PFRCR复合物在入侵期间桥梁寄生虫和红细胞

　　PFRH5（残基E26 – Q256，具有C203Y（7g8 P. falciparum菌株）和T216A和T299A（去除潜在的N-链糖基化位点），BIP分泌序列和C-t端子C-c-c-c-c-c-c-c-cyl s2 expe s2 expe s2 expe s2 expe s2 expe s2 expe s2 expe s2 expe s2 expn 35无血清培养基（Sigma-Aldrich）。3-4天后，收集培养上清液并过滤0.45 µm，然后与Captureselect C-Tagxl树脂（Thermo Scientific）孵育。使用20–30列的Tris缓冲盐水（TBS）（25 mM Tris pH 7.5，150 mm NaCl）洗涤珠，并用C-TAG洗脱缓冲液（25 mM Tris pH 7.5，2 m MGCl2）洗脱粘结。使用S200增加10/300色谱柱通过HEPES缓冲盐水（HBS）（20 mM HEPES pH 7.5，150 mm NaCl）的运行缓冲液，通过凝胶过滤进一步纯化洗脱蛋白。PFRH5ΔN3也从稳定的S2细胞系表示，并被纯化为全长PFRH5，除了含有5％V/V甘油的HBs用作凝胶过滤的运行缓冲液。 　　PfCyRPA (residues D29–E362, with substitutions S147A, T324A and T340A (to remove potential N-linked glycosylation sites), a mammalian secretion sequence and a C-terminal C-tag) was transiently expressed using Expi293F cells with the Expi293 Expression System Kit (Thermo Fisher) as recommended by the manufacturer.收集培养上清液，并在TBS中稀释0.45 µm，稀释1：1，然后与捕获的C-TAGXL树脂一起孵育。然后进行纯化，如PFRH5。 　　PFRIPR（残基D21 – N1086，带有N103Q，N144Q，N228Q，N228Q，N303Q，N334Q，N334Q，N480Q，N498Q，N498Q，N506Q，N526Q，N526Q，N646Q，N647Q，N647Q，N964Q，N964Q，N964Q和NIP nip nip nipe niper Niper nipe n1021Q（均为N1021Q）序列和C末端C-TAG）从稳定的S2细胞系表示，如PFRH5。3–4天后，通过切向流量过滤，将培养上清液收集并过滤0.45 µm，然后将缓冲液交换为50 mm Tris pH 7.5和150 mM NaCl，并带有三个100 KDA Omega Cassetes（PALL Corporation）的堆栈。将交换的上清液加载到用TBS平衡的1 mL预包装的CapturesElect C-Tagxl柱（Thermo Scientific）。用30-50列的TBS洗涤后，用C-TAG洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。使用PD-10脱盐柱（Cytiva）将洗脱的蛋白质交换为HBS，然后通过凝胶过滤（对于PFRH5）进一步纯化，或直接用于PFRCR复合物制备。 　　PFRIPR尾巴（残基D717 – N1086，带有N964Q和N1021Q取代的残基（去除潜在的N连接糖基化位点），BIP分泌序列和C端AVI-C-TAG）也从稳定的S2细胞系中表示。Pfripr尾巴被纯化为全长PFRIPR，除了通过三个5 KDA欧米茄盒（Pall Corporation）的堆栈将过滤后的培养上清液交换为TBS。使用S200增加10/300色谱柱将洗脱蛋白通过凝胶过滤进一步纯化。 　　PFCSS-PFPTRAMP异二聚体是通过在具有分泌序列和C端His6-TAG的PFCSS（残基Q21 – K290和PFPTRAMP（残基C30 – T307）（使用分泌序列和C-T端子hiss6-TAG）中使用FreeSeys 293-FIREESER FIREESER FIREESER FREESTER FREESEREFERESEREFERESTER 29-FIRESEREFEREFEREFERESEFERESTER FREESERIDER FREESERY 29-FREFERENER（c30 – T307）获得PFCS-PFPTRAMP异二聚体。- 谷氨酰胺和1×MEM非必需氨基酸（Gibco）。转染后六天，收集培养上清液，过滤0.45 µm，然后与在HBS中平衡的超级Ni-NTA树脂（Generon）孵育。用20毫米咪唑补充的20列体积的HB洗涤后，用补充300 mM咪唑的HBS洗脱结合的蛋白，然后使用S200增加10/300列通过凝胶过滤进一步纯化HBS。 　　CY.003，CY.004，CY.007（参考文献5），R5.004和R5.011（参考文献4）在expi293f细胞中暂时表达。收集培养上清液，并在PBS中预校准（第79382号，Sigma-Aldrich）之前，将培养的上清液和0.45 µM过滤。用PBS洗涤色谱柱，并使用5 ml的0.1 M甘氨酸pH 2.5将结合的蛋白洗脱为1 ml的1 m Tris pH 8.0。洗脱的单克隆抗体（mAb）被交换为PBS。 　　为了制备Cy.003的Fab碎片，使用固定的木瓜蛋白酶（第20341号，Thermo Scientific）将mAb切割。裂解后，使用1 ml Hitrap Rprotein A分离出FC和FAB片段，预装后柱（Cytiva），并将包含CY.003 FAB的未结合分数交换为PBS。 　　为了表达全长的人basigin，将合成基因（Uniprot ID p35613-2）克隆到PfastBac中，使用C末端His6-TAG使用BAC-TO-BAC Baculovirus表达系统（Thermo Fisher）在SF9昆虫细胞中表达，以在SF9昆虫细胞中表达。DH10BAC细胞转化后，通过异丙醇沉淀分离Bacmids，并用于在无SF-900 II无血清培养基（Gibco）中以每ML 100万的细胞密度转染SF9细胞。将第一代杆状病毒（P1）放大以产生第二代杆状病毒（P2），然后用1％v/v在1％V/V中诱导全长basigin的表达，以每毫升为2.5-30万个细胞。