猿基因组的完整测序

　　大多数以前的全基因组对猿的比较研究都受到下组合物映射到更高质量的人类基因组的限制。因此，引入了人类参考偏见。由于这里的组件具有可比的质量和连续性，因此我们试图通过创建猿猴pangenome作为一个公正的框架来理解进化的框架来减轻这种偏见。首先，我们使用渐进式仙人掌15使用不同的参数来构建几个卵巢瘤，其中包括人和猿类的单倍型（补充注释III和数据可用性）。可以预见的是，所得的种间图比最近发布的47个个体的人类pangenome更为复杂16。例如，一个猿猴的pangenome是3.38 GB，与以前的纯pangenomes相比，边缘和节点的数量是边缘和节点的三倍。由此产生的对齐使我们能够注释基因和重复序列以及人类GRCH38参考的更多碱基对的祖先状态。在应用了1000个基因组项目和Ensembl17使用的类似副杂音的方法之后，我们观察到与现有的Engembl注释相比，总祖先注释的基本对增加了6.25％（第112页），并且染色体上的染色体最大增长了19（21.5％； 21.5％;补充;补充图）。作为第二种方法，我们应用了Pangenome Graph Builder18，以构建所有12种非人类灵长类动物（NHP）单倍型（6种）以及3 T2T人类单倍型（T2T-CHM13V2.0和2个单倍型T2T-HG002V1.0）。我们使用这些成对的对准数据来构建所有六个物种的隐式图（补充注释III，“隐式Pangenome图”），并使用Phastcons V1_5为基因组中的每个基对计算了保护评分（补充注释III（“保护分析”）和补充图IIII.9）和补充。。该方法是传递的，没有参考偏置，并考虑了每个基因组和独特和重复区域的组装单倍型。结果，我们确定了每个灵长类动物谱系中最快发展的区域，包括主要的组织相容性复合物（MHC）和8p23.1染色体倒置（补充图IIII.9）。 　　总体而言，完整的APE基因组之间的序列比较显示出比以前估计的更大的差异（补充说明III – IV）。实际上，猿类基因组的12.5–27.3％未能对齐或与简单的一对一对准不一致，从而引入了差距。与单核苷酸变异物相比，受影响的巨蛋的数量显示出5倍至15倍的差异，这是由于基因组的迅速发展和结构变异区域以及重复区域中对准的技术限制（补充图III.11和III.12）。我们在APE基因组中分类了所有结构上不同区域（SDR），并发现每个猿类谱系的平均序列为327 Mb（10％）（图2A和补充注释V）。可以预见的是，其中包括centromeres，中心的短臂和亚末端异质帽，但在大规模重排的断裂点富含基因的SD区域也有许多富基因的SD区域（补充图V.15）。我们专注于可以可靠地对齐的段，然后估算了跨猿物种树的谱系时间，并建模了不完全的谱系排序（ILS）（图2B和补充表VI.26）。我们的分析日期是人类 - 奇义齐（Chimpanzee）在5.5到630万年前的分裂（MA；最小到差异的最大估计值），非洲猿在10.6-10.9 Ma中分裂，猩猩分裂为18.2–19.6 MA（图2A）。我们推断ILS平均39.5％的常染色体基因组和X染色体的24％。与最近的报道20相比，这些值代表常染色体IL增加7.5％，结果部分是由于包含更重复的DNA（补充图VI.16）。因此，我们估计人类 - chimpanzee -benobo祖先人口大小（平均NE = 198,000）大于人类 - 奇姆齐 - gorilla祖先（NE = 132,000），结果与6-10 MA的祖先人群的增加一致。 （补充注释VI）。接下来，我们通过识别Hard21和Soft（部分）22选择性扫描的区域，基于简短阅读的全基因组测序数据的映射，从而搜索每个猿类物种中的适应性签名，该区域是由大猿遗传多样性生成的映射，该数据由大猿遗传多样性项目23,24,24,25,26（补充注释VII）回到T2T基因组。在猿类物种中，我们分别确定了143个和86个候选区域的硬和部分选择性扫描（补充表VII.31）。我们还鉴定了七个重复重拼合基因，这些基因在重复的两个独特的侧翼序列上都显示了选择的签名。以前，大约一半的硬选择性扫描（143个中的74个）和80％以上的部分选择性扫描（在86个中的70个）尚不清楚，总共43个区域与先前在人类中发现的扫描重叠。 　　我们应用了两个基因保管管道（比较注释工具包（CAT）和NCBI）来鉴定每个NHP的蛋白质编码和非编码RNA（NCRNA）基因的蛋白质编码（NCRNA）基因。我们通过直接映射从每个样品产生的PACBIO ISO-SEQ转录组长读数（50 GB的全长非核（FLNC）cDNA）来补充注释管道，并搜索对具有多个外显子的基因的转录支持。蛋白质编码基因的数量在不同的猿类之间是可比的（n = 22,114–23,735），与人类相比，预测将获得或重复或丢失的1,000多个基因略有超过1,000个基因（补充表VIII.34）。使用加利福尼亚大学，基于Gencode28的Santa Cruz（UCSC）基因集，我们估计现在代表了99.0-99.6％的相应人基因，> 90％的基因是全长的。我们确定了NHP T2T基因组中存在的蛋白质编码基因的一部分（3.3-6.4％），该基因中包含新的转录模型相对于人类基因组的注释。其中包括770–1,482先前未知的基因模型，对应于NHP中的315-528个基因家族，约68.6％对应于谱系特异性SDS，所有这些基因家族对应于特异性SDS，所有这些都由ISO-SEQ转录本（补充表VIII.34.34和VIII.35）支持。