通过复制解旋酶解开DNA的结构动力学

　　全长SV40 LTAG（登录号：P03070）N末端6倍组氨酸标签的N-末端，以及TEV裂解位点序列，通过genscript克隆到PfastBac1质粒中。重组表达质粒被引入DH10MultiBac中的多型杆菌病毒DNA中，并分离了bacmid DNA。为了制备杆状病毒，根据制造商的说明，使用Fugene HD（Promega）将LTAG的杆菌DNA转染到SF9细胞中。将所得的上清液用作P1病毒库存并放大以获得P2病毒库存。然后进一步扩增P2病毒量以获得大规模表达的P3病毒库存。LTAG通过在2×106细胞ML -1的密度用LTAG P3病毒的密度下转染4 L的SF9悬浮培养物表达LTAG。通过以5,500g离心10分钟收集细胞，并重悬于裂解缓冲液中（20 mM Tris（pH 8.0），50 mM咪唑，500 mM KCl，1 mM Dithiothreitol（dtt），5％（v/v）甘油和甘油醇和远足的蛋白酶抑制剂cocktail per 50 mL（ROCH）perece per 50米（v/v）。通过在4°C下以95,834g离心1小时，通过离心1小时来阐明细胞裂解物。将上清液直接加载到预校准的5毫升HISTRAP亲和力柱（Cytiva）上，该柱（Cytiva）用缓冲液A（20 mM Tris（pH 8.0），50 mM Imidazole，500 mM Kcl，1 mM DTT和10％甘油）。用含有50 mM咪唑的50 mL缓冲液洗涤加载的色谱柱，然后用50 mL的缓冲液A含有100 mM咪唑，以去除蛋白质与色谱柱的非特异性结合。最后，使用含有低盐的缓冲液B（20 mM Tris（pH 8.0），500 mM咪唑，250 mM KCl，1 mM DTT，10％甘油），将蛋白质用20 mL梯度至500 mM咪唑洗脱。用TEV蛋白酶处理合并的LTAG级分，以去除HIS标签，并在透析缓冲液（20 mM Tris（pH 8.0），100 mM KCl，1 mm DTT和10％甘油中进行透析过夜。然后将切割的蛋白加载到Histrap HP 1-ml亲和柱中（Cytiva） 用缓冲液C（20 mM Tris（pH 8），250 mM KCl，1 mM DTT和10％甘油）预先校准。然后将加载的色谱柱用10 ml的缓冲液D洗涤，然后用10 ml线性梯度的缓冲液B。将包含LTAG的流通级分浓缩并加载到HiloAD 16/600 SuperDex 200 Pg（cytiva）前用凝胶过滤器（20 mM Tris（20 mM Tris（PH 8.0），100 mM KCL，100MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM。甘油）。收集的馏分被闪烁，并存储在-80°C下。 　　The forked DNA substrate for reconstitution with LTag and ATP in the absence of Mg2+ was generated by annealing the 5′-GGTGATCGTTCGCTACATGTCGTCAGGATTCCAGGCAG-3′ and 5′-AGACACATGGATGTAGCGAACGATCACC-3′ oligonucleotides, purchased from Eurofins.在MG2+存在的情况下，在MG2+存在Mg2+的情况下，使用LTAG和ADP，LTAG和ATP重构的分叉DNA底物是从Sengupta和Borowiec30适应的，而无型臂则从Sengupta和Borowiec30进行了调整。因此，组成的寡核苷酸是5'TTTCTGTGACTACCTGG ACGACCGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'和5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCGTCGTCGTCCAGGTAGTCACAGA-3'。退火产品购自Eurogentec。通过退火寡核苷酸5'-agctatgaccatgatcgataCgaattg [23DDDC] -3'和5′-TTTTTCGGAGTCGTTTCGACTCCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCA ATTCGTAATCATGGTCATAGCT-3′.没有游离3'ssDNA尾巴，LTAG与该基材没有结合。 　　