用NINJ1抗体抑制膜破裂限制组织损伤

　　所有动物程序均根据Genentech机构动物护理和使用委员会的批准，以评估和认证实验室动物护理协会（AAAALAC）认可的设施，根据实验室动物的护理和使用指南以及适用的法律和法规。所有与肝缺血 - 再灌注损伤有关的动物程序均根据病人医院的动物护理委员会批准，并根据加拿大动物护理理事会的动物护理法规和政策进行。先前描述了具有C57BL/6N背景的NINJ1 - / - 小鼠1。野生型小鼠（具有两种野生型ninj1，ninj1+/+的等位基因）是同窝窝。用ozgene从C57BL/6 ES细胞中产生了带有外显子3的NINJ1FL/FL。用PCR引物（5'-Tagttagttcaagccagag，5'-GCGGTCAGCAGCAGAATAGA和5'-CCAAGGAAGCAGGGTAC）进行基因分型，得出396-BP野生型，448-BP Floxed和359-BP敲除DNA Fragments。用rosa26creert2/+ c57bl/6小鼠饲养nINJ1FL/FL小鼠33。 　　对于体内研究（如下所述），使用NINJ1FL/FL小鼠，而不是Ninj1 - / - 小鼠，以避免在很大一部分ninj1 - / - newborns5中观察到的发育型脑积水。NINJ1FL/FL ROSA26CREERT2/+和NINJ1+/+ ROSA26CREERT2/+兄弟姐妹每天通过腹膜内注射80 mg kg -1的他莫昔福丁在阳光透过50 mg -kg -1的体重中，在50 mg -kg -1的体重中，在阳光透发油中（Millipore Sigma）连续5天。最终剂量的他莫昔芬后两周进行实验和分析。 　　小鼠被安置在14 h：10 h的动物室内的单独通风笼中，光线：黑暗循环，随意进入食物和水。动物室的温度和湿度在20–26°C和30–70％的湿度之间控制，每小时10至15室空气交换。 　　EXPI293F细胞（Thermo Fisher Scientific）与PRK-FLAG-MNINJ1（GenEntech）和编码HIV-1-毛素白血病病毒GAG34的哺乳动物表达载体共转染。细胞外囊泡在转染后7天从上清液中纯化，使用超速离心35。 　　对于重组NINJ1的产生，将EXPI293F悬浮细胞培养在Expi293表达培养基（Thermo Fisher Scientific）中，并使用Expifectamine 293转染试剂盒（Thermo Fisher Scientific）使用PRK-FLAG-MNINJ1转染。将冷冻细胞颗粒（50 g）解冻，并用含有20 mM HEPES pH 7.5，1 mM EDTA的低渗性缓冲液洗涤，并补充了亮肽蛋白，苯甲酰胺和蛋白酶抑制剂片剂（Roche）。将细胞用50 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl，1％（w/v）Lauryl麦芽糖新烯基甘油醇（LMNG，Anatrace），0.1％（w/v）胆固醇半甲酸酯（CHS，Anatrace）补充，用于leupeptine andease 5 roupeptine（benzamideption），benzamideceine in Zamideceine andsamidepeine（anatrace）在温和的搅动下4°C。在185,000g的超速离心持续1小时后，将上清液用抗FLAG M2亲和力树脂（Sigma）在4°C轻轻旋转1小时。将未结合的蛋白用10列的洗涤缓冲液A（50 mM HEPES pH 7.5，300 mm NaCl，0.1％（w/v）LMNG，0.01％（w/v）CHS）洗净，然后使用10列的10列洗涤液量（50 mm Hepes ph 7.5，150 mm ph 7.5，150 mm nacl，0.000 lm，0.000 lm，0.000 lm，/v）（0.000 lm，/v）（w），w/v）（w），w/000 lm，w/000（w），w WARPER B，w.00 000（w）w.00 000（w）w。（w/v）CHS）。重组忍者用5列体积的洗涤缓冲液B洗脱，并补充了300μgml -1 Flag肽（Millipore Sigma）。将洗脱液集中在50 kDa MWCO浓度器中，并加载到超级糖6增加10/300 GL柱（GE Healthcare）中，用20 mM HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，0.005％（w/v）LMNG，0.0005％（w/v）CHS。