μlH -1的恒定流量提供了5 mM CaCL2和10μM碘化丙二酰基的BHI培养基。1小时后，在切换回生长培养基之前，将GFP标记的φ80α-VIR流过1小时。使用配备有Hamamatsu Orca-Fusion SCMOS摄像机和温度控制的外壳设置为37°C的尼康TI2E倒置显微镜以1,000×放大倍率捕获相对造影剂图像。使用GFP过滤器集和碘化丙啶染色的DSRED滤镜组对GFP进行成像，均使用Excelitas Xylis LED照明器设置为2％功率，曝光时间为300毫秒。使用NIS Elements软件对齐并处理图像。对图像的进一步下游分析是用斐济v.2.3.0进行的。 　　将金黄色葡萄球菌RN4220的隔夜培养物稀释1：100，并在37°C下摇动1小时，并用φ80α-VIR感染20分钟，然后用1％EMS处理化学诱变者。允许培养物裂解3小时，然后再覆盖碎片并过滤上清液以获得经过EMS处理的突变噬菌体文库。一百微米的RN4220隔夜培养物在BHI软琼脂中被高贴突变的噬菌体图书馆感染，然后被镀板。在37°C孵育过夜后，从顶部琼脂中挑选单个噬菌体斑块，并重悬于50μl的BHI液体培养基中。噬菌体裂解物在带有SSC-CBASS的RN4220的两轮传中进一步纯化。 　　使用先前描述的方法41提取了高尊敬噬菌体的基因组DNA。使用S220 Covaris聚焦 - 脱心剂（峰值入射功率：140 W，占空比：10％，每次爆发的周期：200，治疗时间：80 s，温度4°C）在S系列持有器中（PN 500114）中，将DNA剪切至300 bp片段（峰值入射功率：140 W，占名为140 W，占空比：80 s，温度4°C）。使用Illumina Nextera XT DNA库制备套件协议（FC-131-1096）进行库制备。图书馆的12 pm被加载在Illumina Miseq仪器上，用于配对末端测序（2×150个周期）。Bowtie2通过Galaxy开源界面43用于将测序读数与噬菌体和宿主基因组相结合。使用自定义Python脚本将输出SAM对齐转换为CSV文件。 　　野生型φnm1γ6被转移在金黄色葡萄球菌RN4220上，带有ssc-cbass和pters或pterss74f，以实现重组。在BHI软琼脂中，发现了感染的培养上清液在RN4220的草坪上，以分离单个Escaper斑块。通过PCR扩增TERS基因，并通过Sanger测序确认S74F突变。 　　野生型φ80α-vir被传递在金黄色葡萄球菌RN4220的液体培养物上，该液体含有质粒（PDVB442，PDVB443或PDVB460），该质粒编码了一个突变的Cabrna序列，该突变体Cabrna序列在每个Codon和Fancs Hompant and Fancer and flank and flank and flank and flank and flank and flank and flank and fance and the of temble cabrna序列。为了隔离单个斑块，在BHI软琼脂中含有II-A Sau Crispr – Cas靶向II-A SAU CRISPR – CAS的草坪上的裂解培养上清液（PDVB444），用于反选择，以抵抗野生型噬菌体和富含生物的突变体的野生型噬菌体。通过PCR扩增TER和TERL基因，并通过Sanger测序确认重组的噬菌体突变体。 　　根据Direct-Zol RNA Miniprep Plus套件（R2072）制造商的方案，从Aureus RN4220细胞中提取RNA。将RNA样品在相等的样品缓冲液中稀释（90 mM Tris-borate，2 mM EDTA，pH 8.3，8 m尿素，10％蔗糖，0.05％溴苯酚蓝色和0.05％的二甲醇），并通过在65°C下加热15分钟，随后在冰上冷却。通过12％聚丙烯酰胺-8 M尿素分离变性样品，在0.5×TBE缓冲液（45 mM Tris，45 mm硼酸盐和1 mM EDTA，pH 8.0）中，在250 V下于250 V处于250 V的凝胶电泳。对于印迹，将分离的RNA转移到Brightstar-Plus带正电荷的尼龙膜（Thermofisher，AM10100）上，通过在300 mA的分子级水中进行半层电印迹，持续60分钟。EDC交联后，将膜在6×SSC中被阻塞，在65°C烤箱中封闭7％SDS。然后将膜在42°C下与PCR生成的双链DNA探针在标记为荧光素标记的CabRNA的情况下孵育过夜。在3×SSC中用0.1％SDS洗涤3次，在42°C下进行10分钟，使用台风三人成像器系统对印迹进行成像，以检测荧光素信号。 　　S. schleiferi的CD-NTase与Whiteley等人8所描述的CDNE亚型03（CDNE03）最相似。使用TCOFFEE多个序列比对工具（默认参数）对齐所有CD-NTase酶，并用于使用邻居织式方法和Jukes-cantor遗传距离模型构建具有遗传素的系统发育树。 　　所有统计分析均使用GraphPad Prism v9.5.1进行。图图中定义了每个实验的误差线和重复数量。通过未配对的参数t检验分析了病毒滴度，基因表达，形成菌落单元和信号强度的组之间的比较，两尾没有校正。使用Fiji v2.3对磷光筛网图像的信号强度进行比较。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。