48小时后，收集细胞，然后重悬于裂解缓冲液（25 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，10％甘油）中，并补充了完全无EDTA的无EDTA蛋白酶抑制剂（Roche）。使用Dounce均匀的均质器裂解细胞，然后在冰上进行超声处理（60％的振幅，3 s脉冲，9 s休息1.5分钟）。通过以3,000克离心20分钟来阐明裂解的匀浆，然后在4°C下以100,000克的速度进一步旋转45分钟以隔离膜。在裂解缓冲液中重悬后，将膜用1.2％的十二烷基-β-麦尔替剂（DDM）在4°C下溶解1小时。在4°C下以100,000g离心45分钟后，将与Ni-NTA树脂（Qiagen）在4°C下孵育1小时1小时，然后洗涤树脂（25 mm Tris pH 8.0，300 mm NACL，NACL，NACL，10％Glycerol，10％Glycerol，0.02％DDM和0.02％DDM和15 mmmmmimimididazoZ）。使用25 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl，10％甘油，0.02％DDM和400毫米咪唑洗脱结合的蛋白质，然后在S200上进一步纯化10/300柱中的10/300柱中，含有20 mM HEPES pH 7.2，150 mm NACL和0.02％DDM/02％DDM：CHOLESTERLECANT（CHOLESTERLER）：1.1 1.11 w/c.10.11 w/v。从100 mL的SF9细胞培养物获得了约100–200 µg的全长basigin。 　　如先前报道的3个。 　　为了制备PFRH5-PFCYRPA – PFRIPR – CY.003 FAB的复合物进行冷冻EM分析，将纯化的蛋白质在室温下以HBS在HBS中以等摩尔比一起孵育5分钟。制备了大约250 µg的复合物。孵育后，使用S200增加的10/300 GL柱将混合物进行凝胶过滤，在HBS中平衡。在6,000g和4°C下，用100 K Amicon Ultra离心单元将含有复合物的馏分浓缩。 　　用FEI Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher）在4°C和100％的湿度中制备冷冻EM网格；在0.2 mg ml-1处将3 µl复合物应用于Au-Flat 1.2/1.3网格（原始），该网格（原子能机）在15 mA时在15 mA上发光递送。孵育5 s后，将网格印迹1-4 s，然后浸入液态乙烷中。 　　使用在300 kV的FEI Titan Krios成像，并配备了Gatan Bioquantum Energy Filter（20 eV）和K3直接电子检测器。使用EPU（Thermo Fisher）中的快速获取模式自动数据收集。以标称×58,149的放大倍率获取图像，对应于每个像素的校准像素尺寸为0.832Å（每位超分辨率像素0.416Å），剂量速率为16.32电子Å-2电子-2 s-1，总暴露时间为40帧。这导致总剂量为48.97电子Å2。使用100 µM的物镜孔以0.25 µm的增量为-1.0至-3.0 µm的100 µM物镜孔获取图像。从背靠背会话中从三个网格收集数据，所有这些都以相同的样本制备。总共获得了13,524部电影（从1个网格中获得了7,428部电影，从2,720网格2和3,376的网格3中获取）。 　　电影经过运动校正和对比度传递函数参数，以简单的3.0（参考文献36）进行估计。每个会话的数据集分别进行预处理。首先使用先前的试点数据收集的模板和挑选的粒子（从网格1中挑选的1,202,046，从网格2和752,273）从Grid 3中挑选的模板（1,202,046），总共提取了2,555,876个粒子（盒子尺寸为416 Pixels），并分别为两位数，总共提取了2,555,876个粒子）。在排除二维类别较差的粒子中，所有三个课程的粒子被导出为CryoSparc v.3.3.2。在这里，颗粒需要进一步的二维分类和粒子清理，总共产生了961,077个颗粒。这些被用于从头开始重建为六个类别，这表明数据集包含三个主要物种：PFRCR – CY.003复合物，缺乏PFRH5（PFCYRPA – PFRIPR – CY.003）的复合物和一个大多数PFCYRPA和CY.003的复合体。 　　在进一步完善之前，使用Topaz37的冷冻PARPARC实现将显微照片重新质疑，总共产生了2,615,684个颗粒。这些受到二维分类的回合，以去除不良颗粒，然后与先前的简单采摘颗粒结合使用。去除重复项后，获得了1,686,994个独特颗粒的最终粒子堆栈。这些颗粒使用体积用于PFRCR – CY.003，Pfcyrpa – Pfripr – Cy.003和Pfcyrpa – Cy.003，以及三个诱饵量。这将颗粒分为pfrcr – cy.003（523,352个颗粒），pfcyrpa – pfripr – cy.003（527,499个颗粒），pfcyrpa – cy.003（413,374颗粒），诱导1（诱导1（107,015颗粒），诱饵2（97,538）（18,216个颗粒）。进一步的同质，然后PFRCR – CY.003和Pfcyrpa – Pfripr – cy.003颗粒的不均匀细化得出的PFRCR – CY.003和3.3Å的颗粒对于Pfcyrpa – Pfripr – cy.003的地图为3.2Å。使用默认设置38和CryoSparc中局部每颗粒对比度转移功能细化后，在Relion 3.1.3中进行贝叶斯抛光后，最终的不均匀细化得出的PFRCR – CY.003的共识图为3.0Å。使用三维FSC39和傅立叶壳占用率40分析的各向异性分析表明，共有的PFRCR – cy.003 MAP的球形性为0.91（参考39），其各向异性过渡区为2.7-3.5Å，pfcrpa – ppripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripripri – 003（39）具有2.7–3.8Å的各向异性过渡区40。 　　在这两个地图中，与pfcyrpa和Cy.003相对应的区域比其余的复合物更好地分辨出来，并且PFRIPR的解决方案更差。因此，PFRCR – CY.003和PfCyrpa – Pfripr – Cy.003的颗粒被击倒两倍，并通过三种正交主体模式在CryoSparc24中进行三维变异性分析。