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未对预先确定组的大小进行样本量计算,并且在随机评估和结果评估过程中没有盲目。
为了分析MD Anderson癌症中心双子座数据库中NSCLC患者中不同EGFR突变的数量和频率,该数据库是针对EGFR突变(n = 1,054)的患者进行查询的,并作为经典或非典型EGFR突变进行了手动策划。MD Anderson癌症中心双子座数据库是从同意的患者手中收集的,并根据MD Anderson机构审查委员会的协议编号PA13-0589收集。
如先前所述的18,37,通过CLIA认证的方法从福尔马林固定的石蜡包裹的肿瘤或数字滴虫PCR中确定EGFR突变。简而言之,通过分子病理学收集了MD Anderson癌症中心的样品,并通过肿瘤组织DNA的下一代测序面板(MD Anderson Anderson Cancer Center Center Molecular Diagnostics实验室)确定突变。MD Anderson分子诊断实验室是一种基于NGS分析的组织分子分析方法,用于检测50个基因的热点区域中的突变,并在2016年4月扩展以分析134个独特基因,用于检测128个基因和选定拷贝数变化(ampliations)的编码序列中的体细胞突变(ampliations)。Moffitt癌症中心使用诊断方法,例如单簧管(EGFR的外显子的双向测序),EGFR基因的焦磷酸测序(Exons 18-21)和Moffitt Illumina Trusight肿瘤26(TST26)。Moffitt Trusight是一个NGS Illumina测序平台,其面板为170个基因。如下所述,MD Anderson和Moffitt癌症中心使用了包括FoundationOne和Guardant360在内的商业NGS平台。
为了鉴定基金会医学数据库中EGFR突变的患者,使用福尔马林固定的石蜡膜或等离子体使用先前验证的38,39的患者在先前接受了基于混合捕获的全面基因组分析的患者样品,对EGFR突变进行了分析(n = 10,10,2221)。通过EGFR突变对患者进行分层,EGFR突变被手动策划为非典型或经典的EGFR突变。经典的EGFR突变定义为L858R点突变,T790M突变和各种外显子19缺失,包括外显子19中的任何缺失,始于氨基酸E746或L747,并以氨基酸A755结束。还允许包括插入在内的删除,但仍被视为经典外显子19删除。非典型EGFR突变被定义为未定义为经典突变的非同义突变。分析中排除了该突变序列未知的EGFR突变的患者。
为了确定MD Anderson Gemini数据库,CBIOPORTAL,FOUCHS MENIFUCAL和GUARDANT HEALTH数据库中报告的单个EGFR变体的频率,分别分析了每个数据库,并确定了所有数据库的平均值。为了确定MD Anderson Gemini和Foundation Medicine数据库中非典型突变的频率,如上所述确定了非典型突变,并列出了所有患者中已知的EGFR突变的总数。为了分析CBIOPORTAL,选择并输出所有非重叠研究。对于重叠的研究,仅使用了最大的数据集,并且所有已知的EGFR突变被制表。为了确定Guardant Health的EGFR变体的频率,Guardant Health(测序的循环自由DNA(CFDNA)数据库),搜索了Guardant360临床数据库,以查找2016年11月至2019年11月在2019年11月至11月的NSCLC样品中搜索EGFR突变(n = 5,026名患者)。Guardant360是CLIA认证的CAP/NYSDOH认可的综合CFDNA NGS测试,该测试报告了SNV,Indels,Fusions和SNV,最多73个基因。北美NSCLC患者富含Guardant360临床数据库和这里报告的四个数据集;非典型EGFR突变的频率在亚洲或其他地区可能有所不同。
为了确定EGFR TKI治疗后的TTF,在MD Anderson Gemini和Moffitt Cancer Center数据库中鉴定了NSCLC患者(EXONS 18-22)中具有EGFR突变的NSCLC患者(外显子18-22)。根据《协议》(MCC 19161)进行了莫菲特癌症中心(MCC)患者的数据收集,该方案根据赫尔辛基宣言和《 21世纪治疗法》正式审查并批准了MCC。仅记录了首先EGFR TKI患者的结果。通过经典(如上所述的L858R或EX19DEL)或非典型(非古典)对患者进行分层。在MD Anderson Gemini数据库中发现了333例NSCLC患者,他们的肿瘤表达了非典型突变。在这些患者中,有88例患者至少接受了一条EGFR TKI治疗。此外,在莫菲特癌症中心,还有21例NSCLC患者,肿瘤具有非典型EGFR突变。从各个数据库中提取临床参数。包括先前接受化学疗法的患者,并计算了第一个EGFR TKI收到的TTF。如前所述确定TTF,并定义为从EGFR TKI开始到放射学进展,中断或死亡的时间,并且不是基于RECIST标准。对于接受超出进展的患者,放射学进展被记录为终点,数据截止时间为2021年5月。使用Kaplan-Meier方法计算了中位TTF。使用GraphPad Prism软件和双面壁架-Cox对数秩检验确定HR和P值。
