二聚体NINJ1的自身抑制可防止质膜破裂

　　先前描述了具有C57BL/6 N背景的NINJ1 - / - 小鼠。野生型小鼠购自查尔斯河实验室。小鼠被安置在维持在14:10 h的动物室内的单独通风笼中，光线：黑暗循环，随意进入食物和水。动物室是温度和湿度控制的，分别在20-26°C和30-70％之间，每小时10至15室空气交换。从男性和雌性6-10周大的小鼠收集BMDM。使用三种野生型和三只NINJ1 - / - 小鼠来解释生物学方差，而无需随机或盲目。所有动物程序均根据Genentech机构动物护理和使用委员会的批准，以评估和认证实验室动物护理协会（AAAALAC）认可的设施，根据实验室动物的护理和使用指南以及适用的法律和法规。 　　收集野生型和NINJ1 - / - 小鼠BMDM，并在Dulbecco修改后的Eagle培养基（DMEM）中分化为巨噬细胞，并补充了10％（v/v）低dentototoxin胎毒素胎牛血清（Omega Scientific）和20％（V/V/V/V）L929-L929-L929-L929条纹。在分化的第5天，对细胞进行了重复，并允许在一个含有0.5×106个细胞的24孔板中粘附过夜。然后将这些细胞用1 µg ML -1 PAM3CSK4启动5小时，然后裂解天然页面或SDS -PAGE。为了表达和纯化所有小鼠NINJ1构建体，在37°C的Expi293表达培养基中培养了EXPI293F细胞（Thermo Fisher Scientific），8％CO2。Expi293f细胞未经认证，也未对支原体污染进行测试。对于成像和细胞毒性实验，将BALB/3T3克隆A31（ATCC）和HEK293T（ATCC）细胞分别保持在含有10％胎儿牛血清和青霉素/链霉素的完整DMEM中。使用CRISPR – CAS9使用以下前设计的指南从IDT：mm.cas9.ninj1.1.ac（5'-actgaggaggagtatgagctcaa-3'）和mm.cas9.ninj1.1.1.1.Ad（5'-actgaggagtatgagctcaa-3'）和（5'-actgaggaggagtatgagctcaa-3''和5'-actgaggagtatgagctcaa-3'（5'- actgaggaggagtatgagctcaa-3'），使用CRISPR – CAS9生成NINJ1缺乏的BALB/3T3细胞。BALB/3T3和HEK293T细胞通过短tandom重复分析和常规的单核苷酸多态性指纹进行身份验证。BALB/3T3和HEK293T细胞对支原体测试了阴性。 　　全长小鼠NINJ1（K45Q）（Uniprot ID：O70131），然后是C末端的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶识别序列和C末端的FLAG表位标签，将其克隆到哺乳动物表达载体中。该全长构建体用于纳米型发现，FSEC，SPR和CRYO-EM。对于表位特异性纳米机构选择，小鼠NINJ1（K45Q）残基G30至Q152，称为NINJ1（K45QΔN），然后将TEV蛋白酶识别序列和C末端的FLAG蛋白酶识别序列和C末端的Flag Epipope TAG鞭打到哺乳动物的表达量中。将细胞以每毫升3×106的细胞接种，并使用Expifectamine 293转染试剂（Thermo Fisher Scientific）根据制造商的方案进行转染。转染后18小时用增强剂溶液处理细胞，并在添加增强子后24小时收集。将细胞颗粒存储在-80°C下，直到进一步使用。用低位缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5、1 mM EDTA，0.02 mg Ml -1亮肽蛋白和160μgml -1苯甲胺）用低位缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5、1mM HEPES pH 7.5、1 mM HEPES pH 7.5、1毫米pH 7.5、1毫米）清洗细胞，然后用50 mM HEPES pH 7.5，300 mm nacl，1％（W/v）盐（W/v）0.1％（W/v）0.（Anatrace），5 mM MGCL2，2 mM ATP，0.02 mg ML -1亮肽素和160μgml -1苯甲胺二苯甲胺，在4°C下1.5 h。超速离心后，使用抗FLAG M2树脂（Sigma-Aldrich; A2220）对上清液进行亲和力纯化，并用洗涤缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，300 mm NaCl，NACL，0.1％LMNG，0.01％CHS）预先校准。