通过将二维变异性分析的输出作为包含20帧的体积序列导出，在Chimera41中可视化每个复合物的运动。这表明两个复合物均显示出一些连续的构象异质性，表现为PFRH5和PFRIPR的枢轴。这是对PFRCR – CY.003分析的第三个主要模式中最大的，该模式表明，PFRIPR的一部分在体积序列上尚未解决，而与PFCYRPA接触的部分则大多保持不变。 　　PFRH5和PFRIPR在PFRCR – CY.003中的密度通过局部改进提高了。PFRH5在PFRH5 – Pfcyrpa周围使用软面膜进行局部完善。在局部细化PFRIPR之前，使用三维可变性分析的异质细化和体积输出获得了更均匀的颗粒子集。减去该子集（253,444个颗粒），使其仅包含PFRIPR的信号，然后受到局部细化的影响，然后首先使用PFRIPR周围的软膜，然后在PFRIPR的子部分附近使用柔软的掩码，并由三维变异性分析中观察到的运动引导。这产生了PFRIPR的地图，报告的全局分辨率为3.3Å，球形39为0.76，各向异性转变区为2.8-3.9Å。PFRIPR在pfcyrpa – pfripr – cy.003中使用了相同的过程，但使用了完整的粒子堆栈（506,797个颗粒）。 　　一些二维类表明，PFRIPR在这些地图中没有解决。为了形象化这个额外的区域，使用PFRCR – CY.003体积低通滤波至30Å的颗粒（62,817）的子集（62,817）作为参考。这产生了一张图，显示了从PFRIPR核心中部突出的额外密度的一小部分，报告的全球分辨率为4.0Å。在该区域周围使用更宽的口罩的细化并没有导致更多的PFRIPR解决。 　　使用CryoSparc估算了未共享图的局部分辨率。PFRCR – CY.003和PFCYRPA – PFRIPR – CY.003的复合图是由Phenix42中的共识和局部改进图生成的。使用Deepemhancer43的默认参数对图进行后处理，以帮助建立模型。所有地图均在Chimerax44中呈现。 　　为了帮助PFRCR – CY.003复合物的模型构建，PFRH5的晶体结构（PDB ID：4U0Q，CHAIN C）3，PFCYRPA – CY.003 FAB COPPLECT（PDB ID：7PI2，链D – F）5和Alphafold2和Alphafold2（Alphafold2）（Alphafold2（Ref。28）（ref .28）（v.2.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.16），priped of pripdr（priped of pripriprip（将484–548）停靠在PFRCR – CY.003复合图中，作为使用Chimerax的启动模型。这些是在迭代周期中用coot和isolde45手动重建的。PFRH5的C末端尾巴是从头建造的。PFRIPR的区域（N末端，从域N2到EGF2的末端，EGFS 3和4）的分辨率较低，并且比复合映射的其余部分较低。PFRIPR的AlphaFold2预测用于指导在这些区域的建筑物以放置结构元素。为了构建Pfcyrpa – Pfripr – Cy.003复合物，Pfcyrpa – Cy.003 Fab Complex（PDB ID：7PI2，链D – F）5和PFRIPR的晶体结构来自PFRCR – CY.003结构是刚体的结构，是使用PFCYRPA – PFCRPA – PFCRIPR – CY.CY.003 COM.003 ASS Starter-angotion-angody sugient-nigrid-nigrid-boty。与pfripr – cy.003 MAP中对应于PFRIPR的区域的分辨率不及PFRCR – CY.003对应物，尤其是在PFRIPR的外围附近。因此，在对接后，PFRCR – CY.003的PFRIPR模型在很大程度上未经编辑，没有对某些地区进行任何更改（例如，N末端和残基周围661-667）。在每种情况下，都使用全局最小化和二级结构约束在苯金石中对其各自的复合图（尚未被后处理）进行完善。 　　The model of PfRCR–Cy.003 comprises PfRIPR residues 34–716 (except 124–137 and 479–557), PfCyRPA residues 33–358, PfRH5 residues 159–516 (except 242–303), Cy.003 light-chain residues 23–229 and Cy.003 heavy-chain residues 21–245 (except156–166）。pfcyrpa – pfripr – cy.003的模型包括PFRIPR残基34–716（124-137和479–558除外），PFCYRPA残基34–358（69-73，124-127，124-127，245-245-249 and 319–323），cy.003 and.cy.003 and.cy.003 and.cy.003 and.cy.003重链残基21–245（156–166除外）。 　　为了帮助PRO716以外的PFRIPR密度不连续的地图解释，生成了EGF5后截断的PFRIPR的Alphafold2模型（残基20–769）。将该预测扩展到PFRCR – CY.003地图中表明其余密度可能与EGF5相对应。此外，分别预测了PFRIPR（残基717–1,086，包括EGF5）的尾巴模型。将其手动扩展到第二个4.0ÅPFRCR– CY.003地图，显示PFRIPR尾巴的额外密度，以生成全长PFRIPR的复合模型。 　　为了鉴定PFRIPR结构域的结构同源物，通过DALI46分析了PFRIPR核心（残基34-716）和PFRIPR尾巴的Alphafold2预测的结构（残基717-1,086），通过DALI46分析，搜索针对PDB25数据库。 　　在100 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4的两个单独的100 pmol等分试样（0.2 mg ml -1时100μL）上进行化学交联。然后在10％DMSO和100 mM磷酸盐缓冲液pH 7.0中在室温下添加2 µL 5 mM DSSO（Thermo Fisher），并在室温下加入1小时，并用8 µl的5％（v/v）在水中用羟胺的5％（v/v）淬灭（Sigma-Aldrich）。