在此列表中，我们还发现了诸如LRPAP1之类的生物医学基因，为此，旁系同型在成纤维细胞和睾丸中表现出组织特异性的表达（补充注释VIII）。我们还确定了与额叶皮层的人类进化相关的人类特异性基因，包括SRGAP2C29,30，ARHGAP11（参考文献31）（补充表VIII.40）和Notch2NL32,33（与神经元内核内包含疾病有关）。非SD重叠基因拷贝由73％的转录本模型组成，这些模型以其顺序更改> 50％，其余27％不再翻译。此外，2.1–5.2％的成绩单显示了先前未知的NHP剪接形式，这些形式再次由ISO-SEQ数据支持 （补充表VIII.34）。我们通过整合NCBI和CAT管道（补充注释VIII），以策划共识蛋白编码基因注释的形式提供宝贵的资源。我们还分析了从睾丸从第二个个体中获得的FLNC读数，以量化潜在的影响全基因组对基因注释的影响，并观察到可实用性，完整性和准确性的提高（补充说明VIII和补充图VIII.29）。例如，在大猩猩中，我们将28,925（0.7％）的额外读数绘制给了T2T组件，而对先前的长阅读组装5的读数仅171个。同样，我们在大猩猩T2T组装中观察到33,032（0.7％）软胶读（> 200 bp），而映射到先前的组装5时，与89,498（2％）的软胶读数相反。这些可实现性的提高在centromeric，端粒和SD区域与基因座不均匀分布，与以前的基因组组件相比，拷贝数的数量增加（补充图VIII.29E – G）。 　　我们生成了所有高复制重复序列的几乎完整的人口普查及其在猿基因组中的分布（扩展数据表1，补充注释IX和补充表IX.41）。有了这些新信息，我们估计APE基因组的常染色体包含53.2–58.0％的可检测重复序列，其中包括可转座元件，各种类别的卫星DNA和可变数字串联重复序（VNTRS）等（补充图IX.30）。该常染色体含量明显低于性染色体（X，61.8–66.3％； Y，71.1-85.9％）11。与以前的基因组组件相比，根据物种的不同（补充表IX.42），重复含量从286 MB增加到706 MB。大猩猩，黑猩猩，bonobo和Siamang基因组显示出更高的卫星含量，这在很大程度上是由于亚末端异质素通过谱系特异性卫星和VNTR膨胀的积累而驱动（图1，扩展数据表1和补充图IX.30）。卫星占重复变化最大的变化（扩展数据表1），范围从牛牛肉中的4.9％卫星含量（总计159.2 MB）到大猩猩的13.0％（总计462.5 MB）。对外显子和重复注释的间隙的分析导致鉴定159个以前未知的卫星单体（补充表IX.41 – Ix.50），在每个基因组分类的其他碱基对中的范围从0.5至7.1 MB（补充图IX.30）。值得注意的是，大猩猩基因组中的序列的3.8 Mb由大约36 bp的重复组成，此处称为VNTR_148，该重复分别占BONOBOS和BONOBOS和CHIMPANZEES中的841.9 kb和55.9 kb（补充表IX.43）。这种重复显示了与无关重复PCHT亚末端卫星相似的扩展模式，这表明它可能通过类似的机制进行了扩展。 　　多个序列对齐使我们能够定义一组截断和全长线，ALU，ERV和SVA Retrotransposon插入（补充表IX.53-Ix.55）。基于插入的绝对数量和完整的开放阅读帧（ORFS）的全长元素的数量，猩猩似乎具有最高的线1（L1）动员率。相比之下，非洲猿类（大猩猩，黑猩猩，Bonobo和Human）显示出更高的ALU插入量（图2C）。具有完整ORF的L1逆转录子数量为5.8倍，黑猩猩具有最低（95），猩猩的数量最高，具有最高的L1逆转录子的2.5倍，具有完整的ORF（在Gorillas中，猩猩种的500多个）。人类落在这个范围之间。猩猩中具有完整ORF的全长L1元素的总数和高百分比意味着最近的高L1活性。猩猩中的Alu活性是静止的，这与以前的报道一致，并指示L1逆转座子在兼容Alu逆转录转座子的基因组环境中。当仅考虑具有目标位点重复以及GAG（CAPSID）和POL（逆转录酶和集成酶）编码域的全长ERV元素时，观察到明显的差异。详细说明，在大猩猩（57）中观察到更高的全长物种特异性ERV含量，其次是人类（12）和黑猩猩（4）。PTERV和HERV-K用目标位点重复和蛋白质结构域的ERV元素，以及大猩猩，人类，黑猩猩和BONOBOS的ERV元素的降解元素（图2D和补充表IX.56）。 　　完整的APE基因组使得可以更详细地研究高生物医学相关性的结构复杂区域，尤其是在人类疾病方面。此外，这里产生的四个灵长类动物基因组（Bonobo，Gorilla和Two猩猩物种）来自成纤维细胞而不是淋巴母细胞系。尤其是后者是大多数先前的猿基因组组件中最常见的来源，它限制了受体细胞重排影响的基因座的表征（例如，免疫球蛋白基因）35。因此，我们专门针对与受到复杂突变过程或选择性作用的免疫反应或抗原呈递相关的九个区域。 　　免疫球蛋白和T细胞受体（TCR）介导与外国和自我抗原的相互作用，并由大型，扩展的基因家族编码，这些基因家族在物种内和物种之间经历了快速多样化36,37。我们对免疫球蛋白重链（IGH），轻链Kappa（IGK）和轻链lambda（IGL）以及T细胞受体α（TRA），β（TRA），β（TRB），γ（TRG），Delta（TRD）和DELTI的含量（辅助指标X构建）进行了比较分析。2a和补充图X.32a）。我们平均确定了60（IGKV），33（IGLV），46（TRAV和TRDV），54（TRBV）和8（TRGV）五个基因座的每个物种每个物种每个物种每个家族单型型的推定功能性免疫球蛋白和TCR基因（扩展数据扩展数据）（扩展数据。