Full SV40 origin DNA (top 5′-CACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTA-3′ and bottom 5′-TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTG-3′), EP (top5'-CACTTCTGGATGCCTCAGGCCGAGGCGCG-3'和底部5'-CGCCTCGGCCTCTCTCTCTGCTTATT CCAGAAGTAGTG-3'）和富含AT-5'-GGCCTCGGCGGCGGCGGCGGCGGCTGCAT AAATAAAAAAAAAAAATATTA-3'''5′-TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCC-3′) half-origin DNA substrates were synthesized by GenScript (Piscataway) and each annealed by heating at 95 °C for 2 min followed by gentle cooling at −1 °C min−1 to 25 °C.在室温下用S1核酸酶（Fermentas Life Sciences）进一步处理退火的底物1小时，并使用PCR清洁套件（Macherey-Nagel）纯化。 　　用于LTAG-ATP – DNA，LTAG-ADP – DNA和LTAG-ATP（APO）样品的缓冲液基于Li等人的DNA结合测定法，其中包括1 mm ATP，50 mM Tris-HCl（pH 8.0）和200 mm NACL。用于LTAG-ATP-MG2+–DNA样品的缓冲液基于参考文献的DNA解旋酶测定。12，由50 mM HEPE（pH 7.5），1 mM ATP，3 mM MGCL2、1 mM DTT和50 mm NaCl组成。用于LTAG-AMP-PNP-MG2+-DNA复合物的缓冲液由50 mM Tris-HCl（pH 7.5），1 mM DTT，100 mM NaCl，5 mM MGCL2和3 mM AMP-PMP组成。用于LTAG的缓冲液与全半原子DNA含有50 mM Tris-HCl（pH 8），100 mM NaCl，1 mM DTT，5 mM MGCL2、5 mM KCl和3 mM AMP-PNP。 　　在添加DNA底物之前，将LTAG储备与缓冲液预孵育（以等摩尔比与假定的六聚体的比率）。这些步骤是在4°C温度控制的房间中进行的。应用于网格的样品中的最终蛋白质浓度约为0.098 mg ml -1（相当于0.2 µm六聚体）。R1.2/1.3或R2/2 Ultraufoil Grid（量化微型工具）在Quorum Gloqube Plus单元中用40 mA发光5分钟。施加了氧化石墨烯（默克）涂层53。然后，将3 µL样品在4°C和100％的相对湿度下施加到Vitrobot Mark IV中的网格中，等待时间为30 s，用印迹力4将3 s涂上3 s，并插入液态乙烷中。对于LTAG-AMP-PNP-MG2+–DNA复合物，将2μMLTAG（相对于己酯）混合在相应的缓冲液中，并在4°C下孵育30分钟。此后，加入2μMDNA，并将反应在4°C下再孵育30分钟。然后，将3 µL样品沉积到先前在40 mA处发光的R2/2 AU 300网格网格，持续60 s。将网格在玻璃体上冷冻，3-S墨水斑点时间，0-s等待时间和5个印迹力为5，腔室中的湿度为4°C，湿度为100％。为了重建原点熔化复合物，将LTAG储备与完全原点（2：1摩尔比），EP或一半原点混合在上述缓冲液中，以等效比率为1 µm，并在样品冷冻前在室温下在室温下1小时孵育反应。使用Pelco Easiglow（Ted Pella，Inc。），将量子AU孔网格（R2/2 300网格）在30 mA处发光30 m。然后，将3μl样品应用于发光的网格，并使用0的印迹力且无等待时间将3 s涂抹3 s。然后使用FEI Vitrobot Mark IV IV预设在4°C和100％的湿度中使用FEI Vitrobot Mark IV预设在液态乙烷中易突变。 　　LTAG – ATP，LTAG-ATP – DNA，LTAG – ADP – DNA，LTAG – AMP-PNP-MG2+–DNA和LTAG – DNA和LTAG – ATP-MG2+–DNA数据在使用×105,000 AP AP APERTUR的泰坦KRIOS G3传输电子显微镜（Themo Fisher Sciention）的Titan Krios G3变速器电子显微镜（Themo Fisher Sciention）上收集了×105,000 AP APET的AP APETURE KER 3英国莱斯特结构与化学生物学研究所，在计数超分辨率模式（binning 2）中使用cATAN生化滤波器（20 ev缝宽）（binning 2），并带有EPU 2.12软件（Thermo Fisher Scientific）。