将重组的NINJ1与闪电链接Alexa Fluor 647套件（Novus Biologicals）连接至Alexa Fluor 647。 　　Ninj1−/− mice were immunized biweekly with mouse NINJ1-expressing extracellular vesicles plus Ribi adjuvant (Millipore Sigma) and mouse plasmids encoding mouse NINJ1 (in pCAGGS vector, Genentech), Flt3L (in pORF vector, Genentech) and mouse GM-CSF (in pORF vector, Genentech).通过流式细胞仪测试了来自免疫小鼠的血清，以表明对小鼠忍者BALB/3T3细胞的反应性（克隆A31，ATCC CCL-163）。B cells from the lymph nodes and spleens of immunized mice were enriched using a cocktail of depletion antibodies (biotinylated CD11b at 1:400, CD11c at 1:400, Ly6G/C at 1:400, CD49b at 1:400, TER119 at 1:100, CD4 at 1:200, CD8b.2 at 1:200, CD11b at 1:400 fromBD Biosciences）和磁性链霉亲和素珠（Miltenyi Biotec）。用PE-CY7偶联的大鼠抗小鼠IgM（BD Pharmingen，1：50-100），大鼠抗小鼠B220 Efluor 450（Thermo Fisher Scientific，1：50）和AF647标记的小鼠NINJ1染色。将大约15,000个结合NINJ1结合的IgM – B220+ B细胞分为单个细胞中的96孔板，其中含有补充的RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific）和EL-4-B5馈线细胞（Roche）。在培养8到10天后，使用IgG ELISA（Rockland）和针对表达NINJ1表达的3T3细胞的流式细胞仪筛选上清液中的忍者IgG小鼠反应IgG。产生NINJ1反应性IgG的B细胞是使用公开的方法36生成217种重组单克隆抗体的起点36。简而言之，使用Magmax-96总RNA隔离试剂盒（Thermo Fisher Scientific）从B细胞中提取RNA。可变光（VL）和可变重（VH）结构域使用正向条形码底漆集从cDNA中降低PCR，以识别最著名的小鼠可变基因的领导者序列，即 并识别恒定域37的条形码反向引物。将单个纯化的VL和VH PCR产物合并，以使用Ovation库系统进行低复杂性样本试剂盒（Nugen）进行下一代测序库制备。使用Miseq Sequencer（Illumina）进行2×300 bp配对的测序。合成VH和VL序列（genscript），并将其克隆到编码小鼠γ2A和K常数域的PRK哺乳动物表达矢量中，38。重组抗体在CHO细胞中瞬时表达，并在蛋白A柱上纯化。简而言之，将CHO细胞（GenEntech）以0.4-0.8×106个细胞接种。三，四天后，根据制造商的说明，使用PEIPRO（Polyplus）将细胞用质粒转染。转染后14天收集培养上清液。通过在BMDMS中的LDH释放测定法筛选重组抗体的NINJ1抑制活性。在纽格霉素刺激之前，将抗体（1 µg mL-1）添加到PAM3CSK4培养的BMDM中15分钟。刺激后16小时，收集上清液以进行LDH释放测定。 　　Ultra-pure LPS (Escherichia coli O111:B4, InvivoGen), Pam3CSK4 (InvivoGen), nigericin (InvivoGen), ultra-pure flagellin (from Pseudomonas aeruginosa, InvivoGen), venetoclax (TOCRIS), doxorubicin (Enzo Life Sciences), mouse TNF (Genentech), actinomycin D（EMD Millipore），Z-VAD-FMK（Zvad; Promega）。