下降网络将命令信号转换为人口电动机控制

　　所有实验均对在25°C下升高的雌性D. melanogaster进行，并在12小时的光线周期内进行50％的湿度。在光遗传学实验（前22-26小时）的前一天，我们将实验和对照61蝇转移到包含20μl所有透视（ATR）溶液覆盖的食物（100％乙醇中的100 mM ATR； Sigma Aldrich R2500，Merck）中，并包裹在铝箔中。 　　我们在DFD-LEXA驱动程序（J. Simpson63的礼物）的控制下产生了表达Lexaop-opgcamp6s（来自O. akin62的礼物）的转基因苍蝇，并拥有UAS-CSCHRIMSON的副本（Bloomington ID 55135）（补充表1，ID 1，ID 1）。我们还产生了还具有Lexaop-tdtomato transgene（Bloomington ID 77139）（补充表1，ID 2）的苍蝇。对于大多数实验，我们使用没有TDTOMATO表达的果蝇。 　　MDN-SPGAL4 FLIE（也称为参考文献2中的MDN3）用于向后行走。使用ADN2-SPGAL4 FLIE（也称为参考文献4的ADN2-SPGAL4-2）用于驱动触角修饰。DNP09-SPGAL4 FLIE（参考文献3）用于向前行走。它们的基因型为2,3,4,14,15,22,64在补充表2的顶部。 　　对于图1和图2中的所有实验。2和4，我们越过Spgal4苍蝇或野生型蝇（Phinney Ridge Flies，Dickinson Laboratory）与我们稳定的转基因驱动器线之一（补充表1，ID 1或ID 2）。对于图2，果蝇是在进取后2-9天，并在Zeitgeber时间7-13（ZT7-13）进行实验。对于图4，果蝇后2-9天，在ZT4-7进行实验。对于图5，扩展数据图。5、6和10，我们与20xUAS-CSCHRIMSON.MVENUS（ATTP40）苍蝇（Bloomington ID 55135）越过SPGAL4线。通过将野生型蝇（Phinney Ridge Flies或Canton S）越过20xUAS-CSCHRIMSON.MVENUS（ATTP40）进行对照实验。补充表2中列出了拆分线和源库存的确切基因型。所有实验均在ZT4-7时4-8天进行苍蝇进行。 　　我们基于麦凯布实验室（EPFL）产生的苍蝇（补充表1，IDS 3和4），以稳定的DFD驱动的DFD驱动的表达或核定靶向的麦克里（IDS 3和4）产生了果蝇。对于针对COMDN的三个SPGAL4驱动线（MDN，DNP09和ADN2），我们生成了表达CSCHRIMSON的稳定线（补充表1，IDS 5、6和7）。我们越过表达红色荧光蛋白变体的苍蝇，在SPGAL4驱动线中表达cschrimson的蝇，使用共聚焦显微镜可视化表达模式（扩展数据图1）。 　　我们利用遗传光学交叉方法从GNG DNS中有选择地记录。我们之所以选择从GNG DNS记录，是因为我们发现脑连接组中所有DN – DN突触中有73％在GNG中。此外，GNG容纳所有DNS的60％，而所有DN的85％都在GNG14中均具有轴突输出。但是，HOX基因DFD并未包含所有GNG DNS的全部：它排除了由HOX基因性梳子驱动的那些DNS（SCR）65。Sterne等人15估计，GNG中的550个细胞为DFD阳性，1,100个SCR阳性，只有很小的分数表达两者。例如，我们显示的是，ADN2虽然本地化为GNG，但DFD为阴性，因此很可能SCR阳性（扩展数据图1C）。在我们的研究中，证明使用SCR驱动线对DNS进行功能成像被证明很困难，因为SCR表达延伸到颈部和前VNC63。具体而言，我们观察到GCAMP在胸部宫颈结缔组织周围组织中的强烈表达（可能是拟晶解纤维的66），因此很难记录DN轴突的活性。我们预计Comdns也将招募一些SCR阳性DNS。