对于总体生存期(OS)和无进展间隔(PFI),对CBIOPORTAL的患者进行分析,如先前所述的19,用于接受任何生存信息和合格EGFR突变的患者。通过选择NSCLC的所有非重叠研究,可以从CBIOPORTAL策划此信息。为了重叠研究,选择了最大的数据库。PFI和OS分析仅限于酪氨酸激酶结构域。使用Kaplan -Meier方法计算中位OS和中位PFI。使用GraphPad Prism软件和双面壁架-Cox对数秩检验确定HR和P值。
BA/F3细胞作为G. Mills(MD Anderson癌症中心)的礼物获得,并在含有10%FBS,1%青霉素 - 链霉菌素和10 ng ML-1重组MIL-3(R&D生物系统)的RPMI(Sigma)中。为了建立稳定的BA/F3细胞系,用含有突变EGFR质粒的逆转录病毒转导BA/F3细胞12-24小时。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)对凤凰293t-ampho细胞(Orbigen)的转染产生逆转录病毒,并在补充表7中列出了基于PBABE-PURO的载体。载体列出的载体是由GenScript或Bioinnovates生成的,是由GenScript或Bioinnovates生成的,是使用Genscript或Bioinnovites产生的。将2 µg mL -1紫霉素(Invitrogen)添加到完整的RPMI中的BA/F3细胞系中。为了选择EGFR阳性细胞系,将细胞用PE-EGFR(Biolegend)染色,并通过荧光激活的细胞分选进行分类。分类后,将EGFR阳性细胞保持在含有10%FBS,1%青霉素 - 链霉素霉素和1 ng ML-1 EGF的RPMI中,以支持细胞活力。如前所述22,36进行药物筛查。不久,将细胞铺在384孔板(Greiner Bio-One)中,每井的技术三份细胞以2,000–3,000个细胞三份铺板。添加了七个不同浓度的TKI或DMSO车辆,以达到每孔40 µL的最终体积。在72小时后,将11 µL的细胞滴度Glo(Promega)添加到每个孔中。将板至少孵育10分钟,并使用Fluostar Optima读取器(BMG LabTech)确定生物发光。将原始生物发光值标准化为DMSO对照处理的细胞,并将值绘制在GraphPad Prism中。非线性回归用于与可变斜率的归一化数据拟合 通过GraphPad Prism通过50%抑制作用的浓度插值来确定IC50值。在每个板上一式三份进行药物筛选,并重复或一式三份生物学重复。通过将突变细胞系的IC50值除以在每种药物中补充了10 ng ML -1 EGF的BA/F3细胞的平均IC50值,从而计算了每种药物的突变体比率。如图传说中所述,组之间的统计差异通过单向方差分析确定。
与AMP-PNP(2ITX)和Osimertinib(4ZAU)和EGFR L858R突变体复合物中的野生型EGFR的X射线结构与AMP-PNP(蛋白质数据库(PDB)ID:2ITV)中的EGFR L858R突变体从蛋白质数据库中转回。分子工作环境(2019.01;化学计算组CCCG)用于生成突变的同源性模型,构建蛋白质 - 配体模型和可视化。PyMol用于可视化WT EGFR(PDB ID:2ITX)上的突变位置,以及与EGFR D770INSNPG(PDB ID:4LRM)或EGFR G719S(PDB ID:PDB ID:2ITN)的结构对齐。
通过使用R和ComplexHeatMap Package 40 2.6.2(R统计计算基础)绘制每个细胞系和每种药物的中值(MUT/WT)值来生成热图和层次聚类。分层聚类由MUT/WT比之间的欧几里得距离确定。对于共发生的突变,任意分配突变顺序,对于获得的突变,在临床上观察到在顺序突变中分配了突变。根据突变对受体构象的预测影响分配结构 - 功能组。
基于预测的药物敏感性,使用突变映射将EGFR突变分为不同的组。具有已知药物敏感性的EGFR突变的结构特征(即经典的EGFR突变41,42,T790M43,44,45和外显子20插入22,25)被用作预测突变对药物敏感性的影响。使用突变映射有四个不同的组:(1)对药物结合口袋没有明显影响(类似于L858R);(2)疏水核中的突变(类似于T790m);(3)αC-螺旋和P环的大量向内移动(类似于外显子20插入);(4)由于直接改变αC-螺旋和/或P-loop的直接变化,αC-螺旋和/或P环的略微向内移动或间接地通过ß-折叠板的变化来预测,这些片段可预测,这些片段可以影响αC-螺旋体和/或P-loop。通过表达各种EGFR突变的BA/F3细胞的体外敏感性的分层聚类来验证组。基于细胞系敏感性数据定义了诸如T790M样-3S/T790M样-3R和Ex20INS-NL/EX20INS-FL之类的亚组。