用于蛋白质印迹的抗体是兔抗小鼠NINJ1克隆25（NINJ1-25，Genentech，0.2 µg ml-1）1，β-肌动蛋白HRP（AC-15，Novus Biologys，0.1 µg ML-1），HRP – Anti-Rabbit F（Ab'）Imm fragment（Ab'）2 fragment（Jackson）HRP – Anti-Rabbit FC片段（Jackson Immunoresearch，1：5,000）。补充表1中提供了本手稿中使用的所有抗体的列表。编码N末端标记标记的NINJ1（全长，Delta 2-73，Delta 142-152和Mutta d147vapr→A147AAAAA）的cDNA被逼入PCDNA3.1 ZEO（+）。 　　通过短tandom重复分析（STR）分析和常规的单核苷酸多态性（SNP）指纹来验证细胞系。使用Promega PowerPlex 16系统确定每条线的Str轮廓。这是一次并将其与细胞系的外部StR分布（如果可用的话）进行比较，以确定细胞系祖先。每次扩展新股票以进行冷冻保存时，都会执行SNP配置文件。通过使用流体多重测定法进行高通量SNP分析来验证细胞系的身份。根据次要等位基因频率和商业基因分型平台上的存在选择SNP。将SNP配置文件与可用内部和外部数据的SNP调用（如果可用时）进行比较，以确定或确认祖先。使用两种方法，在细胞冷冻保存之前和之后对所有细胞进行了分枝杆菌的测试，以避免假阳性或阴性结果：Lonza mycoalert和Stratagene mycossensor。还监测细胞生长速率和形态的任何批次变化。 　　在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中，将小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞，这些培养基（DMEM）补充了10％（v/v）低dendototoxin胎儿牛血清（FBS; Omega Scientific）和20％（v/v）L929 L929构型介质5天。为了刺激，在96孔板中以每孔1.0×105个细胞以1.0×105的细胞进行了过夜。对于炎性体刺激，将细胞用PAM3CSK4（1μgml-1）启动5 h，然后在Opti-Mem I培养基（Thermo Fisher Scientific）中用10μgml-1 nigericin刺激。对于鞭毛蛋白或LPS电穿孔39，使用1,720电压，10宽度，2个脉冲设置，使用100μlR缓冲液中的1.0μgLps或0.2μg鞭毛在100μLR缓冲液中用1.0μgLps或0.2μg鞭毛蛋白在100μlR缓冲液中电穿孔，2脉冲设置。将电穿孔细胞添加到990μLOpti-MEM I培养基中，并培养2小时。用Venetoclax（25μM），阿霉素（10μM），TNF加肌动蛋白D（20 ng ml -1 TNF，500 ng ml -1肌动蛋白d）治疗的BMDMS（10μM），或100 ng plus ZVAD（100 ng ml -1 tnf ways knfore ng ml -1 tnf，20 h）heve对于裂解对照，将细胞用0.25％的Triton-X100在培养基中裂解。如果指示，将BMDMs与指定的抗NINJ1克隆251（小鼠IgG2A； Genentech），抗NINJ1克隆D1（小鼠IgG2A; Genentech），抗ninjurin克隆50（BD Biosciences BD610777，抗体Ninj1）（ISANINJ1）（ISNINJ1）（ISANJ1）（抗ninj1）（抗Ninjurin clone）（抗ninj1）（抗NINJ1），抗Ninj1克隆D1（小鼠IgG2A; Genentech），抗ninj1克隆D1（小鼠IgG2A; genentech），抗ninj1克隆D1（小鼠IgG2A; genentech），科学）。在添加细胞之前，根据制造商的说明，使用slide-a-Lyzer迷你透析设备（Thermo Fisher Scientific）使用slide-A-Lyzer迷你透析装置，将抗氰基蛋白克隆50和同种型对照小鼠IgG2A抗体透析以去除叠氮化钠。所使用的合成肽是小鼠NINJ1氨基酸26–37（Pprwglrnrpin，Genentech）及其序列crambl的类似物（Pwpprrnrngli，genentech）。