接下来，在55°C下加入1μl100mM TCEP 1小时，并用1μL的380 mm碘乙酰胺（Thermo Fisher）在室温下在黑暗的室温下用1μl的380 mM碘乙酰胺（Thermo Fisher）将烷基烷基化30分钟。用测序级改良的胰蛋白酶（Promega）和测序级胰凝乳蛋白酶（Roche）以酶：1:25的1:25进行3小时进行顺序双消化，然后在100 mm磷酸盐缓冲液pH 7.4中在37°C下过夜。在纳米级液相色谱 - 质谱法（LC -MS）分析之前，用含有5％DMSO的水和0.1 vol％甲酸稀释消化。 　　使用reprosil-Pur C18-AQ捕获柱（20毫米长×100 µm内径，5 µm粒径，200Å孔径）和reprosil-Pur-Pur-Pur C18-AQ分析柱（30 cm长度×50 cm尺寸×50 c15 µm内部尺寸），对消化蛋白样品进行纳米级LC-MS分析47进行纳米级LC-MS分析47（20毫米×100 µm内径，5 µm粒径，200Å孔径）和内部包装。将10 µL样品加载到3 µl min -1溶剂A（水中0.1 vol％甲酸）的捕获柱上10分钟。然后将捕获柱与分析柱进行切换，并在125 nl min -1处施加的梯度从溶剂B的8％（乙腈+0.1 vol％甲酸）切换。在喷雾尖端电压为2.1 kV和200°C的加热毛细管温度下，将柱废水进行电喷雾电离。 　　在Orbitrap融合Lumos质谱仪（Thermo Fisher Scientific）中以数据依赖性采集模式运行的质谱。使用Orbitrap读数（M/Z扫描范围350–1,500 TH，质量分辨率为120,000的全宽度为半最大，自动增益控制（AGC）目标为100％）。碰撞引起的解离（CID）片段化光谱（使用30％CID能量）从带电的（2+至8+）前体离子获得，并在半最大的质量分辨率下以15,000的轨道读数为15,000的轨道读数，而离子损伤时间限制为600毫秒，限制为600 ms和100％的标准化AGC目标。MS3扫描是为了鉴定DSSO-CROSS连接二肽的肽伴侣，仅在识别31.9721 DA（±10 ppm）的质谱doublet的MS2扫描中，仅在伴侣强度范围为10-100％的MS2扫描中触发质谱双重差异的31.9721 DA（±10 ppm）质量差。在最大注射时间为600毫秒的最大注射时间，对200％的归一化AGC目标和MS3扫描的离子陷阱读数，对两个双双伴侣进行了CID碎片（使用35％CID能量）。 　　蛋白质组发现者2.5（Thermo Fisher Scientific）包含Xlinkx搜索节点来处理LC -MS数据并识别交联肽。搜索中包括动态修饰（蛋氨酸的氧化和天冬酰胺的脱氨酸）和半胱氨酸残基的静态氨基甲米甲基修饰。使用了Xlinkx搜索节点，DSSO定义为赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸残基上的可透明传感器交联49。此外，包括水解或胺化的DSSO，对这些残基的死末端动态修饰。MS1，MS2和MS3扫描的质量公差分别设置为10 ppm，50 ppm和0.5 DA。Xlinkx验证器的错误发现率阈值设置为1％。使用XINET50可视化确定的交联，以验证和辅助PFRCR – CY.003冷冻EM结构，使用Cα-Cα距离阈值为35Å（参考文献51），使用Chimerax映射和测量。 　　按建议，使用Alexa Fluor 488蛋白标记试剂盒（Thermo Fisher），将全长Basigin和Bsgecto用Alexa Fluor 488荧光标记。使用含有20 mM HEPES pH 7.2和150 mm NaCl的缓冲液在S75增加10/300列上通过凝胶过滤去除去过量染料，或者使用同样的缓冲液，同一缓冲液也包含0.02％DDM：胆汁含量的半糖酸盐（10：1 w/v ratio）（10：1 w/v ratio），用于完整长度的基碱。为了测量PFRH5和PFRCR与BSGecto的结合，在20 mM Tris pH 8.0，200 mm NaCl，1 mg Mg ml-1 salmon Sperm DNA和0.01％tween-20中制备了在20 mM Tris pH 8.0，200 mm NaCl中制备的两倍稀释系列PFRH5或PFRCR（浓度范围为8 µm至3.91 nm）。在整个稀释系列中，basigin ectodomain保持在0.25 µm的恒定状态。为了测量PFRH5和PFRCR与全长basigin的结合，在20 mM Tris pH 8.0，200 mm NaCl中，制备了类似的两倍稀释序列PFRH5和PFRCR（浓度范围为2 µm至0.12 nm），1 mg ml-1 ml-1 salmon Sperm DNA和0.02％DDN。全长basigin保持恒定浓度为0.1 µm。将样品孵育10分钟，然后以10,000克离心10分钟，然后将上清液转移到Monolith NT.114系列高级毛细血管（Nanotemper）。在整体NT.115上在25°C下进行实验。由于在数据收集过程中，观察到PFRH5和PFRCR测量的原始荧光显着变化（在超过2 µM）和Basigin Ectodobain（以上超过5 µm）中，因此在数据收集过程中观察到了显着变化，因此将这些浓度的数据排除在分析之外。对两个单独准备的样品进行一式三份进行结合实验。使用软件v.1.5.41（纳米机）分析数据。 　　使用标准的胺偶联方案将PFRIPR和PFRIPR尾巴固定在CM5系列S传感器芯片（Cytiva）的单独流动路径上，可为PFRIPR提供约8,000个响应单位，PFRIPR尾巴的响应单位约为2,000。在SPR缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，0.01％Tween-20）中制备PFCSS-PFPTRAMP异二聚体配合物，在8.0或7.7 µm中制备，然后在同一缓冲液中制备了双重连续稀释系列。在25°C的SPR缓冲液中，将SPR痕迹记录在T200 BIACORE仪器（Cytiva）上，流速为30 µl min -1和150或180 s。实验用四个独立稀释系列进行了四次，并使用T200 BIACORE评估软件（Cytiva）估算的结合亲和力进行了结合亲和力。 　　Rosetta二硫化52方案用于在PFRH5中设计半胱氨酸锁。