用洗涤缓冲液进行大量洗涤后，用50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl，0.005％LMNG，0.0005％CHS和0.2 mg ML-1 FLAG肽（Sigma-Aldrich）洗脱蛋白质。使用50 kDa MWCO浓缩剂浓缩纯化的NINJ1，并将其加载到超级dex 200增加10/300 GL柱（GE Healthcare），用20 mM HEPES pH 7.5，150 mm NaCl和0.001％LMNG，LMNG， 0.0001％CHS。使用100 kDa MWCO浓缩剂浓缩峰值分数。将样品立即用于冷冻EM，或在液氮中闪烁闪光，并在-80°C下储存，以发现纳米病毒，FSEC或SPR。对于纳米轴重建，将全长小鼠忍者（K45Q）通过珠子方法重构为纳米盘。Cell pellets were thawed, washed with hypotonic buffer, and subsequently solubilised with 50 mM HEPES pH 7.5, 300 mM NaCl, 1% (w/v) dodecyl maltoside (DDM, Anatrace), 0.1% (w/v) CHS, 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 0.02 mg ml−1 leupeptin and 160 µg ml−1在4°C下苯甲酰胺1.5 h。使用超速离心阐明溶解后，细胞裂解液，并将上清液应用于抗FLAG M2树脂。然后将树脂用含有50 mM HEPES pH 7.5、300 mM NaCl，0.1％DDM，0.01％CH的缓冲液洗涤，然后与1.2 mm大豆极脂质提取物（Avanti）孵育30分钟。随后是添加膜支架蛋白MSP 1d1（Sigma-Aldrich），最终浓度为0.6 mg ml-1。一个小时后，将60 mg ml-1的甲醇激活的SM2生物珠（Bio-Rad）添加到树脂中，并在4°C下旋转过夜混合物。用50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl洗涤树脂，并用0.2 mg ML -1 FLAG肽洗脱了ninj1 K45Q重构为纳米盘。将洗脱样品浓缩并像洗涤剂 - 溶解的NINJ1一样处理，除了20 mM HEPES pH 7.5，150 mm NaCl用作超级dex 200增加10/300 GL列的运行缓冲液。 　　1-甲米酰基-2-烯酰 - 甘油-3-磷酸胆碱（POPC，Avanti Polar脂质）和1-甲米酰基-2-烯酰基-SN--甘油-3-磷酸 - 磷酸 - 丝氨酸（钠盐）（Pops，Avanti Polar脂质）在氯仿中制备。生成了80％POPC和20％POP的脂质混合物，冷冻干燥，并用10 mm Tris pH 8.0，150 mm NaCl的溶液进行水合，其中含有货物，Lance EU-W1024 Biotin（Perkinelmer）。将悬浮液在水浴中进行超声处理，冷冻透视，并使用装有核孔的微型挤出机（Avanti Polar脂质）挤出，该挤出机（Avanti Polar Lipids）配备了核孔0.4-μm膜（Whatman），以产生大型的Unillamellar囊泡。脂质体通过穿过装有Pierce链霉亲素琼脂糖树脂（Thermo Fisher Scientific）的柱子洗脱纯化。通过添加0.0005％LMNG/0.00005％CHS（Anatrace），脂质体不稳定。通过将不稳定的脂质体（脂质浓度为20μm，从6.4毫米库存稀释）与根据上述方案或0.5μm米利替蛋白肽（ANASPEC）纯化的5μMNINJ1来建立货物释放测定。将链霉亲和素 - 埃拉克萨荧光647（Thermo Fisher Scientific）以0.1μm的最终浓度添加到每个孔中。DDH2O中与0.0005％LMNG混合的脂质体用作对照。将所有样品加载到近距离（Perkinelmer）的井中。使用Envision Manager 1.14.3049.1193（Perkinelmer），将时间分辨的读数记录在Envision 2105多模板读取器（Perkinelmer）上。加载井后立即采集每个板的预读，然后将每个板在室温下孵育过夜。孵育约15小时后，通过在每个孔中添加1％的Chapso（Anatrace），进行了另一份读数，然后全部消化脂质体。