在添加治疗之前，将BMDM预先治疗抗体或肽10分钟。 　　用细胞毒素96非放射性细胞毒性测定法（Promega）分析了培养基的LDH释放。CellTiter-Glo试剂（ATP分析，Promega）用于检测活细胞。使用Envision Manager 1.14.3049.1193（PerkinElmer），使用Envision 2105多模板收集LDH和CellTiter-GLO分析的数据。 　　使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）将293T细胞（ATCC，CRL-3216）细胞用NINJ1表达质粒转染。用以下单克隆抗体染色细胞：抗Ninj1克隆25 MigG2a（Genentech，10 µg mL-1），抗NINJ1克隆D1 MigG2A（GenEntech，10 µg ml-1）µg mL -1）。初级染色之后是APC偶联的抗小鼠IgG次级（Thermo Fisher Scientific，1：300），然后是碘化丙肽（PI; 2.5 µg ML-1; BD Biosciences）。在Facsymphony（Becton Dickinson）中分析活细胞。数据是使用BD FACSDIVA软件v9.1获取的，并使用FlowJo v10.8.1进行了分析。代表性的FACS门控策略和带有异常值的轮廓图在补充图2中显示。2–4。 　　使用100 µL霓虹灯尖（Thermo Fisher Scientific）加载BMDMS荧光素异硫氰酸酯（DD-150，Millipore Sigma）。将5.0×106 BMDM在120 µL R缓冲液中电穿孔加12 µL 50 mg ML-1 DDD-150。在电镀之前，将BMDMs用高葡萄糖DMEM洗涤。刺激后，以10倍放大量在incucyte S3（Essen Bioscience）中成像。 　　将BMDM铺在玻璃底96微孔光学板上（Thermo Fisher Scientific）。在存在或不存在10 µg ML-1抗NINJ1抗体的情况下，用10μgml-1二甲基蛋白刺激PAM3CSK4蛋白BMDM。使用60倍计划荧光目标对板的ImageXpress微共聚焦系统进行成像，运行MetAxpress v6.5.4.532软件，并配备了环境控制器和气体搅拌机，可将细胞保持在37°C和5％CO2下。每15分钟将光场和发射光的图像成像过夜。使用Scikit-image 0.19.2 Python软件包处理了8小时时间点的代表性图像。 　　克隆D1变量域被克隆到人类Fab表达载体1AP39.HIGG1.D.FAB（Genentech）中。蛋白在大肠杆菌中表达，并以低内毒素水平纯化（<0.07 EU MG -1）。用50μgml-1 D1 Fab培养PAM3CSK4培养的BMDM，然后在玻璃底96 Microwell光学板（Thermo Fisher Scientific）上用Nigericin刺激。用PBS中的4％多聚甲醛固定细胞，然后用0.1％Tween-20透化。在室温下，在补充有0.2％鱼类明胶（Millipore Sigma），3％牛血清白蛋白和0.1％Tween-20的PB中阻塞细胞，然后在室温下1小时，然后用抗小鼠NINJ1克隆80（Rabbit IgG2B）标记为N-末端主管IgG2B，对N-末端主管外域diolain diolain dionentech; genentech; genentech; genent; genent; genent; genent; genent-aT at 2 µg ml cant an 4 µg c。用AF488偶联的抗兔次级（Thermo Fisher Scientific，1：200）在室温下揭示了结合的抗体。使用Leica SP8X共聚焦激光扫描显微镜获取高分辨率图像，运行Leica Las X v3.5.7软件，并配备了白光激光器和HC PL APO CS2油浸入40倍数值孔径的40倍镜头1.3。 　　将编码未标记的人或小鼠NINJ1的cDNA克隆到PCDNA3.1 ZEO（+）中。HEK293T细胞（2.6×104）用50 ng质粒加上0.16μllipofectamine 2000在96孔板中每孔2000孔2000，如果存在20或200μgml-1的同种型对照抗体的抗体，抗Ninj1 clone D1（ninj1 clone d1（genentech）或抗ninj1 clentech 11（ninj1 clentech）（ninj1 clentech）（ninj1 clentech）（ninj1 clentech）（ninj1 fab）（ninj1 clentech）（ninj1 fab）。