因此，我们可能会低估招募的GNG DNS的数量。 　　除了降序神经元外，我们的ADN2-SPGAL4驱动线（ADN2-GAL4.2（参考文献4））还包含另外两组神经元。一对在大脑的前表面，基于我们的控制实验，可能不会或仅是由于颈部的靶向光刺激而被弱激活（而根本不是被胸腔刺激激活）。另一个是前VNC中的一组神经元。由于其他靶向具有更多不同脱靶神经元ADN2神经元的驱动线与我们的ADN2驱动器具有相同的行为表型，因此我们相信我们观察到的效果是由于刺激ADN2神经元所致。 　　不同的研究报道了可变的行为表型，用于刺激DNP09-SPGAL4驱动线：一些锯向前行走3，而其他人则观察到停止或冷冻18,67。我们观察到这两者：在我们的标准21μW光遗传刺激能力上，杂合动物大多向前行走。有时，苍蝇只会瞬时向前行走，然后停下来，或者在步行和停止之间进行节奏交替。Cschrimson的表达水平较高（即DNP09-SPGAL4> UAS-CSCHRIMSON纯合动物），我们大部分观察到冻结。我们使用杂合动物进行研究。 　　如参考文献中所述，我们在雌性苍蝇后3到6天解剖了大脑和VNC。68。 　　对于扩展数据中的样品图1A，C，我们将蝇固定在4％多聚甲醛（PFA； 441244-1KG，Sigma Aldrich，Merck）中（Gibco PBS，pH 7.4，10010-015，Thermo Fisher Scientific）。然后，我们用室温在PBS（以下称为1％PBST）中，将它们用1％Triton（Triton X-100，X100-100ML，Sigma Aldrich）用1％Triton（Triton X-100，X100-100ML，Sigma Aldrich）洗涤六次。然后，我们将它们转移到1％PBST，5％天然山羊血清的溶液中（受控供体牛群的山羊血清，G6767-100ML，Sigma Aldrich，Merck）和初级抗体（请参阅补充表3），并在4°C下隔夜隔夜。然后，我们在室温下用1％PBST洗涤样品六次，持续10分钟。我们将它们转移到1％PBST，5％天然山羊血清和二级抗体的溶液中（请参阅补充表3），并在室温下将它们保留2小时。然后，我们在室温下用1％PBST洗涤样品六次，持续10分钟。我们使用Slowfade（Slowfade Gold Antifade Mountant，S36936，Thermo Fisher Scientific）将样品安装在载玻片上，并施加了盖玻片。为了铺上滑梯和盖玻片，我们在每个边缘放置了两层双面胶带的小正方形。我们用指甲油密封了盖玻片的边缘。 　　对于扩展数据中的样品图1B，我们将PBS中的4％PFA固定在4％的PFA中，并将其转移至1％PBST，并在4°C下将它们放置过夜。然后，我们在室温下用1％PBST洗涤样品3次，持续15分钟。我们将它们转移到1％PBST，5％天然山羊血清和原代抗体的溶液中（请参阅补充表3），并在4°C下将它们放置过夜。然后，我们在室温下用1％PBST洗涤样品3次，持续15分钟。我们将它们转移到1％PBST，5％天然山羊血清和二级抗体的溶液中（请参阅补充表3），并在4°C下将它们放置过夜。然后，我们在室温下用1％PBST洗涤样品3次，持续15分钟。我们使用Slowfade将样品安装在载玻片上，并施加了盖玻片。为了铺上滑梯和盖玻片，我们在每个边缘都应用了两层双面胶带的小正方形。我们用指甲油密封了盖玻片的边缘。 　　我们使用Leica SP8点扫描共焦显微镜对样品进行了成像：×20，0.75 Na Hc pl apo Dry物镜，2×图像平均，1,024×1,024像素，0.52×0.52×0.52-μm像素尺寸，0.5-μmz-step Intevel;绿色通道488 nm激发，50–540 nm发射带通;红色通道（分别成像以避免交叉污染）552 nm激发，570–610 nm发射带通；和红外通道（NC82，与绿色通道并行成像）638 nm激发，650–700 nm发射带通。