记录了最终读取，代表100％的货物释放。结果被转换为每井释放的货物百分比，背景控制减去。 　　将野生型和NINJ1 - / - 小鼠BMDM播种在24孔板中（每个孔5.0×105个细胞），并按照上述过程进行启动。去除培养基并用PBS溶液进行轻微洗涤后，将细胞与50 mM HEPES孵育50 mM NaCl，并在室温下补充指示的戊二醛浓度（polysciences）10分钟。将100 mM Tris 8.0添加10分钟，以在去除所得溶液之前淬灭交联反应。通过与50 mM HEPES 7.5、150 mM NaCl，0.25％LMNG，0.025％CHS和1倍完整的蛋白酶抑制剂（Roche Applied Science）孵育1小时。在Optima Max-XP桌面超速离心（Beckman Coulter）中进行超离心后，将澄清的裂解物在50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl中稀释至0.2 mg ml-1，并在0.2 mg mL-1和闪光灯中稀释，以进行后续免疫印象。 　　Purified SEC fractions of NINJ1(K45Q) were diluted in 20 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.001% LMNG, and 0.0001% CHS, mixed with 4× NativePAGE sample buffer (Thermo Fisher) and loaded onto a NativePAGE 4–16% gel (Thermo Fisher Scientific) for resolution via blue native PAGE using Coomassie G-250 (Thermo Fisher科学）。每孔加载了三百个蛋白质的脱皮图。将样品转移到聚乙烯二氟（PVDF）膜中以进行免疫印迹。等效量的每个峰也被加载到SDS -PAGE上，并类似地进行免疫印迹。每孔加载2μg裂解物。 　　对于戊二醛交联测定法，以前冷冻的裂解物通过蓝色天然页面解析，并按照SEC分数所述的程序进行免疫印迹。将等效量的裂解物加载到SDS-PAGE上，并对NINJ1进行免疫印迹（Clone 25，Genentech，0.1 µg ML-1）1和α-微管蛋白（ProteIntech，66031-1-ig，Lot 10020240，10020240，1：10,000稀释）。 　　对于NINJ1分裂GFP免疫印迹，将细胞颗粒冻结并在1.5％GDN裂解缓冲液中（20毫米HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，1.5％，1.5％GDN）补充了Halt prot抑制剂（Thermo Fisher Sciention，78438）和Halt phossentic（78438）的photsentic inscasese（Halt praphiticer）（halt praphatifor）（halt praptor）（78438）。在4°C。在室温下（Thermo Fisher Scientific）将样品在Nupage LDS样品缓冲液中变性30分钟。对于突变的NINJ1免疫印迹，将细胞在10 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl，1％NP-40、2.5 mM MGCL2、0.5 mM CaCl2、5μgml-1 dnase（QIAGEN）和1×完整的蛋白酶抑制剂（ROCHE抑制剂）4°c中裂解。抗体识别抗兔或抗小鼠NINJ1（克隆25，0.1 µg ml-1）1，GFP（Rockland，600-101-215，Lot 46825，1：1,000稀释），α-管um蛋白（ProteIntech，66031-1-ig，lot 1002024020240，1：10,00020240，1 10,000,00020240，1 10,000,000,00020240，10,000,000,00020,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000，10,000,000,000,000,000,000,000，MOTEAB167453，1：1,000稀释）和β-肌动蛋白HRP（细胞信号传导，5125s，Lot 7，1：1,000稀释）。