如前所述，对于人类的单倍型，APE免疫球蛋白和TCR基因基因座的特征是物种内部和物种之间的较大结构差异，占HAPLOTYPE型间长度长度差异的33％，在TCR基因座中高达10％。该结果表明，免疫球蛋白基因座比TCR基因座的差异更快，这可能是由于与MHC所需的相互作用所需的相互作用（扩展数据图2b，c），这可能是由于在TCR基因座上放置的进化和功能约束所致。此外，免疫球蛋白基因座显示出最大的结构变化，包括所有IGH单倍型的串联重复的基因扩展，大猩猩IGK单倍型的远距离重排和显着的1.4 MB反转，以区分两种IGL Haplotypes的构型构型（扩展图2A）。X.32a，b）。这些大规模的差异通常与特异性基因集（构成了针对Bonobos，大猩猩或两种猩猩物种的基因的系统发育进化枝的基因组；扩展数据图2a和补充图X.32C）。我们观察到IGH中最大数量的物种特异性基因（补充图X.32d），为此，我们还指出，相对于其他六个基因座，SD的密度较高（扩展数据图2D）。这一发现表明，免疫球蛋白的基因组结构可能是种内进化的关键驱动力。 　　我们还完全组装并注释了与4-5 MB MHC区域相对应的12个APE单倍型（补充Note XI）。MHC基因座编码针对抗原表现至关重要的各种细胞表面蛋白和适应性免疫38在哺乳动物中高度多态性39，并且与人类疾病有着强烈影响40。比较序列分析证实了明显的序列差异和结构变化（与人类相比，NHP的平均328 kb缺失和422 kb的插入），包括重复的介于99.3 kb的介于siamang的99.3 kb，从苏马特兰H-2中的sumatran orangutan h-2和sudmantion h-2（及xi.57）和xi.57和xi.57和xi.57和xi.57和xi.57相关的重复。特定的MHC基因（扩展数据图3A，B）。总体而言，MHC I类基因在NHP内和NHP中显示出比MHC II类基因更大的结构变化（扩展数据图3A，B），每个单倍型平均重复序列的平均复制序列要大（171 kb对62 kb）。在该区域中，在缺乏功能性MHC-C基因座的Siamangs中看到了特别高的差异，而是携带一个明显具有功能性的MHC-J样基因座，该基因座仅在人类中被发现为假元（扩展数据图3A和补充图图。XI.33-xi.40）。尽管MHC I基因含量和组织在人类，Bonobos和Chimpanzees中几乎相同，但其他猿类显示出更多的变化，包括其他基因，例如Gogo-Oko，但与Gogo-A相关但与Gogo-A相关，以及与猩猩特异性的假元MHC-AP，这与HLA-H39（HLA-H39（Extended Data）有关。我们观察到两种猩猩物种中MHC-A和MHC-B基因的扩展（扩展数据图3A和补充图XI.38和XI.39），MHC-A具有拷贝数变化，并在每个物种的两种单型中均具有一个或两个副本，MHC-B复制。同样，两种猩猩物种都在一种单倍型上均显示MHC-C的损失，但在另一个单倍型上保留了它（扩展数据图3A，补充表XI.57和补充图XI.38和XI.39）。所有NHP的MHC II基因座几乎相同，除了DRB基因座以外，已知该基因座在人类41中显示出拷贝数变化，并且在此处显示APES之间的模式相同（扩展数据图3B，补充表XI.58和补充图。我们还观察到了两种情况，其中MHC II基因座以一种单倍型上的功能基因以及另一种单倍型上的假元（例如，大猩猩中的Gogo-DQA2基因座和Sumatran Orangutans sumatran orangutans中的POAB-DPB1基因座）上存在。从先前发表的黑猩猩，Bonobos，Gorillas和Sumatran Orangutans42的基因组中对其他MHC单倍型的注释显示，MHC基因之间的结构变化可比（补充表XI.62-xi.65）。总体而言，这种观察到的MHC基因组织的变化与长期平衡选择一致。41。 　　鉴于MHC基因座的深层结合，我们对完整的APE序列进行了系统发育分析。我们成功地构造了1,906棵基因树，其中包括六个猿类物种的MHC区域的76％（扩展数据图3C）。我们确定了19个不同的拓扑结构（补充注释XI），其中3个代表该地区的96％（1,830个），通常与物种树和主要的ILS模式一致。其余的4％是在200-500 kb区域内聚集的不一致拓扑结构（补充表XI.59），并对应于MHC I和II基因。我们估计这些区域之间的聚结时间在物种之间的范围从10到24 mA。 <1–14 Ma within species (Extended Data Fig. 3c and Supplementary Fig. XI.42). We next performed genome-wide tests of selection as described above. Selection signatures and nucleotide diversity in the MHC region were among the top 0.1% genome-wide. These signatures confirmed long-term balancing selection on MHC in multiple great ape lineages, including central and eastern chimpanzees, as well as at least two regions in MHC consistent with positive selection in bonobos and western chimpanzees43. 　　