野生型和热稳定的PFRH5晶体结构（PBD ID：6RCO4和5MI0（参考文献53））都用于设计模拟。引入半胱氨酸锁后，使用Rosetta Fastrelax54方案将设计的模型放松。手动检查了基于“ Total_score”和“ DSLF_FA13’55”的最高得分模型，并选择了连接PFRH5的N-和C末端半半半胱氨酸锁设计的五种二硫键半胱氨酸锁设计。源数据中提供了用于模型设计的Rosetta二硫化和Rosetta Fastrelax脚本。The selected disulfide locks (CC1, CC2, CC3, CC4 or CC5) were introduced into PfRH5ΔNL (a recombinant construct of PfRH5 lacking its N terminus and the α2–α3 internal loop, with the substitution C203Y (of the 7G8 P. falciparum strain))3, then wild-type PfRH5ΔNL and the cysteine-locked设计是从稳定的S2细胞系表示的，如上所述，对于全长PFRH5。3-4天后收获培养上清液，过滤0.45 µm，并与Captureselect C-Tagxl树脂（Thermo Scientific）孵育。使用10列的PBS或TBS（25 mM Tris pH 7.5，150 mm NaCl）洗涤珠，并用五柱体积的C-TAG洗脱缓冲液（25 mM Tris pH 7.4，2 M MGCL2）洗脱的结合蛋白。使用S75增加10/300色谱柱的尺寸排除色谱进一步纯化洗脱蛋白，并使用PBS或TBS的运行缓冲液（25 mm Tris pH 7.5，150 mm NaCl）。在半胱氨酸锁设计CC1 – CC5的生物物理表征之后，通过半胱氨酸锁CC1和CC5的组合生成了PFRH5（PFRH5CL）的最终半胱氨酸锁版本。这些被引入到PFRH5ΔNL中，然后表示并纯化，如其他单半胱氨酸锁版本。 　　野生型PFRH5ΔNL和单层锁定设计（CC1 – CC5）的圆形二色性光谱在PBS缓冲液中以50μgml-1的速度记录在200-250 nm波长中，温度斜坡的循环突发仪的增量从20°C从20到90°C增加。将PFFRH5ΔNL和双层锁的PFRH5ΔNLCL与Zeba自旋脱盐柱交换为10 mM磷酸钠pH 7.5和50毫米NAF，然后以75μgml-1和190-250 nm的速度记录在75μgml-1和190-250 nm的情况下记录的圆形二色光谱。JASCO J-815光谱极仪用于所有测量。使用GraphPad Prism v.8.4.3进行数据分析。 　　使用0.5 mL 7 K MWCO Zeba Zeba Spin DeSalting柱（Thermo Scientific，CatalogNo。89882），使用0.5 ml 7 k MWCO Zeba Spin DeSalting柱（30分钟），将PFRH5ΔNLCL（10μg）缓冲液（10μg）换成软化缓冲液（6 M盐烷盐酸盐，乙酸钠pH 5.5）100 mM。EZ-link MaleImide-PEG2-Biotin库存（Thermo Scientific，CatalogNo。21901BID）在DMSO中以15 mg ml-1制备，并在使用前用100 mM乙酸钠pH 5.5稀释至3 mg ml-1。变性PFRH5ΔNLCL在室温下用150×摩尔过量的mearimide-peg2-生物素标记1小时。通过使用0.5 ml 7 K MWCO Zeba旋转脱盐柱将缓冲液交换到变性缓冲液中，从而去除过量的MaleImide-Peg2-生物素。在变性步骤期间，在有或不添加5 mM TCEP（Thermo Scientific，第77720号目录）的情况下进行上述步骤。然后通过使用质谱法进行完整的质量分析来评估马来酰亚胺 - 二酰基 - 生物素标记的程度。 　　使用Agilent 1100高性能液相色谱系统（Agilent Technologies），在质谱前在线进行反向相反的色谱法。在0.1％甲酸中将浓缩蛋白样品稀释至0.02 mg ml-1，并将50 µl注入2.1×12.5 mm2 Zorbax 5 µm 300SB-C3防护柱中，该柱固定在40°C的柱oven中。使用的溶剂系统由超高纯净水（Millipore）（溶剂A）（溶剂A）和甲醇中0.1％甲醇（LC-MS级，Chromasolve）（溶剂B）组成0.1％甲酸。进行色谱如下：初始条件为90％A和10％B，流速为1.0 mL min -1。在10％B处15 s后，将在45 s的两阶段线性梯度从10％到80％B施加，然后在3 s上从80％到95％b。然后洗脱在95％b的下进行72 s，然后在初始条件下进行平衡，再进行45 s。使用1969年的MSD-TOF电喷雾离子正交质谱仪（Agilent Technologies）确定蛋白质完整质量。该仪器配置了标准电喷雾电离源，并在正离子模式下运行。离子源用毛细管电压4,000 V，雾化器压力为60磅 /平方英寸量规，干燥气体350°C和干燥气体流速12升升压12升1 min -1。仪器离子视频电压如下：Fragmentor 250 V，Skimmer 60 V和章鱼RF 250V。 　　为了在红细胞表面的上下文中可视化PFRCR，使用晶体和冷冻EM衍生的结构（在本研究中确定或先前发表），使用基于结构的比对将pFRCR扩展到膜结合的basigin上。为此，首先将PFRIPR的模型（源自Cryo-EM和AlphaFold2对PFRIPR尾部确定的PFRIPR核心的模型，如上所述，彼此之间彼此之间的预测）首先对齐PFRCR-CY.003复杂的Cryo-Em结构，以生成PFRCR的全长模型。接下来，将与BSGecto结合的PFRH5的晶体结构（PDB ID：4U0Q）3排列到PFRCR的PFRH5分量上。然后将此basigin – Pfrcr – cy.003复合模型对齐在MCT1结合的Basigin（PDB ID：7CKR）33或PMCA结合的Basigin（PDB ID：6A69）34上使用Basigin的D2域作为目标。