转染时，将Yoyo-1染料（Thermo Fisher Scientific）以200 nm的最终浓度添加。每小时在绿色通道中扫描incucyte S3图像至少16小时，并以10倍放大倍率。核ID红色DNA染色（Enzo Life Sciences）是在最后一个时间点后添加的，并在红色通道中进行了扫描。Incucyte S3 2019A软件用于确定Yoyo-1+细胞和核ID+细胞的总数（总细胞）。计算Yoyo-1+细胞的百分比为Yoyo-1+细胞的数量除以核ID+细胞的总数。 　　将C端HIS6标签的重链FAB区（VH-CH1）和抗Ninj1克隆D1和克隆25的未标记的轻链克隆到哺乳动物表达矢量PRK5J（GenEntech）中。Expi293F cells were transfected with pRK-Flag-mNINJ1 alone, or co-transfected with pRK-Flag-mNINJ1, pRK5J-His6-VH-CH1 clone D1 (or pRK5J-His6-VH-CH1 clone 25), and pRK5J-light chain clone D1 (or pRK5J-light chain clone 25) in a 2:1:2 plasmid ratio.NINJ1，NINJ1-CLONE D1 FAB复合物或NINJ1-CLONE 25 FAB复合物用抗Flag M2树脂（如上所述）纯化。为了进行比较SEC分析，将类似的蛋白质量和体积的NINJ1，NINJ1 -CLONE D1 FAB COMFFERK或NINJ1 -CLONE 25 FAB复合物注入了超级糖6增加10/300 GL柱（GE Healthcare）。数据是用独角兽7.6（Cytiva）收集的。 　　EM电网（400个网状铜，具有连续碳，电子显微镜科学）在10 mA处发光15 s，使用Gloqube Glow放电系统（Quorum）在施加4μl的样品中，在SEC缓冲液中稀释至约0.1 mg Ml -1（20 mM Hepes pH 7.5，150 mm nacl，0.000 lm，0.00 lm，0.005％）（均为20 mm）（w.5 000 lm，0.005％）（w）（w/v）CHS）。孵育1分钟后，将网格用蒸馏水，去离子水洗涤，并用1％乙酸铀酰染色。完全干燥后，使用Serialem版本3.9.0在配备了4K×4K CETA 16M相机（Thermo Fisher Scientific）的Talos F200C中成像。图像以45,000×的标称放大倍数（每个像素3.2Å）记录。 　　1-甲米酰基-2-烯酰 - 甘油-3-磷酸胆碱（POPC，Avanti Polar脂质）和1-甲米酰基-2-烯酰基-SN--甘油-3-磷酸 - 磷酸 - 丝氨酸（钠盐）（Pops，Avanti Polar脂质）在氯仿中制备。生成了80％POPC和20％POP的脂质混合物，冷冻干燥，并用10 mm Tris pH 8.0，150 mm NaCl的溶液进行水合，其中含有货物，Lance EU-W1024 Biotin（Perkinelmer）。将悬浮液在水浴中进行超声处理，冷冻透视，并使用装有核孔的微型挤出机（Avanti Polar脂质）挤出，并配备有核孔的0.4μm膜（Whatman），以产生大型的Unillamellar囊泡。脂质体通过穿过装有Pierce链霉亲素琼脂糖树脂（Thermo Fisher Scientific）的柱子洗脱纯化。通过添加0.0005％LMNG/0.00005％CHS（Anatrace），脂质体不稳定。通过将不稳定的脂质体（脂质浓度为25μm）与根据上述方案或0.4μm米利替蛋白肽（ANASPEC）纯化的8μMNINJ1与8μMNINJ1稀释来建立货物释放测定。将链霉亲和素 - 埃拉克萨荧光647（Thermo Fisher Scientific）以1μm的最终浓度添加到每个孔中。DDH2O中与0.0005％LMNG混合的脂质体用作对照。将所有样品加载到近距离（Perkinelmer）的井中。