在光系统II中O2形成期间中间体的结构证据II

　　在100 mm 2-（N-甲氯）乙酸，pH 6.5，pH 6.5，100 mm ammon氨基和35％（3.000 ce）中，在100 mM 2-（N-甲基甲酸）中，在100 mm 2-（N-甲基甲酸）乙酸中进行了X射线衍射测量（先前命名为vestitus的PS II二聚体（先前命名为热的旋球弹药））制备的X射线衍射测量。51,52）。PS II晶体悬浮液在约0.5–1.2 mm叶绿素浓度（CHL）浓度下，将其加载到注射器（汉密尔顿Gastight注射器，1 ml）中，并在数据收集之前进行1小时。膜入口质谱（MIMS）用于确定O2的演化，周转参数和S状态人群4,6。PS II晶体没有基于XE和电子顺磁共振测量值的Mn（II）污染53，并且表现出2500±100μmolO2（Mg（Chl）×H）-1的活性。 　　使用液滴射血54与录像带样品输送方法55结合使用。For capturing the stable intermediates S2, S3 and S0, each droplet of the crystal suspension was illuminated by 120-ns laser pulses at 527 nm using an Nd:YLF (yttrium lithium fluoride) laser (Evolution, Coherent) at Linac Coherent Light Source (LCLS) or by 8-ns laser pulses at 532 nm using a combination of twoNd:YAG (yttrium aluminium garnet) lasers (Minilite, Continuum) at Spring-8 Angstrom Compact free electron Laser (SACLA) via three fiber-coupled outputs with a delay time of 200 ms between each illumination and of 200 ms between the last illumination and the X-ray probe, similar to what was used previously to accommodate the acceptor quinone QA and QB kinetics and有效驱动S州的过渡4,6,55。我们实现了皮带速度和沉积延迟的反馈控制系统，并相应地调整了闪烁的延迟和液滴阶段55。为了达到照明和X射线探针之间的时间延迟超过200毫秒，使用了第四个“自由空间”激光器。这是在大分子分子飞秒晶体学/LCLS仪器/LCLS仪器或NT230 Opo激光器系统（530-NM波长，5-NM脉冲宽度，ekspla Co.）处，要么是大分子飞秒晶体仪/LCLS仪器或NT230 OPO激光系统的Obolette 355 LD激光器（Opotek，530 nm波长，7-NS脉冲宽度）。触发此自由空间激光器与X射线脉冲同步，可调节延迟，该延迟设置为50至4,000μs。激光器的光学元件被带到X射线相互作用斑点，并且在每个延迟时间内对其位置进行了微调，以确保激光点位置与所选延迟时机处的样品液滴的位置相吻合。在Xfels， 由于发现实验中使用的样品的尺寸和浓度为70 MJ，每CM2的光强度为120±10 mJ，每CM2的O2进化为70 mJ饱和。4。每CM2的光强度为120 mJ，对应于晶体前5 µm层的5 µm前5 µm层吸收的约140个光子，当假设晶体的厚度为60 µm时（这是本研究中使用的晶体尺寸极限），则对晶体的厚度为60 µm，为5 µm层使用60 µm的光子。即使在激光束上彼此堆叠的两个晶体的情况下，这种光子密度也可以确保在整个晶体体积上饱和。给定最小脉冲长度为5 ns和35 CHL每PS II单体，光强度的前部平均每平均为0.8个光子（CHL和纳秒），而晶体后部的平均值为0.8个光子（Chl和nansecond）。如果PS II中心正在进行电荷分离，则以荧光形式迅速消散了由内部天线CHL吸收的额外光子，平均荧光寿命约为0.5-1 ns，因此防止了反应中心的任何过度兴奋或导致任何加热工厂。 　　晶体学数据在各种设施中收集，详细信息在补充表2中列出。