要评估在PFRCR复合物的这种红细胞结合的上下文中中和中和的位置，Pfcyrpa结合Cy.004的晶体结构（PDB ID：7PHW）5，CY.007，CY.007（PDB ID：7phv）5，8a7（PDB ID，PDB ID，PDB ID：5tih）19和c12 and c12（pdih）19和c12（pdih）19岁（pdih）id iD：PFRCR复合物使用PFCYRPA作为目标。结构比对在Coot或Chimerax中进行。 　　将红细胞（O+或O-）洗涤在包含1％W/V牛血清白蛋白（PBS/BSA）的PBS中两次洗涤，然后制备了50 µL等分试样，含有约1000万个细胞。通过在PBS/BSA中混合等摩尔量的PFRH5ΔN3，PFCYRPA和PFRIPR来制备PFRCR，然后在室温下孵育30分钟。如果正在测定抗PFRH5或抗Pfcyrpa单克隆抗体的阻塞活性，则在此孵育期间将其包括在两倍摩尔过量的情况下。此后，将红细胞的等分试样以1,000克离心1分钟，去除上清液，并将细胞与制备的蛋白质复合物重悬于，并在室温下在滚筒上在室温下孵育1小时。在此孵育期之后，像以前一样通过旋转来回收红细胞，然后在PBS/BSA中洗涤两次。为了量化PFRCR与红细胞的结合，样品以下面详细说明的两种方式之一进行染色，然后用PBS/BSA洗涤3次，然后稀释至每毫升约600万个细胞，然后用S3E细胞分析器用Prosort Software V.1.6.0.12（Bio-rad）进行分析。对于每个样品，在50 µL的体积中进行结合，并记录50,000个事件。使用FlowJo V.10.9（Becton Dickinson）分析数据。通过绘制向前散射区域的侧丝区域，通过绘制单元来绘制前散布区域来绘制前散布区域对抗前散散位高度来确定红细胞。通过绘制针对Alexa Fluor 488区域的前筛面积，鉴定出与具有绑定PFRCR的人相对应的正面标记的红细胞，其正面位置由未固定的红细胞引导，并仅被检测抗体/纳米生物培养的阳性孵化（补充图2）。阳性细胞的数量表示为记录的单元数量的百分比。使用GraphPad Prism v.9.2.0进行统计分析。 　　To verify that the non-neutralizing anti-PfRH5 antibody R5.011 (ref. 4) could be used to quantify PfRCR binding to erythrocytes without reducing PfRCR binding, we first studied PfRCR that had been labelled using the CaptureSelect Alexa Fluor 488 Anti-C-tag Conjugate (no. 7213252100, Thermo Scientific).在单独或仅在4 µM抗PFRH5抗体R5.004或R5.011（参考文献4）的情况下，将红细胞与2 µM PFRCR孵育后，将细胞用捕获的Alexa Fluor 488抗C-Tag cage孵育，并在室温下在室温下为1 H。然后按上述量化红细胞结合，以重复的方式测量。 　　为了测定抗PFCYRPA抗体阻断PFRCR与红细胞结合的能力，它们单独与400 nm PFRCR或在存在800 nm抗Pfcyrpa抗体Cy.003，Cy.004，Cy.004或Cy.007（参考文献5）中孵育。抗PFRH5抗体R5.004阻断了与Basigin4结合的PFRH5，被用作阳性对照。与蛋白质复合物孵育后，用单克隆抗PFRH5抗体R5.011作为主要抗体洗涤红细胞并染色，然后洗涤一次，然后与山羊抗人类IgG交叉吸附的Alexa Fluor 488二级抗体（No No nocent）孵育。在室温下，在室温下以10 µg ml -1的pbs/bsa为10 µg ml -1，在黑暗中使用原发抗体和二抗体。然后按以上定量红细胞结合，一式三份测量。由于Cy.004以钙依赖性方式与Pfcyrpa结合5，因此在蛋白质与该抗体孵育过程中补充了1 mM CaCl2的细胞。作为对照，仅在存在和不存在1 mM CaCl2的情况下，单独将PFRCR与红细胞一起孵育，观察到的阳性细胞数量没有显着变化。 　　Red blood cells (100 µl) were washed twice by dilution in 10 ml of PBS followed by spinning at 500g for 5 min, then diluted to approximately 4 million cells per ml in PBS. Next, 200 µl of diluted cells was aliquoted into wells of a 96-well plate then spun once more at 500g for 5 min and the supernatant discarded. Cells were then resuspended in either 200 µl of PBS containing 2 µM PfRH5, 2 µM PfCyRPA, 2 µM PfRIPR and 2 µM PfRCR or 2 µM alpha-haemolysin (Sigma) for 24 h at 37 °C. In addition, PBS containing 1% v/v Triton X-100 or PBS alone was used as positive and negative control, respectively. Following incubation, cells were spun at 500g for 5 min then 50 µl of each solution transferred to a new 96-well plate. Absorbance at 405 nm was used to assess the degree of haemolysis using a microplate reader (Tecan). For each protein sample group, background signal observed with PBS alone was subtracted then haemolysis reported relative to complete cell lysis, as in the positive control (1% Triton X-100). Data were collected four times independently for all samples except for PfRIPR, which was collected in duplicate. Statistical analyses were performed using GraphPad Prism v.9.2.0. 　　