We identified at the sequence level all 26 large-scale chromosomal rearrangements originally described decades ago44 that karyotypically distinguish humans from other great apes (Supplementary Note XII, Supplementary Table XII.66 and Supplementary Fig. XII.43). However, during our breakpoint characterization of known inversions, we identified several events that seemed to be more complex and seemed to be the result of serial inversion events (Fig. 3 and Supplementary Fig. XII.43). As an example, we identified a 4.8 Mb fixed inverted transposition on chromosome 18 in gorillas (Fig. 3a–c) that was incorrectly classified as a simple inversion but more likely to be explained by three consecutive inversions specific to the gorilla lineage transposing this gene-rich segment to 12.5 Mb downstream (Fig. 3a–c). Similarly, the complex organization of orangutan chromosome 2 (human chromosome 3 (HSA3)) can be explained through a model of serial inversions that required three inversions and one centromere repositioning event (evolutionary neocentromere (ENC)) to create Bornean orangutan chromosome 2, and four inversions and one ENC for Sumatran orangutan (Fig. 3d,e). In addition to known events, complete sequencing of SDs in the ape genomes revealed hundreds of previously undescribed inversions. Focusing on events larger than 10 kb, we curated 1,140 interspecific inversions, of which 522 are newly discovered7,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66 (Supplementary Table XII.67). For a fairer comparison with previous inversion calls, we also computed recall rates (<1 Mb) and found that 69.3% (79 out of 114) of the previously reported inversions were confirmed here. Among the 35 cases we missed, 24 corresponded to changes in inversion breakpoints, which were actually recalled and better resolved in this study, nine represented individual differences or previous error, and for the remaining two, our inversion call missed smaller nested inversions. An assessment of the genotypes of the inversion calls revealed that 632 were homozygous (in both assembled ape haplotypes), with the remainder present in only one out of the two ape haplotypes and were therefore probably polymorphisms. In total, 416 inversions had an annotated gene mapping to at least 