在2 s的50个相等分数中以18 e -px -1 s -1的剂量速率获得单个暴露，其校准像素大小为0.835ÅPx -1，累积剂量为50 e -2。名义散焦在0.3 µm步骤中变化-1.0 µm和-2.5 µm。从每个样品中收集的显微照片的总数为：8,072（LTAG – ATP – DNA），9,737（LTAG – ADP – DNA），6,127（LTAG – AMP-PNP-MG2+–DNA）和8,460（LTAG – AMP-PNP-MG2+–DNA）和8,460（LTAG – ATP-MG2+–DNA）。LTAG – AMP-PNP-MG2+–DNA，LTAG – AMP-PNP-MG2+ - EP，LTAG – AMP-PNP-MG2+ - AT和LTAG – AMP-AMP-PNP-MG2+ - FULL-ORIGIN结构收集在Titan Krios G4传播微学生（Heplo Electrosizic（Heptron Electrosization and themo fisherization in nikization in Abultizic Insivels）上，在titan Krios g4 krios corcore and abull corcoriation and abull Inscection和特征cormenciation和表征沙特阿拉伯。使用Falcon 4i直接检测摄像头在Selectris-X末端，具有10 eV缝隙宽度，具有EPU 2.12软件（Thermo Fisher Scientific）的末端，以EER格式的显微照片以×130,000的放大倍率（校准像素大小为0.93ÅPX-1）。LTAG-AMP-PNP-MG2+–DNA的数据以-2.5至-1.5μm的散焦范围收集，累积剂量为38.7 E-2。Data for LTag–AMP-PNP-Mg2+–EP, LTag–AMP-PNP-Mg2+–AT, and LTag–AMP-PNP-Mg2+–full-origin data were collected with a defocus range of −2.6 to −1.1 µm in steps of 0.3 µm, and a total dose of 43 e− Å−2 was applied to the specimen over an exposure time of 5 s. 　　使用剂量加权的MotionCor2（参考文献55）的Relion实施54校正了电影堆栈，并使用CTFFIND 4.1（参考文献56）对集成显微照片进行了剂量传递函数（CTF）估计。在使用Topaz v.0.3.0（参考文献57）选择之前，对显微照片进行了剥落，均使用默认模型。使用384的盒子尺寸提取选拔物，并在Relion 4中使用VDAM进行几次二维分类和选择的迭代（参考文献54）（降低了4×，2×和1×）的binning因子。通常，从上方的粒子子集进口到CryoSparc（结构性生物技术）中，并从斑块运动校正和斑块CTF估计作业中重新提取，并最初通过三个类（允许DNA结合，APO和JUNK类别）进行从头开始重建。如果检测到两个垃圾类，则使用两个类重复该过程。通过局部运动校正，进一步校正所得颗粒的选择，以进行梁诱导的运动。最终的最终重建是使用非均匀的细化得出的，并启用了CTF和每粒子尺度的精炼。在有序蛋白（核心解旋酶）周围和复合物的相关DNA片段周围，用软边（约20像素为归一半的阈值）构造精炼掩模。使用粒子数据集的独立完善的一半计算金标准的傅立叶壳相关分辨率。LTAG – ATP – DNA重建最初使用sideplitter在Relion 4中被完善至2.9Å。二维分类后的最终粒子子集接受了三级三维（VDAM）初始模型作业。这产生了两个垃圾课。非junk类接受两级三维分类。这产生了APO（54％）和DNA结合（44％） 课程。后者是使用CTF改进和贝叶斯抛光的迭代自动修饰的。通过将15-Å低通滤波的重建以排除非核心解旋酶结构域，然后分别用2和10像素填充来创建掩模。精制的粒子堆栈及其分配被进口到冷冻条件中，并使用不均匀的细化进行了重新构成。尽管报道了全球金标准的傅立叶壳相关分辨率，但这提供了更好的正规图。LTAG – ATP-MG2+–DNA共识重建的3DVA Analysis2使用其改进面膜进行了三种模式和5Å的滤波器分辨率（全球金标准的傅立叶壳相关分辨率为3Å），以及高音分辨率为150Å。潜在坐标表现出球形和/或三维高斯分布，这是连续构象变异性的特征。沿每个主组件（0、1、2）对二十卷（frame_000到frame_019）进行采样。通过重复分类而没有分离构象，可以详尽清洁数据。通过沿每个组件采样框架上的粒子嵌入的滚动窗口分区生成验证量，然后使用其金标准共识分配进行加权重建。LTAG -ADP – DNA和LTAG -ATP – DNA的3DVA被类似地进行。