还列出了用于收集每个数据集的实验光束条件和检测器配置。使用先前描述的Drop-on-Tape Setup55将样品交付到X射线相互作用区域中。参考文献中详细介绍了填充不同S状态的照明条件。4。 　　使用程序拨盘处理了针对不同照明状态的数据。STILLS_PROCESSA =117.0Å，B =221.0Å，C =309.0Å，α=β=γ= 90°且空间组P212121。布拉格斑点集成到检测器的边缘。考虑到液滴尺寸，胶带厚度，胶带角度以及衍射点在检测器上相对于晶体位置，将由于样品输送系统的传送带引起的Kapton吸收校正均应用于每个集成的Bragg斑点。在集成之前，我们还使用程序CCTBX.XFEL.STRIPE_EXPERIMEMS对晶体和检测器参数进行了整体改进，该程序已被证明可以缩小单位细胞分布并改善最终的同构差MAPS56。最后，使用程序CCTBX.XFEL.MERGE合并了强度，该程序使用参考模型中的单位单元格阈值对晶格进行了每个图像分辨率截止和滤波。为了合并思考，我们使用参考文献中描述的最佳实践。57。在扩展数据表1和2中将与每个数据集合并的晶格数量列出。 　　获取最终合并数据集的2F，3F（50 µs），3F（250 µs），3F（500 µs），3F（730 µS），3F（1,200 µS），3F（1,200 µs），3F（2,000 µs），3F（4,000 µS）和3F（200毫秒）的2.1和2.1和2.16和2.16和2.16和2.16和2.16和2.16和2.0和2.0和2.0和2.0和2.0和2.0和2.0和2.0和2.0和2.0和2.0和2.0和2.0和2.16和2.0和2.0和2.0和2.0和2.0和2.0和2。39,199晶格（扩展数据表1和2）。模型构建之前的最终合并数据集也以每分辨率bin为基础为参考数据集（在这种情况下，参考数据集是PDB ID代码7RF1中发布的PS II数据集）12。这使我们能够对MFOBS -dfCALC进行更准确的比较，省略了不同数据集之间的MAP和2MFOBS -DFCALC图。 　　每个数据集使用高分辨率PS II结构（1.89Å）进行了完善，该结构（1.89Å）使用Program Phinix.Refine58在先前的工作（PDB ID代码7RF1）12中作为起点。改进是在几个阶段完成的。首先，将起始模型的B因子设置为30，并且所有水域和OEC的原子都被去除。对15个循环进行了最初的刚体细化，再加上XYZ坐标和各向同性B因子，以将模型调节到晶胞中。接下来，将OEC原子添加回去，并使用几个周期的自定义键合限制来改进。我们还对叶绿素A（允许在细化中允许正确放置MG相对于卟啉环的平面）和未知的脂质样配体（固量酸），对叶绿素A（允许正确放置）使用自定义键合约束。在最初细化了OEC+蛋白质复合物后，使用Phenix.Refine拾取协议以及通过COOT59的水分放置水并进行多个细化周期。 　　在此阶段，我们将模型分为OEC和OEC本身（仅蛋白质和OEC原子）附近的多个组件（扩展数据表3）。分裂仅在链A/A，C/C和D/D的部分进行。每个时间点中每个时间点的组件的基本原理和人口均在每个时间点估计种群分布的部分中进行了描述。在每个数据集中，使用倒数XYZ+各向同性B因素的细化策略来完善主构象异构体（定义为从S3到S0前进的中间体）。对于二级/第三纪组件（其结构称为S3或S0状态），仅调整B组因子（phenix.refine中的Group_ADP策略）才能将其调整为数据集的分辨率。对于不拆分模型的其余部分，对多个循环进行了常规的XYZ细化和各向同性B因素的细化。所有水域（除了连接到OEC的末端水；即W1 – W4）作为单个成分。 　　OEC在多组分模型的主要组件中的细化是使用用于对S3状态建模的自定义约束进行的。但是，在所有时间点时，我们都使用了略带宽松的S.D.约束的值（键为0.1Å，角度为10°），使得在细化过程中允许OEC原子朝着电子密度最佳建模的地方移动，同时降低了细化中的应变，同时保持簇的整体形状。S0状态中的OEC以用于我们先前发表的S0状态结构的限制来建模。为文本文件提供了用于对OEC原子建模的限制因素（补充数据中的方案1-3）。 　　S3→S0转换中的S-StAT人群分布是一个异质分布，由（1）中心从S3到S0状态，（（2）中心落后于一个过渡，因此从S2到S3状态和（3）中心落后于S3状态和（3）中心，并且已过渡到S0状态。