购买了HRP偶联的二抗抗体，从Jackson Immunoresearch购买，并在1：10,000稀释度使用：山羊抗小鼠（115-035-062，Lot 162808），山羊抗兔（111-035-144，Lot 160812）和Donkey Anti-Goat Goat（Donkey Anti-Goat Goat（7035-144）（7035-1435-1435-144）。 　　使用kunkel诱变构建噬菌体播放的纳米库文库。Kunkel诱变的停止模板是吞噬ps2202，其含有VH-4D5结构域，其次是M13次要涂层蛋白P3，在CDR-H1，CDR-H2，CDR-H2和CDR-H3上有终止密码子，以及H35G，Q39R，Q39R，L45E和W47L的突变，如前所述。设计诱变的寡核苷酸是为了同时修复终止密码子并引入CDR-H1，H2和H3的突变（补充表1）。 　　噬菌体播放的纳米病库通过5轮的结合选择进行循环，而在850、400、120、60和30 nm的LMNG/CHS中纯化的国旗标记的NINJ1（K45Q）浓度降低，在选择缓冲液中的含量为850、400、120、60和30 nm（25 mm HEPES pH 7.5，150 mm nacl，0.5％，0.5％，0.5％，0.00 chs，0.00 chs chs，0.00 chs chs，0.00 chs，0.00 chs，0.00 chs，0.00 chs，0.00 chs chs，0.00 chs chs，0.00 chs，0.00 chs chs chs。到先前描述的协议24。在前两轮中，使用了Pierce抗DYKDDDDDDDK磁琼脂糖珠（Thermo Fisher Scientific）。从第三轮开始，使用了抗FLAG M2抗体（Sigma-Aldrich）固定的NUNC 96孔Maxisorp免疫板。从2-5回合的噬菌体池中用2×20 µL的抗flag磁琼脂糖预先清除，以去除非特异性粘合剂。通过在室温下孵育1.5 mg ml -1的3×FLAG肽10分钟来洗脱噬菌体颗粒。经过五轮结合选择后，使用板毫米固定的抗FLAG M2抗体在高吞吐量噬菌体ELISA中分析单个噬菌体克隆，并捕获的NINJ1（K45Q）24。非特异性结合定义为噬菌体颗粒结合与抗FLAG M2抗体，BSA或对照膜蛋白的结合。选择了与信号> 0.5的NINJ1（K45Q）结合的噬菌体克隆，并选择了> 4的信号/噪声以进行进一步的ELISA筛选。与在LMNG/CHS中纯化并在纳米盘中重构的Flag标记的NINJ1（K45QΔN）结合的克隆被认为是FSEC和Cryo-EM分析的正子。 　　从噬菌体显示载体放大了NB538的序列，并在DKThtggsgsGGS链接器序列后用C末端的六位依二胺标签将细菌表达载体克隆到细菌表达载体中。将构建体转化为BL21（DE3）大肠杆菌，在补充了2 mM MGCL2的出色肉汤培养基中生长，在37°C下添加了0.1％W/V葡萄糖和50 µg ML -1碳苯霉素。培养在600 nm的光密度（OD）中以400μmIPTG诱导。诱导后，将细胞在30°C下生长4小时。将细菌细胞沉淀冻融并重悬于5 mL的重悬剂缓冲液中（200 mM Tris pH 8.0，500 mM蔗糖，0.5 mM EDTA，0.1 mg，0.1 mg溶菌酶，1 µL苯并酶核酸酶（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich））。在室温下搅拌30分钟后，加入两量的MILLIQ水以诱导周质的低音裂解，并在室温下进一步搅拌45分钟。将所得的裂解物补充有150 mM NaCl，然后在4°C下以30,000g离心25分钟。将上清液加载在蛋白A树脂（Genscript）上，用20 mM Tris pH 8.0，150 mm NaCl进行广泛洗涤，并用100 mM甘氨酸pH 3.0洗脱。用400 mM Tris pH 8.0，250 mm NaCl中和洗脱株。纯化的NB538在液氮中的小等分试样中闪烁，并存储在-80°C下直至进一步使用。 　　在20 mM HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，0.001％LMNG/CH中进行FSEC实验。将纯化的HIS标签纳米化合物（0.5 µm）与NINJ1（K45Q）在LMNG/CHS（SEC峰值2级分，1 µm）和His-Glow Reagent 25（1.1 µM）中孵育20分钟。20分钟后，将100 µL反应混合物注入4°C下的Biosep SEC-S3000 LC柱（Phenomenex，00H-2146-K0）。