红细胞（O+）通过在RPMI中与6 µm Fluo-4am孵育（补充0.5％w/v/V blesubax（Gibco）和4 g l-1葡萄糖），在37°C下加载Fluo-4。在清洗和休息这些氟-4负载的红细胞15分钟后，将重组蛋白（PFRH5，PFRH5ΔN或PFRCR）添加到2 µm的RPMI中，然后在RPMI中以2 µm的荧光（激发488 nm，发射535 nm）在800米的384-well plare plop plpmi中（激发488 nm），384-well plare，384-well plare，384-well plare plare plaster，384-well plare plaster，384-well plare plare plaster plaster loper plastrar plastrar plaster plaster plaster。软件v.5.6.0 R2（BMG LabTech）。仅RPMI被用作阴性对照。测量以技术三份记录。为了验证Fluo-4在红细胞中的负载，通过在rpmi中添加0.1％V/V Triton X-100诱导裂解，并按照上述测量荧光。未处理的红细胞用作对照。 　　根据先前确定的方法，在3％血细胞比容的人类红细胞（英国NHS血液和移植）中，在人类红细胞（英国NHS血液和移植）中培养血液阶段的恶性疟原虫。这项研究中使用的所有寄生虫均源自在菌株3D7中产生的恶性疟原虫线P230pdicre（参考文献44）。通过使用Percoll梯度纯化Schizont阶段，促进再染色，然后对新形成的环阶段进行山梨糖醇处理，从而同步寄生虫。 　　如先前所述57进行转染。通过限制稀释，将转基因寄生虫进一步克隆。为了诱导易剂，将Floxed DNA的CRE介导的切除术，将早期环寄生虫用10 nm雷帕霉素或DMSO处理为对照。雷帕霉素治疗后，收集了用于PCR和免疫印迹分析的寄生虫样品。 　　CRISPR – CAS9指南RNA序列针对5'区域（指南1：5'GCTATATAAACATATTTACG-3''和GUIDE 2：5'TTTTTTTTTTTTTTTGATTTACTATATATGTAC-3'）或PFRH5的3'区域或PFRH5的3'区域（使用5'-TTGTCATTCATTTCATTCATTTCATTCATTTCATTCATTTCATTCATTGTGTGTGTGTGTAAG-3）（http://grna.ctegd.uga.edu/）。将每个指南克隆到Vector PDC2-CAS9-HDHFRYFCU57中，生成质粒PDC2-CAS9-5'GUIDE1，PDC2-CAS9-5'GUIDE2和PDC2-CAS9-3'GUIDE。补充表1和2中列出了用于生成DNA修复质粒以及模板和预期PCR产品量的所有引物以及模板和预期的PCR产品量。 　　DNA修复模板设计用于用合成的Sera2 LOXP内含子（LoxPint）27代替内源性PFRH5内含子27，与300-350-碱基PAIR同源性区域合成，跨越PFRH5 5'5'未翻译区域（UTR）（UTR）和编码区域，并在内源性内含子内部的任一侧进行编码区域。Homology region 1 (amplified with primers 1 and 2) started at 5'-GGTAAATGTAGGATTGTTCT-3' and ended at 5'-ATAATGGTCAAAATTAATTT-3', and homology region 2 (amplified with primers 3 and 4) spanned 5'-GATTAAGTTTTGAAAATGCA-3' to 5'-ATCCACATTTTTATAGTCTT-3'.同源臂和中间的Sera2 Loxpint模块（用底漆5/6放大）使用重叠的延伸PCR（使用引物1和6，然后是引物1和4）一起缝合在一起。将最终的PCR产物插入PGEM-T Easy（Promega）中，使用NCOI/SPEI线性化，并与质粒PDC2-CAS9-5'GUDE1和PDC2-CAS9-5'GUADE2混合，然后转染前生成PFRH5NT。 　　用于插入LOXP序列的DNA修复模板以及一半的SERA2内含子（5'-ataActtcgtataGcataGcatAcatAtAcataTataCgaAgtatatAtatatAtatatAtatatAtatatAtatatAtatatAtatatAtatatAtatatAttTattTattAttTattTattTattTagTag（LOXP序列下划线）直接与Pfrh5 progiens sassirative ys Spriaige and Base insspried sypraPFRH5 C-Term CAS9切地点的两侧的编码和3'UTR区域。同源性区域1（用底漆10和11放大）始于5'-gaattgaatatacaaaaa，并以5'-gtaagtggtggttttttttttttttt结束。同源性区域2（用底漆12和13放大）始于5'-aatgacaaaaacatggtatgt，并以5'-caagtacgagcatccggaac结束。用引物14和6放大Loxpint模块的一部分。随后使用重叠的延长PCR融合了所有三个PCR产物，然后使用引物为10和6，然后使用10和6。将最终的PCR产物插入PGEM-T Easy（promega），从而生成质粒PPFRH5_C-TERM_LOXP。最后，该质粒用ECORI线性化，与PDC2-Cas9-3'Guide混合并转染到PFRH5NT中，生成PFRH5CKO线。 　　为了生成包含诱导突变体PFRH5基因的寄生虫线，PFRH5的第二副本被设计为将3'集成到floxed的内源性PFRH5副本中。雷帕霉素诱导的floxed内源性基因座切除后，将表达下游RH5副本。为此，合成了一个重新串通的PFRH5序列（Geneart）从内源内含子开始3'。然后将重现的序列侧翼，由5'同源区域（跨越了上源性PFRH5序列的最后546个碱基对，上面描述的Loxpint模块的一半）和一个3'同源区域，跨越了PFRH5 3'Utr的595个基本底座。