LTAG – AMP-PNP-MG2+–DNA结构在亲属4中进行了完整。简而言之，提取了使用黄玉（2,859,203个颗粒）提取的颗粒，其盒子尺寸为256像素和4倍降尺度（3.72ÅPx-1），并通过二维分类进行了大量清洁。将所得颗粒（957,358个颗粒）进行三维分类，并进行三类分类。将最佳类（235,707个颗粒）的颗粒重新提取到全尺寸（0.93ÅPX-1），并进行三维细化，CTF细化和抛光，， 导致3.1-Å分辨率图。改进面罩的创建与LTAG -ATP – DNA重建中使用的掩码相似，尽管它包括OBD层。后来，将其拧紧到核心解旋酶和DNA，以进行分辨率估计（以及全球B因子锐化的应用）。从间隙DNA样品中进行了LTAG -ATP（APO）重建。在Relion 4中完成了二维分类和子集选择。使用腮红正则化（带有CTF细化）在Relion 5中进行了三维分类和自动进行。没有进行贝叶斯抛光。The total numbers of particles incorporated into the final reconstructions were: 92,330 (apo LTag–ATP), 210,910 (LTag–ATP–DNA), 97,587 (LTag–ADP–DNA), 235,707 (LTag–AMP-PNP-Mg2+–DNA) and 201,416 (LTag–ATP-Mg2+–DNA).局部分辨率图是在苯金斯中计算的，并在完整的地图上呈现（在后处理之前），并具有调整的着色。3DFSC58指标是从https://3dfsc.salk.edu/的Web服务器获得的。 　　使用CryoSparc 4.5.3（结构图生物技术​​）处理原点DNA数据集。录制的电影使用贴片运动校正模块进行了束诱导的运动校正，并使用贴片CTF估计进行了CTF估计59。使用斑点拾取器的颗粒直径为130Å，并以320Å的盒子大小提取。经过两轮二维分类后，分别保留了EP，分别保留198,000、148,881和80,452个颗粒，分别为AT和Full-Or-Or-Or-Origin数据集。这些颗粒用于产生从头开始的重建，并使用CryoSparc不均匀细化进行了精制。随后的CTF细化和后处理导致最终地图，半原子数据集的分辨率为3.1Å，全孔数据集的分辨率为3.7Å。最后，在5.0-β-2中重新提取粒子堆，并进行进一步的三维分类，以识别具有更强DNA密度的类。 　　使用EMREDREV.1和V.2（参考文献28）（使用默认参数，而无需指定输入结构或掩码），将产生的体积用于ISOLDE29中的交互式模型构建的目的，并与per自动计算的B因子一起使用，而无需指定输入结构或掩码）。关系或冷冻PARSPARC后处理图也用于从ModelAngelo（V.0.1）60得出草稿模型，以指导后续过程。没有将后处理图的形式用于迭代地图细化本身。对于LTAG – ATP – DNA复合物的建模，最初，使用phenix和E1-ADP-MG2+–SSDNA晶体结构（2GXA）25的chimerax fordsitds d d d d chimerax，使用e1-adp-mg2+ - adp-mg2+–ssdna晶体结构（2GXA），使用E1 – ADP-MG2+–ssDNA晶体结构（2GXA），将ATP结合LTAG（1SVM）11的晶体结构进行了真实空间。地图 - 模型关联首先是在伊索尔德（Isolde）全球模拟的，其次是本地重建的多个周期和iSolde推荐的设置的真实空间改进。在后来的回合中，添加并重塑了跟踪链中的进一步基础和互补链。LocScale V.1.0（参考文献61）和Isolde改进的几次迭代用于改善DNA Nexus图和模型。为了建模LTAG-ADP – DNA复合物，使用IMODFIT和REAL SPACE精炼，将ADP结合LTAG（1SVL）11的晶体结构灵活地拟合到LTAG – ADP – DNA重建中，并与以前一样融合了SSDNA。然后像以前一样重建模型并完善。对于LTAG – AMP-PNP-MG2+–DNA复合物的建模，将LTAG – ATP – DNA的精制模型（省略DNA的双工部分）最初安装在Chimerax中的LTAG – AMP-PNP-MG2+–DNA重构中。自适应距离限制因素被应用于Isolde29中的单个链，并根据地图进行模拟。约束逐渐释放，模型完全重建。到最后，ATP被AMP-PNP和MG2+取代， 重新调整和重建。为了建模LTAG-ATP-MG2+–DNA复合物中的3DVA量，LTAG – ATP – DNA模型在刚体拟合到LTAG-ATP-ATP-MG2+–DNA共有图中之后，首先重新构建为工作共识模型。该模型从第一个主组件中灵活地拟合到中央采样量（frame_010）中。使用MatchMaker63将最高的Alphafold2（参考文献62）单体结构预测叠加到六个亚基中的每个亚基中。