用在线JASCO FP2020以490 nm的激发波长和520 nm的发射波长测量His-Glow荧光。使用Cytiva Unicorn V7.0收集SEC数据。 　　使用Biacore S200仪器在20 mm HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，0.01％LMNG/CH中使用BIACORE S200仪器进行SPR实验。所有实验均在传感器芯片CM5（Cytiva，29104988）上使用抗HIS抗体（使用他的捕获试剂盒（Cytiva，28995056））共价固定在所有四个流动细胞上。结合在多周期动力学实验中进行。在每个循环中，芯片的流细胞1被用作无配体对照。将His标签的NB538固定在流动池2上，并将其标记的NBALFA（一种对非特异性结合的控制）固定在流动池3上，以在100 s稳定后获得约200-250个响应单元的结合响应。在每个循环中，通过在所有四个细胞上以LMNG/CH纯化的LMNG/CH纯化为30 µL min -1流速，60 s接触时间，在60 s接触时间，随后是360 s的360 s，在所有四个细胞上纯化了lmng/chs，在LMNG/CHS上纯化了lmng/chs的纯化，通过在LMNG/CH中纯化的2倍稀释系列（K45Q）（K45Q）（K45Q）或386 nm野生型ninj1进行分析物结合，然后进行分析。用抗HIS抗体固定的CM5芯片通过在循环之间注射10 mM甘氨酸-HCl（Cytiva，BR100354），从而再生。一式三份进行结合实验。在BIACORE S200评估软件上分析了所有数据，NB538与NINJ1结合的信号用缓冲液注入信号的信号进行了双重引用，并且在没有任何配体的情况下，分析物的信号在传感器上发出了信号（流动池1）。使用1：1拟合模型确定动力学参数。 　　将纯化的NINJ1（K45Q）峰2（最终3 µm）与纯化的NB538（最终15 µm）在4°C下持续1小时，并加载到SuperDex 200增加10/300 GL柱（GE Healthcare）。使用100 kDa MWCO浓度浓度到0.4 mg ml-1，将与NINJ1（K45Q）–NB538复合物相对应的分数（K45Q）–NB538复合物浓缩，并立即用于电网制备。在施用样品之前，使用Solarus等离子体清洁剂（Gatan）对孔金网格（Ultraufoil 25 nm R 1.2/1.3; Quantifoil，großlöbichau）进行光泽放电。将4 µl以0.4 mg ml -1的纯化样品吸入到网格上，然后使用玻璃体（Thermo Fisher Scientific）在4°C，100％的相对湿度，5个s blot力和3 s bblot时间的温度下使用液体乙烷中的斑点，并在液态乙烷中浸泡。 　　对于NINJ1（K45Q）和NINJ1（K45Q）–NB538，使用配备Falcon4i直接电子检测器，SelectRisx Energy Filter和Epu Automation Abotical（Thermo Fisher Scientific）的Titan Krios G2收集了电子显微镜数据。总共记录了4,576部电影（NINJ1（K45Q））和11,802部电影（NINJ1（K45Q）–NB538），以300 kV的操作电压为300 kV，165,000×标称放大倍率（校准的像素尺寸0.731Å），能量过滤量为0.731Å，量度为0.731Å，距离级别为0.731Å，距离级别为6 evs -0和9 evcus s and decus nounds and decus -ndancy and decus -ndancy -0。总电子通量约为40 e -Å2（扩展数据表1和扩展数据图2）。 　　CryoSparc用于所有图像处理26。对于NINJ1（K45Q）和NINJ1（K45Q）–NB538数据集，CryoSparc Live都用于电影运动校正，CTF估计和初始的Ab Intible Blob粒子拾取（扩展数据图4B，C）。对于3D重建，我们使用了2D类，显示出二聚体配置二聚体的2D类，这是由于可用性更多样化的视图。对于NINJ1（K45Q）–NB538数据集，在2D分类和第3D缩写和异质改进之后产生了完整复合物的低分辨率电子显微镜图，该低分辨率映射用于基于模板的采摘。2D和3D处理的附加顺序，包括重新平衡2D类以考虑一定程度的优选方向，导致了改进的3D映射，该图被用作选择模板和最终图像处理序列的初始3D模型。使用此模板，选择了1,568,603个颗粒，2D分类和3D异质细化确定了最终类别的102,877个颗粒。