通过重叠的扩展PCR（使用引物21和22、10和23，然后是21和23）合成了5'同源区域，并使用sacii/aflii（同源区1启动于5'-ctttcatgttacaataaaa和5'-gtttttttttttttttttcattacaataaaa and of sacii/aflii（同源区域1）插入基因心生成的质粒。3'同源区域还通过重叠的延伸PCR（使用引物13、18、19和20，其次是18和20）组装，从5'-AatgacaaaaaCatggTatgt开始，并在5'-tgatataaaatgaagcgttga结束。最终的PCR产物通过MFEI/SALI插入质粒中，生成最终质粒PPFRH5_WT_SEC_COPY。最后，使用NCOI/NOTI将质粒与PDC2-CAS9-3'GUIDE混合，并转染到转基因PFRH5NT寄生虫线中，生成PFRH5WT。 　　为了生成一条在雷帕霉素诱导的内源性floxed pfrh5基因切除上表达锁定状态PFRH5突变体的寄生虫线，质粒ppfrh5_wt_sec_copy被修改以引入以下突变：L164C，e239c，e239c，m478c和h4478c和h4489c。使用PPFRH5_WT_SEC_COPY作为模板，通过重叠的扩展PCR（使用引物25和26、27和29）与引物（使用引物25和26、27和29）一起引入突变L164C和E239C。最终的PCR产物使用aflii/ndei将最终的PCR产品克隆到质粒ppfrh5_wt_sec_copy中，得出质粒ppfrh5_lockingcyst_sec_copy_a。同样，PCR扩增也引入了突变M478C和H489C（使用引物30和31、32和33，然后是30和33），然后使用BamHi/Mfei限制性元素将此DNA片段置于质粒PPFRH5_LOCKINGCYST_SEC_COPY_A，ppfrh5_lockingcyst_sec_copy_b。使用NCOI/NOTI消化该质粒，与PDC2-CAS9-3'GUIDE混合并转染到转基因PFRH5NT寄生虫线中，生成PFRH5CL线。 　　通过Sanger测序验证了所有质粒DNA序列。用于基因型转基因寄生虫的诊断引物的位置在扩展数据中显示了图6a，b。补充表1和2中列出了诊断引物序列以及预期的PCR产品量。使用引物36和37的阳性PCR反应在每组诊断PCR中也包括了从PFRON2基因座扩增737个基本对的产品。 　　Qiagen Dneasy血液和组织试剂盒用于所有基因组DNA提取物。在以下条件下，使用GoTaq绿色（Promega）进行所有诊断PCR分析：在95°C下5分钟，在95°C下为30 s的33个循环，在55°C下30 s，然后在30 s kb -1和64°C下1分钟。为了扩增构造合成的片段，使用了cloneamp hifi聚合酶（takara）。典型的反应在98°C下以32个循环为5 s，在55°C下为15 s，在68°C下进行10 s kb -1。 　　通过Percoll梯度离心收集同步的分数，在RPMI-1640中洗涤，不含相册，并在含有100 mM dithiothreitol的SDS样品缓冲液中裂解，然后在预制BIS-BIS-TRIS聚丙烯酰胺凝胶（MPAGE，MERCK）和NITROCELLOSELOSEROMBROCELLOCELLULCLONES上进行蛋白质分离，并通过蛋白质分离。在5％牛奶中，在PBS中以0.2％的Tween-20-20，将印迹阻塞过夜，然后与大鼠抗PFHSP70（1：1,000）58或兔抗PFRH5（1：5,000）59孵育，然后是山羊抗RAT抗鼠骑马骑马过氧化物酶（HRP，Sigma）或Goat Anti-rad-rad（Bio-rad）。使用增强化学发光的检测使用固定的西方化学发光HRP底物（Millipore）进行检测。 　　为了确定突变寄生虫相对于野生型寄生虫的生长速率，将环阶段的DMSO和雷帕霉素处理的培养物调整为大约0.8％和2％血细胞比容的寄生虫血症，并在37°C的气体室内生长。当寄生虫达到同一周期的骨科阶段（周期为0）时，再一次寄生虫血症，然后在第1周期的Schizont阶段进行40小时左右，在寄生虫处的寄生虫。在用4％多聚甲醛和0.1％glutararaldehyde（sigma）固定在pbs的1％的室内，在p blutaraldeyde（sigma in 7％）中测量了寄生虫血症。与Sybr Green I（生活技术）。 　　对于流式细胞仪分析，使用BD FACSDIVA软件v.9.0的LSR Fortessa X-20与530/30滤波器一起使用，计算每个样本的30,000个单元事件。红细胞的门控是通过向前散射区域的侧刻面积的图（门P1）实现的。双线歧视需要对前散布区域的前散散射宽度（门p2）进行门控，然后在侧刻区域与侧is宽度宽度（门p3）进行侧丝corter区域。使用SYBR绿色染色的未感染的红细胞样品作为阴性对照。使用530/30标准滤波器（Gate P4），通过绘制侧丝cor 488区域（Gate P4）来绘制侧筛面积来实现SYBR绿色感染的红细胞的门控。寄生虫血症由门P4中鉴定为门P3中的细胞的数量确定（补充图3）。使用FlowJo V.10分析数据。GraphPad Prism v.9.0.0用于统计分析（两尾，未配对的t检验）和图生成。 　　对于钙通量测定，首先将红细胞与5μMFluo-4am（Invitrogen）在含有2.5 mM CaCl2和5 mM Na-丙酮酸的IMDM培养基中孵育1小时。随后将细胞洗涤3次，然后在37°C下休息30分钟。将纯化的精神分裂症添加到10–15％寄生虫血症和3％血细胞比容培养的标记性红细胞中，然后在同一培养基中稀释至0.3％血细胞比容。将培养物加载到聚赖氨酸涂层的μ-slide VI 0.4（IBIDI）载玻片中，并转移到尼康Ti e倒置的微镜室中，预热至37°C。使用×60的石油浸泡物镜和Orca Flash 4.0 CMOS摄像头（Hamamatsu）成像样品，每秒以一帧的速度成像。使用NIS高级研究软件包获取和处理视频。使用来自三种生物学重复的寄生虫，总共记录了PFRH5WT和PFRH5CL寄生虫的41起入侵事件。所有统计分析均使用Prism v.9.0进行。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。