1 of the breakpoints, with 724 apparently devoid of protein-coding genes (Supplementary Table XII.67). Of these inversions, 63.5% (724 out of 1,140) had annotated human SDs at one or both ends of the inversion, a result that represents a significant 4.1-fold enrichment (one-sided, simulation empirical P < 0.001). The strongest signal was for inverted SDs mapping to the breakpoints (6.2-fold; one-sided, simulation empirical P < 0.001), which suggested that non-allelic homologous recombination is driving many of these events. We also observed significant enrichment of previously unknown transcripts (Supplementary Table VIII.35) at the breakpoints of the inversions of African great apes (one-sided, simulation empirical P < 0.036). We parsimoniously assigned >猿类系统发育的纯合逆反转中有64％（补充图XII.45），其余反转预计是复发的。基于最大简约的分配给每个分支的反转数与分支的长度（线性回归，r2 = 0.77）相关，最大数量分配给了暹罗谱系（n = 44）。然而，人类的血统显示出比基于分支长度的预期反转数量少的五倍，而在使用伯恩猩猩作为参考而不是人类时，趋势仍然存在。 　　由于迅速发展的区域可以帮助阳性选择下的基因42或顺式调节元件进行功能变化67，因此我们采用了一种突变计数方法来识别APE Evolution67期间差异的祖先快速发展的区域（AQERS）（补充注释XIII）。这些AQER是基因组中最不同的区域，不考虑突变率差异（例如，串联重复或GC偏置）。因此，Aqers本质上对差异的潜在力量或力量不可知。我们在4个灵长类动物谱系中鉴定了13,128个Aqers（补充表XIII.68 – XIII.74），其中包括人类分支机构的3,268个（即Haqers）。我们的分析使从以前的大型灵长类动物组合中鉴定出的HAQER数量增加了一倍（n = 1,581；图4A和补充图XIII.46）。此类元素在重复的DNA中高度富集（例如，SDS P的5倍< 1 × 10–30, 2-fold for simple repeats P < 1 × 10–30 one-sided binomial test). HAQERs also exhibited a significant enrichment for bivalent chromatin states (repressing and activating epigenetic marks) across diverse tissues, and the strongest enrichment was observed for the bivalent promoter state (3-fold enrichment, P < 1 × 10–30 one-sided binomial test; Fig. 4a and Supplementary Table XIII.68). This signal was present to a lesser degree on the chimpanzee, bonobo and gorilla lineages (1.3-fold, 1.5-fold and 1.4-fold, respectively; P < 1 × 10–19, P < 1 × 10–30 and P < 1 × 10–12, respectively, one-sided binomial test). This reduced enrichment may be due to the chromatin-state differences between human cell lines and tissues (Supplementary Note XIII). An example of a human-specific HAQER change included an exon and a potential cis-regulatory element in ADCYAP1 (which encodes adenylate cyclase activating polypeptide 1), which is expressed in layer 5 extratelencephalic projecting neurons of the primary motor cortex. This gene shows convergent downregulation in the