基于参考的运动校正后，非均匀的细化（包括全局倾斜/trefoil和每粒子Defocus CTF细化）产生了一个图，全局分辨率约为3.0Å，如傅立叶壳相关性临界值为0.143，在独立处理的半MAPS27之间衡量了0.143。局部分辨率从〜2.7到3.9Å不等（扩展数据图5）。使用Phenix Resolve Cryo-EM28，通过密度修饰进一步提高了MAP的可解释性。最终数据处理统计数据在（扩展数据表1）中报告。对于没有NB538的NINJ1（K45Q）数据集，使用了类似的数据处理方案（扩展数据图2）。首先，使用2D分类和从头算和异质的细化来对初始blob粒子拾取的颗粒进行分类，以产生低分辨率和各向异性3D MAP，然后将其用于基于模板的粒子拾取，识别2,163，识别2,163，，892个颗粒。随后的2D分类和3D Ab的概念和异质改进导致了最后一类319,331个颗粒，并使用DeepeMhancer29提高了MAP的可解释性。对于没有NB538的APO NINJ1（K45Q），最终地图是高度各向异性的，因此不用于模型构建。 　　使用UCSF Chimerax将缺乏互补性确定区域（CDR）的NINJ1和NB538的单独的Alphafold29模型安装在最终密度修饰的冷冻EM图中。使用Isolde30构建和完善了几乎完整的模型。该模型是使用Phenix V1.2131中的真实空间改进来完善的。Chimerax V.1.7.132和Pymol V.2.5.2（Schrödinger）用于结构可视化和图形制备。 　　将小鼠GFP11 – NINJ1，NBALFA – GFP1–10和NB538 – GFP1–10 cDNA合成并取亚克隆到PCDNA3.1/ZEO（+）（genscript）中。位点定向诱变在小鼠GFP11 – NINJ1上分别生成A42W，K45R，S46A和N119Q突变（Genscript）。将这些构建体瞬时转染到缺乏nINJ1的BALB/3T3细胞中，以及MCHERRY（Clontech，632523）作为转染细胞的标记。简而言之，将缺乏忍者的BALB/3T3细胞（每孔9,000）铺在8孔室载玻片上（Ibidi，80806）。允许细胞粘附一整夜，然后用100 ng MCHERRY，200 ng GFP11-NINJ1，200 ng的NBALFA – GFP1-10或NB538 – GFP1-10，0.5 µl lipofectamine ltx和0.25 µL ltx和0.25 µl ltx和0.25 µL Plus Deogent（Thermo Geogentic（Thermo Fisher Scientixic））。对于裂开的nINJ1二聚体二聚体突变体，用100 ng mCherry，200 ng gfp11 – ninj1或指示的GFP11 – NINJ1突变体瞬时转染细胞，nbalfa – gfp1-10或nb538 – gfp1-10 – nb538 – gfp1–10 – biro biore biore biore biore biore biore biore biore）转染后24小时，使用配备有63×/1.40 HC PL APO CS2油浸入物镜的Lei​​ca SP8激光扫描共聚焦显微镜在Opti-MEM中成像。在整个成像过程中，使用环境控制室和气体搅拌机（Okolab）将样品保持在37°C和5％CO2。图像是在斐济软件中处理的。使用斐济在转染细胞的质膜上定量平均平均GFP荧光。将荧光标准化为空载体控制。NINJ1二聚体分解突变体GFP11 – NINJ1（A42W）和GFP11 – NINJ1（K45R）的高表达导致NINJ1缺乏的BALB/3T3S中的细胞毒性。因此，为了定量分裂NINJ1二聚体二聚体突变体，使用MCHERRY的表达（使用斐济软件中的测量函数之间的平均强度在30-60个任意单位之间的平均强度）用于针对转染水平相似的细胞的阈值。 　　编码非标记小鼠NINJ1及其突变体的cDNA合成并亚克隆到PBCMV_BlasticIdin（Genscript）中。为了用NINJ1突变体定位的固定细胞成像，用100 ng mCherry，100 ng指定的NINJ1质粒和0.75 µL µL Transit-X2试剂转染NINJ1缺陷型BALB/3T3细胞。在室温下用4％多聚甲醛在PBS中用4％多聚甲醛固定10分钟，用0.05％的皂苷透化，并在阻断血清（PBS添加0.05％皂苷和10％正常驴血清（Jackson Immunoresearch））中孵育1小时。