虽然大多数中心是类别（1），但由于PS II20中KOK周期的固有效率低下（“误差”），但一定一定的中心属于类别（2）。此外，在S3 – S0过渡中的一定时间之后，大量中心将形成稳定的S0状态（类别（3））。 　　在这种情况下，重要的是要在我们的结构建模中考虑这种种群异质性，以获得准确的电子密度图和模型。我们通过将活性位点区域（包括OEC）附近的结构模型分成多个组件来做到这一点。每个数据集中的主要组件是类别（1），它是从S3到S0的中间跃迁。次级和三级组件的性质取决于所考虑的数据集。在每个数据集中，仅优化主要组件的坐标/各向同性B因子（类别（1））。二级和三级组件结构是根据已知或先前沉积的结构建模的，仅使用B因素的细化进行调整以解决。次级（和第三级）组件的身份取决于正在处理哪个时间点。例如，在3F（50 µS）数据集中，使用用于二级分量的2F（50 µS）模型坐标/B因子构建了两个组件模型。在3F（1,200 µs）数据中，我们使用了一个三部分模型，其中次级和第三纪成分为S0和S3状态。在扩展数据表3中给出了各个时间点中每个组件的种群。我们使用文献中可用的数字进行动力学分析，得出人口分布的估计值。由于低于10％的种群在结构性改进的噪声水平中，我们调整了种群，以避免任何人群如此低的构象异构体。 　　先前使用MIMS技术确定了每个亚稳态状态的种群分布。在我们的工作中，通过用两个闪光间隔为200 ms的两个可见激光器通过照明产生的起始2F状态，由大约65％的S3状态和35％S2状态组成，基于对晶体进行的研究。使用第三个可见闪光灯，S3→S0转换开始。参考文献中将读者转介到扩展数据。4有关如何估算每个闪光灯状态的S状态种群的更多详细信息，请考虑从XES和MIMS数据计算出的错过参数以及盘缩（这是在本研究中使用的磁带速度和声音液滴弹出的速度和沉积频率可忽略的）。本文中描述的所有结果均来自单体I（在已发表的结构中以大写为大写）。观察到单体II的类似趋势（链条注释为小写）。 　　MN1 – MN4距离一直伸长，直到经历了S3→S0跃迁的中间体中的3F（1,200 µs），然后在接下来的3 ms中看到减少。我们通过构造一个替代假说来解释这一观察结果，在3F（1,200 µs）下测试了细长距离（1,200 µs）的鲁棒性，这可能是由于主要组成部分中两个单独的人群造成的：（1）由于MN1 – MN4的距离增加而导致的MN1 – MN4距离降低了MN1 – MN1 – MN444444444444444444的距离（2）的距离（1）距离（2）的距离（2）的距离（2）的距离（2）的距离（2）的距离（2）的距离（2）的距离（2）的距离（2）的距离（2）的距离（2）的距离（2）距S3→S0过渡。我们通过将S3种群从35％增加到55％，并在3F（1,200 µS）时间点将主要成分（随/无OX）从40％降低到20％，从而对这种情况进行了建模。所得的细化得出的MN1 – MN4距离为5.14Å（带有OX）和5.09Å（无OX）。这两个数字都类似于图3中给出的距离和测量误差。因此，测试与S3状态相比没有收缩，并允许我们拒绝该假设。我们重申，使用上一节和过去出版物中详细介绍的多个独立实验，在3F（1,200 µs）中的S3人口估计值为35％。 　　为了估计每个时间点的OEC原子和周围氨基酸的位置精度，我们使用了末端/快速程序60，类似于先前使用的末端60。简而言之，在这种方法中，我们在±（MFOBS -dfCALC）之间扰动结构因子。该时间点的最终模型的原子坐标也受到少量的扰动，以允许该模型探索更大的相位空间（只有主要构象异构体受到干扰）。随后，每个时间点都会生成100个这样的合成数据集，然后分别分别精炼。从这些精制数据集的合奏中，我们可以估算与感兴趣的距离指标相关的错误。所获得的误差应视为上限，因为结构因子中引入的扰动是对实验中的真实误差的高估。 　　实施详细信息可在https://bl831.als.lbl.gov/end/rapid/end.rapid/documentation/end.rapid.manual.htm中找到。 　　所有MFOB- DFCALC省略了手稿中显示的图。对于峰值计算，无论何处，我们都使用自定义的Python脚本，平均MFOBS-dfCALC省略了映射值的值约为感兴趣原子的0.5Å半径。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。