使用Envision Manager 1.14.3049.1193（Perkinelmer），将时间分辨的读数记录在Envision 2105多模板读取器（Perkinelmer）上。加载井后立即采集每个板的预读，然后将每个板在室温下孵育过夜。孵育约15小时后，通过在每个孔中添加1％的Chapso（Anatrace），进行了另一份读数，然后全部消化脂质体。记录了最终读取，代表100％的货物释放。结果被转换为每井释放的货物百分比，背景控制减去。 　　在TNF Plus -GAL模型中，通过腹膜内注射700 mg kg -1 -gal（Millipore Sigma）和30μgkg -1小鼠TNF（Genentech），在8至14周的雌性小鼠中诱导肝损伤。6-7小时后收集血清。如果指示，通过腹膜内注射50 mg kg-1小鼠抗Ninj1克隆D1抗体或同型抗体控制抗GP120小鼠IgG2a小鼠IgG2a单克抗体（genentech抗体（genentech）的体重），将8至14周的年龄与C57BL/6J女（Jackson Labs）小鼠相匹配。对于CONA或抗FAS MAB（JO2）治疗，通过静脉注射20 mg kg-1的CONA（Millipore Sigma）或0.5μgG-1抗FAS的体重（抗CD95 Clone JO2，bd clone jo2，bd Bioscience），除非指示，否则，肝损伤是9至11周的男性肝损伤。在CONA 8或18小时后和抗FAS 5小时后收集血清。对于抗体预处理，如上所述，用指定的单克隆抗体处理了9至11周大的C57BL/6N雄性小鼠（Charles River Labs）。血清ALT和AST在血清化学分析仪（Beckman Coulter AU480）中测量。用细胞毒蛋白96非放射性细胞毒性测定法测量血清中的LDH。酶联免疫吸附测定（ELISA）用于测定IL-18（克隆74和克隆93-10C，MBL International）和HMGB1（IBL）。使用Envision Manager 1.14.3049.1193（PerkinElmer）收集LDH分析和IL-18和HMGB1 ELISA数据。 　　根据存在的可行组织的量，对肝细胞退化的肝细胞退化评分为肝细胞变性，基于存在的可行组织的量，对肝细胞变性进行评分：（1）多灶性肝细胞损伤，以保持蓬松的小区域的保留，（2）尿布量的细胞，（2）插入液体的液体，（2）viver ride（2）viver的肝细胞变性。仅保存肝周围肝细胞，或（4）（4）跨叶肝细胞变性，肝细胞的损伤损失。为了在抗体处理的小鼠中评分肝细胞变性，根据以下标准对六个裂片进行评分：（0）无明显的肝细胞变性，（1）多焦细胞死亡，而没有建筑的损失，（2）非桥梁肝细胞的肾小球损失，造成架构，（3）架构，（3）布置架构，（3）或brifentern（3）或brifter nectortion（3）或brifter neprultion（3）或briftor neprultion（3）或briftor neprultion（3）或者（4）弥漫性肝细胞变性。平均六个叶的得分得分为最终得分。为了评估肿胀，退化肝细胞的持续性，根据细胞损失的主要特征（正弦出血或肿胀的肝细胞持续性）对肝脏进行评分。应用了一个三层评分系统：（1）主要的肝细胞损失与正弦骨出血，（2）将肝细胞损失和肺炎与肿胀的区域骨料，脱位的肝细胞肿瘤的骨料混合在一起，或（3）（3）主要保存肿胀的保存。评分是以随机的，盲的方式进行的。 　　用兔子抗裂缝的肝固定切片切片的切片，用兔抗切断的caspase-3抗体（ASP175，细胞信号技术，0.05μgml-1）或兔子抗Ninj1克隆80（5μgml-1）（使用5μgml-1）使用Discovery IHC（ROCH）（ROCH IHC）。条件包括CC1标准抗原检索（Roche），二氨基苯胺的Omnimap检测（Roche）和甲莫久毒素的抗染色。通过Leica Application Fues v4.6.0获取免疫组织化学和组织学图像。Cleaved caspase-3 immunolabelling was scored according to the following matrix: (1) multifocal individual or aggregates of labelled cells, (2) either extensive intermix of labelled and unlabelled cells or centrilobular labelling with variable bridging, (3) extensive bridging cleaved caspase-3 expression with only rims of unlabelled peri-portal hepatocytes,（4）扩散的肝细胞标记。