删除了与核心解旋酶265-627无有关的残基。自适应距离限制因素被应用于单个链，然后在Isolde中进行整个地图模拟。限制逐渐释放，模型重建到端到头。将派生的模型放入两个中间体积（frame_005和frame_015）中。自适应约束被重新申请，并完全重建上述模型。将这些模型放入终端量（Frame_000和Frame_019）中，并使用相同的过程进行重建。将主分量0的中心模型放入组件1的中心体积。重塑后，它被用作建模两个中间框架，然后像以前一样对两个中间框架进行建模。对主组件2重复了该过程。上述所有模型中的每个残基至少一次重建一次。使用默认建议的Sigma为0.6，使用Model-MAP Q-SCORE33 CHIMERAX插件计算Q分数。使用Emringer V.1.0.0（参考文献64）进行了以侧链为中心的模型和地图验证，平均分数为2.9（远高于必需的1.0）。共识LTAG – ATP-MG2+–DNA结构无法确定在整个过程中建模，这是由于其代表多个平均状态，并且主要用作临时模型，以生成可变性量的初始模型草稿。相对于地图的D99分辨率，使用近均方根偏差进行了验证建模65，并使用均方根偏差进行评估。为了将LTAG-ATP-MG2+–DNA复合物建模到3DVA验证量中，将每个组件的终端帧模型重新构建为从Isolde中相应的粒子子集中的反向预测的体积。为了建模LTAG – ADP – DNA和LTAG -ATP – DNA复合物中的3DVA体积，使用在Isolde中具有自适应约束的散装柔性拟合，将各个共识结构改进到每个组件的末端框架中。为了建模LTAG-ATP（APO）复合物，首先将LTAG-ATP（1SVM）晶体结构用于phenix Realpace精制到APO LTAG-ATP重建中，并用EMREDREDREVES进行了后处理。使用匹配制造商在六个链中对应于氨基酸266-627的Alphafold2单体预测，并在伊索尔德（Isolde）进行自适应距离约束，并进行分子动力学柔性拟合。限制因素在整个地图模拟中释放，然后在Isolde进行局部重建。为了建模LTAG-AMP-PNP-FULL-ORIGIN，LTAG-AMP-PNP-EP和LTAG-AMP-PNP-AT复合物，LTAG – AMP-PNP-MG2+–DNA FORK结构被互动地重塑到使用Isolde的LTAG映射到LTAG的映射中。在伊索尔德（Isolde）进行细化之前，将配对的链和进一步的跟踪链碱添加。使用DSSP66，所有最终的Phinix真实空间精制结构均分配了二级结构注释。对于包含AMP-PNP的结构，从全球相分级Web服务器（https://grade.globalphasing.org/）下载的大亨配体约束。 被纳入了近肉真实空间的精炼中。 　　在UCSF Chimera67和Chimerax68中可视化图，并使用Chimerax 1.7和1.8或Pymol 2.6.0制备所有模型插图和变形。 　　EP half-origin primers with 32-nucleotide extensions (5′-CACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGC CTCTGCATAAATAAAAAAAATTA-3′ and 5′-TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCG GCCTCTGAGCTATTCCA首先在退火缓冲液（40 mM Tris-HCl（pH 7.5），50 mM NaCl和10 mM MGCL2）中在等效部分中退火。将混合物加热至95°C 5分钟，然后在室温下以每分钟1°C逐渐冷却。随后，将混合物在100 V时进行10％ - 硼酸酯 - 硼酸EDTA聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时和15分钟。后来使用乙醇沉淀从凝胶中纯化该产物。放松测定的总反应为20μl。最初，将5 nm的底物与LTAG在反应缓冲液（20 mM Tris-HCl（pH 7.5），50 mM KCl，0.1 mg Ml-1牛血清白蛋白，10 mM MGCL2和1 mM DTT）中在37°C下孵育10分钟。使用了各种浓度的LTAG（50、100、200、300、400和500 nm）。通过添加4 mM ATP启动反应。45分钟后，将反应用停止缓冲液（1％十二烷基硫酸钠，50 mM EDTA和30％甘油）淬灭。随后，将10μl的最终反应加载到10％的Tris -Borate -Edta聚丙烯酰胺凝胶上，并在100 V处运行1小时。最后，使用台风9400激光成像仪（GE Healthcare）可视化产品。 　　没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。