speech-related motor cortex in humans and the analogous vocal-learning extratelencephalic projection neurons necessary for speech and song production in songbirds68,69. Here we found downregulation in layer 5 neurons of humans relative to macaques (single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)) and an associated distinct human epigenetic signature (hypermethylation and decreased ATAC–seq) in the middle HAQER of the gene that was not observed in the same type of neurons of macaques, marmosets or mice (Fig. 4b and Supplementary Figs. XIII.47 and XIII.48). 　　We also applied a gene-based analysis (TOGA, a tool to infer orthologues from genome alignments) that focused on the loss or gain of orthologous sequences in the human lineage70 (Supplementary Note XIV). TOGA identified 6 candidate genes from a set of 19,244 primate genes as largely restricted to humans (absent in >其他NHP的80％；补充表XIV.75）。在人类和大猩猩中存在的候选人中有一个加工的基因FOXO3B，而foxo3a的charogue则与人类长寿71有关。尽管表达了FOXO3B，但其研究一直在挑战，因为它嵌入了介导Smith -Magenis缺失综合征的大型，高度相同的SD中（补充图XIV.50）。尽管需要进行广泛的功能研究来表征我们确定的数百个候选者，但我们释放了综合基因组（补充表v.24）和Genic（补充表v.25）加速区域的呼叫集，以进行未来的研究。 　　为了促进使用这些基因组进行下游分析，我们开发了一个UCSC浏览器集线器（https://github.com/marbl/t2t-browser），其中包括基本基因组对准，基因注释，加速区域和重复序列（数据可用性）（数据可用性）（数据可用性）。我们通过在未来的研究和后续论文中使用其他曲目来增强该浏览器。例如，我们映射了Repli-Seq，包括先前收集的NHP数据集72，以研究复制时机的进化模式，并确定了20种不同的复制时间状态，这些状态现在可以与不同的基因组特征相关（补充图XVII.54和XVII.55）。因为它们可以干扰线粒体DNA注释，所以我们创建了猿基因组中线粒体DNA起源（NUMT）的一组策划的核序列（扩展数据表1和补充注释IX）。我们观察到与非T2T组件相比，数量（3.7–10.5％）和总长度（6.2-30％）（6.2-30％）（补充表IX.51）有了可观的增长。我们还鉴定并注释了几乎完整的序列主题目录，能够形成非典型的（非B）DNA（G Quadruplexes，基于A的，直接，直接，镜像，反射，倒置和短串联重复序列），尤其是在以前难以接近的区域中，在历史上很难序列上很难序列73（补充表xv和补充表xv ii.1。我们用猿类的多尺度表观基因组图（包括DNA甲基化和复制时间）覆盖了这些数据（补充注释XVI – XVII）。Using the 5-methylcytosine DNA signature from long-read sequencing data, for example, we distinguished hypomethylated and hypermethylated promoters associated with gene expression and demonstrated that in each cell type, the majority (about 88%) of promoters were consistently methylated (8,174 orthologous ape genes assessed; Supplementary Tables XVI.76 and XVI.77 and Supplementary Fig.xvi.52）。该分析平均鉴定出大约12％的启动子在物种之间被甲基化的促进剂（成纤维细胞系1,035个和922个淋巴细胞细胞系）是该物种之间调节差异的候选者（补充表XVI.76和XVI.77）。与可变的甲基化启动子（P <10-16双面Mann – Whitney U检验；补充图XVI.52）相比，持续的甲基化启动子与更高表达的基因相关，并且CpG位点密度更高，这是CPG序列序列序列序列和转换的相关性的结果。这些注释将促进未来的研究，以了解与APE基因组中基因表达变化相关的基因组进化和表观遗传变化74,75。