使用Spearman的RHO确定突变的相关性,通过将每个突变和药物的中值对数(MUT/WT)值与基于结构 - 功能基于外显子的基于外显子的平均值(MUT/WT)值的平均值相关联。对于每个相关性,从平均结构函数和基于外显子的组中删除了测试的突变。双面学生的t检验比较了平均RHO值。为了确定结构函数组或外显子组是否更好地预测药物敏感性的指标,我们使用结构函数组为每个药物进行了递归分区分析,并在外显子18、19、20和21上作为预测指标构建了一个决策树。决策树通过根据预测变量提出一系列决策规则来对样本进行分类。每个决策规则都受到内部节点的约束,每个内部节点都指向导致“是”或“否”分支的是或不提出问题。我们使用RPART R软件包应用了购物车算法20,21。我们将可变的重要性计算为每次分割的分裂度量良好之和。将它们缩放为一棵树的100。中位数SAS版本9.4和R版本3.5.6用于执行所有分析的计算。在所有18种药物敏感性的回归树中,结构函数组变量参与了第一和第二分裂。该变量的可变重要性在66-94%的范围内。拆分的顺序和可变的重要性都表明,在评估药物敏感性时,结构函数组变量比基于外显子的变量更具预测性。可以在https://github.com/md-anderson-bioinformatics/egfr-sonstructure-function-nature-manuscript上找到此分析的代码。
作为MD Anderson癌症中心肺癌月球射击计划的一部分,拥有EGFR G719A和EGFR L858R/E709K的PDX是根据良好的动物实践生成和维护的,并在MD Anderson Cancer Center Center Center Instititution Architalal Andifital Care Care and Papo norke Number PAPA140276的批准下进行了批准。将手术样品用无血清的RPMI冲洗,并补充了1%青霉素 - 链霉素,然后在切除后2小时内植入5至6周龄的NSG雌性小鼠的右侧。如所述,通过DNA指纹识别和定量PCR验证了肿瘤的EGFR突变。拥有EGFR S768DUPSVD的PDXS购自Jackson Laboratories(J100672)。为了传播肿瘤,从Jackson Laboratories(005557)购买了5至6周大的雌性NSG小鼠(nod.cg-prkdcscscid IL2RGTMWJL/szj)。表达EGFR S768DUPSVD,G719A或L858R/E709K的NSCLC肿瘤的片段植入了6至8周大的雌性NSG小鼠中。一旦肿瘤达到2,000 mm3,它们就会被收集并重新植入6至8周大的雌性NSG小鼠的右侧。每周测量3次肿瘤,并随机分为治疗组,当肿瘤的体积达到EGFR G719A和S768DUPSVD模型的275–325 mm3,而L858R/E709K模型的肿瘤肿瘤和S768DUPSVD模型和150-175 mm3。治疗组包括媒介物对照(DH2O中的0.5%甲基纤维素,0.05%Tween-80),100 mg kg-1 erlotinib,20 mg kg-1 afatinib,2.5 mg kg-1 poziotinib,5 mg kg-kg-kg-kg-1 osimertinib,25 mg kg kg-kg-kg-kg-1 osimertinib。在治疗过程中,每周三次测量体重和肿瘤量,每周五天(星期一至星期五)接受治疗。如果小鼠体重降低超过10%或体重下降到20 g,则给出剂量假期。经批准的IACUC方案最大允许的肿瘤负担为2,000 mm3的体积。如果肿瘤大小超过最大尺寸,则将小鼠安乐死。
根据双子座协议(PA13-0589)的同意,该患者已根据MD Anderson机构审查委员会或MCC 19161方案进行批准,该协议是由Moffitt Cancer Center正式审查并批准并根据赫尔斯基(Helsinki)和21 Cention Century Contose Pretose Prection Case for Attise Corese for for ant Case for患者进行了对患者的疾病研究和对患者的反应疗法的批准。这两种方案都包括知情同意,以发布去识别数据。
在不常见的EGFR数据库(www.uncommonegfrmutations.com)中,对803名患者列出了对Afatinib的反应和Afatinib治疗的持续时间。529名患者报告了客观缓解率。通过基于结构 - 功能的组或基于外显子的组对患者进行分层,并通过计算报告具有完全反应或部分反应的患者数量来确定ORR。Fisher的精确测试用于确定亚组(基于结构或基于外显子)之间的统计差异。746例患者在不常见的EGFR数据库中提供了治疗持续时间。通过基于结构 - 功能的组和基于外显子的组对患者进行分层,并使用Kaplan-Meier方法计算中位点。使用GraphPad Prism软件和Mantel-Cox日志级方法生成Kaplan-Meier图,HR和P值的统计差异。当未明确说明突变(即外显子19突变)时,这些患者被排除在基于结构 - 功能的分析之外,但包括在基于外显子的分析中。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。
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文章不错《基于结构的分类可以预测EGFR突变NSCLC中的药物反应》内容很有帮助