然后将细胞与抗小鼠NINJ1克隆80（针对N末端的细胞外结构域升高的兔IgG2b； Genentech，2 µg mL-1）在室温下抑制血清中稀释2小时。使用AF647抗兔次级（Thermo Fisher Scientific，A31573，Lot 2674379，1：500）检测到NINJ1抗体信号在室温下孵育1小时。用DAPI染色（Thermo Fisher Scientific，D1306，Lot 2462719，1 µg ML -1）。使用Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜获得了高分辨率图像，配备有63×/1.40 HC PL APO CS2油浸入物镜。 　　我们选择了基于结构的突变体如下。为了使面对面的二聚体破坏稳定，我们突变的氨基酸引入了笨重的侧链，以在二聚体界面引入空间冲突，而为了稳定二聚体，我们引入了互补的突变，而没有笨重的侧链。我们在氨基酸中引入了突变，这些突变不促进PDB：8SZA中观察到的活性态NINJ1细丝界面。对于HEK293T细胞中的瞬时表达，用编码非标记小鼠NINJ1的50 ng质粒转染了2×104细胞，或指示突变体具有0.16μl脂肪系2000（Thermo Fisher Scientific），Costar 96瑞尔96孔白色平板（Fisher Scientific）（Fisher Scientific）的Costar Costar 96孔。转染后16小时，通过CellTiter-Glo分析（Promega）测量细胞毒性。 　　转染时，将Yoyo-1染料（Thermo Fisher Scientific）以200 nm的最终浓度添加。每小时至少在绿色通道中扫描incucyte S3图像至少20小时，并以10倍的放大倍率。核ID红色DNA染色（Enzo Life Sciences）是在最后一个时间点后添加的，并在红色通道中进行了扫描。Incucyte S3 2019A软件用于确定Yoyo-1+细胞和核ID+细胞的总数（总细胞）。计算Yoyo-1+细胞的百分比为Yoyo-1+细胞的数量除以核ID+细胞的总数。每个独立的重复是在不同的一天进行的。任何给定的图形面板中的所有数据点均来自一个板，以排除板到板的变化。 　　除去了NB538的NINJ1（K45Q）的冷冻EM结构，以使用Maestro（Schrödinger）的2023-1释放来模拟。为了测量TM1运动，使用了从NINJ1（K45Q）的冷冻EM结构产生的四个模型。第一个模型包括在面对面二聚化的情况下进行两个左右忍者（K45Q）分子（总计4个NINJ1分子作为面对面二聚体的左右二聚体）。第二个模型是通过删除面对面二聚体（总计两个NINJ1分子作为左右二聚体）生成的。对于第三个模型，在面对面二聚体的存在下产生了五个假想的侧面到侧NINJ1（K45Q）分子（总计十个NINJ1分子作为面对面二聚体的左右五聚体）。第四个模型是通过删除面对面二聚体（总计五个NINJ1分子作为左右到一侧的多聚体）生成的。对于具有野生型NINJ1的模拟，将二聚体模型的Cryo-EM解析NINJ1（K45Q）二聚体中的所有四个GLN45残基突变回LYS45。对于所有模型，使用蛋白质制备向导模块分别用乙酰基和N-甲基酰胺基限制N和C末端。他的ASN，GLN，GLN侧链的质子化状态使用pH 7.4时的ProPKA33优化了其ASN，GLN侧链的构象截面。使用OPLS4力场34进行约束最小化，重原子融合到0.3Å的根平方偏差（R.M.S.D.）。最终将准备好的系统嵌入了基于OPM数据库的初始定向的预取平衡的POPC膜中，并用SPC水溶剂化并用0.15 M氯化钠离子中和。 　　使用Desmond Suite（Schrödinger）使用OPLS4力域35进行了分子动力学模拟。进行了三个独立的模拟，每个模拟都处于平衡阶段，然后进行1 µs生产。Schrödinger软件中的膜松弛协议用于平衡系统。 　　在模拟的生产阶段，每1,000 ps保存每一个轨迹的快照。将所有框架对齐到起始结构的跨膜螺旋后，分析了模拟帧。R.M.S.D.使用模拟事件分析分析距离，并用Pymol（Schrödinger）和Seaborn Python Package生成数字36。从随机初始速度（总计3×1μs=3μs）开始，所有分子动力学分析均进行三个独立的运行。R.M.S.D.用Seaborn Python包装生成图，其平均值和标准偏差是根据所有三个分子动力学重复计算得出的。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。