评分是以随机和盲目的方式进行的。NINJ1免疫标记以无盲的方式进行定性评估。 　　6至10周大的C57BL/6J小鼠（Jackson Labs）的混合性群体用于70％的分段缺血 - 再灌注模型40。在异氟烷麻醉下，进行了矢状中线剖腹手术，并放置在门静脉和肝动脉上的夹具，以阻断向左流动的血液，肝脏的内侧裂片。1小时后，将夹具卸下，以允许再灌注，并将动物返回家园。再灌注6小时后，在收集的全身麻醉和组织下，通过心脏穿刺对动物进行安乐死。在暴露血管椎骨但未夹紧血管椎骨的假剖腹手术中被用作阴性对照。如上所述，在指示的情况下，通过腹膜内注射50 mg kg -1抗体的小鼠在诱导前4 h诱导缺血。动物被随机分组​​，分析盲目。如上所述测量血清LDH，ALT，AST水平。对于组织学，收集了所有缺血性和再灌注的肝叶，石蜡包裹，切成薄片，厚度为4 µm，然后用血久蛋白和曙红染色。中性粒细胞与兔抗小鼠LY6G（细胞信号技术，1：100），然后是生物素化抗兔二抗（Vector Laboratories，1：200）和ABC（载体实验室）。DAB（载体实验室）用于检测LY6G染色。在时空的靶向和放大响应（Sttarr）创新中心的扩增和扩增的组织样品加工和染色。使用3Dhistech Pannoramic Flash II幻灯片扫描仪对载玻片进行成像，并使用3Dhistech CaseViewer（RRID：SCR_017654）或Halo Image Analysis平台（RRID：SCR_018350; INDINA LABS）可视化载玻片。为了评估肝样品中的汇合坏死，Densenet分类器监督机器学习算法（Halo Image Anallion平台） 经过训练，可以使用甲莫妥蛋白和曙红染色检测大量肝细胞死亡区域，并应用于整个样品。使用QuPath（RRID：SCR_018257）计数中性粒细胞（LY6G阳性）。使用PRISM 9.5.1（GraphPad软件）计算统计测试。提出的数据代表了至少三个独立实验。分析了所有收集的数据，并且P值<0.05被认为具有统计学意义。 　　将组织在RIPA缓冲液（50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl，2 mM EDTA，1％NP-40、0.5％SDS，1倍完整的蛋白酶抑制剂（Roche Applied Science）和phosstop磷酸酶抑制剂（Millipore Sigma）（在4°C下）。用珠磨机均质器（Omni International）机械地破坏组织，并通过20,000g离心去除不溶性材料，然后再添加Nupage LDS LDS样品缓冲液4X（Thermo Fisher Scientific）。补充图1中提供了无编工凝胶的原始图像。 　　使用locuszoom41和全基因组协会研究（GWAS）数据生成区域地块，该研究使用了英国生物库随机参与者样本（n = 363,228）和35血和尿液生物标志物15,42（https://doii.org/10.10.1038/s411588/s411588/s411588888-020-20-20-20-0077-2）。 　　除非另有说明，否则提出的数据至少代表了两个独立的实验，均值至少为三个生物学重复。每个图面板中给出了统计分析和样品数量（n）。使用GraphPad Prism 9.5.1（GraphPad Software）进行Mann – Whitney U检验，t检验和对数秩检验。 　　没有使用统计方法来预先确定样本量。根据先前的经验选择样本量，并进行试验实验，以检测条件之间统计学上的显着差异。对于涉及他莫昔芬治疗的动物的体内研究，通过基因型而不是治疗确定组，因此不是随机的。对于涉及野生型小鼠的TNF Plus-gal，抗FAS JO2和CONA在体内研究中，动物是年龄和性别匹配的，并随机与组随机分组。在对照组的同一实验中评估了实验组，以消除协变量。用于与肝缺血 - 再灌注损伤有关的动物程序；动物被随机分组​​，分析盲目。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。