我们将沿Z轴堆叠的共聚焦图像汇总，并使用FIJI69旋转并翻译图像以将大脑/VNC置于中心。 　　我们使用640 nm激光器（Cooherent Obis 1185055 640 nm LX 100 MW，Edmund Optics）作为光遗传激发光源。我们使用中性密度过滤器（Thorlabs）降低了光强度，并使用带有自定义软件的Arduino的混合模拟和数字控制信号来控制光强度。数字信号用于打开和关闭激光器。使用模拟信号（来自Arduino和RC低通滤波的PWM输出）来调节功率。这两个信号都是与激光和采集板并行发送的，并使用Thorsync 3.2软件（Thorlabs）与两光子显微镜信号一起记录。光线用多个镜子指向苍蝇。使用运动学安装座（KM100，Thorlabs）和电流镜（GVS011/M，Thorlabs）实现了目标位置的精细控制。在每个实验之前，我们将激光器对颈部/胸腔进行优化。使用f = 75.0 mm（LA1608，Thorlabs）放置在距离苍蝇焦距的Plano-Convex镜头，将光聚焦在苍蝇上。为了刺激抑制性OPSIN GTACR1，我们使用了相同的系统，但是使用561 nm激光器（Cooherent Obis 1280720 561 NM LS 150 MW，Edmund Optics），而不是640 nm激光器，以更好地匹配GTACR1的光激发谱。 　　我们注意到，尽管COMDN在GNG中具有轴突侧支，但这项研究中的COMDN均不是我们成像的DN种群之一：DNP09-SPGAL4和MDN-SPGAL4线驱动神经元在大脑神经节中的神经元表达的表达，而在GNG中则没有（扩展的数据图。1A）。ADN2-SPGAL4系的DN细胞体在GNG内，但与DFD驱动线的表达式不重叠（扩展数据图1C）。因此，我们可以肯定的是，任何活性DNS都将通过突触连接而不是光遗传学募集。我们确定了激光强度，可能会引起强大的前进步行，前修饰和向后步行（图2A和扩展数据图1D）。 　　我们使用不同的激光强度来刺激MDN（21μW），DNP09（21μW）和ADN2（41.6μW）动物，因为21-μW刺激能力主要导致ADN2动物停止（扩展数据图1d）。头部，颈部和胸部中MDN的激活足以触发向后行走（扩展数据图1E）。尽管可以预期激光光的某些组织散射，但在对照实验中，我们发现头囊的激活，而不是胸部的激活可能会强烈引起向前行走的大脑的“螺栓原脑神经元”，这些神经元已知这些神经元可驱动强大的前进和快速前进3（扩展的数据图1F）。刺激（21μW）比41.6μW更具体，这就是为什么我们选择了21-μW刺激MDN和DNP09以及测试的SPGAL4线（图5F，G和扩展数据图5和6）。我们通过使用功率计（PM100D，Thorlabs）测量激光强度并调节激光器的模拟增益来定期校准激光强度。 　　我们用Thorlabs bergamo II两光子显微镜进行了两光子显微镜检查，该显微镜通过参考文献中所述进行了行为跟踪系统增强。29。简而言之，我们使用仪表式连接的冠状段使用了仪表式连接，并以大约16 Hz的框架速率扫描。另外，如上所述进行了光量刺激。我们仅记录了绿色PMT通道（525±25 nm），因为红色PMT通道会被苍蝇的红色激光照明饱和。同时，我们使用两个红外摄像机以每秒100帧的速度（FPS）记录了动物行为。 　　如参考文献中所述，解剖苍蝇以获得对VNC和胸部宫颈连接的光学通道。70。简而言之，我们将苍蝇粘贴到了定制的舞台上，将其胸部和前头粘合到持有人并卸下翅膀。然后，我们使用注射器针打开背胸部，等待间接飞行肌肉降解约1.5 h。我们推开气管，切除了肠道和唾液腺。对于某些苍蝇，气管阻碍了视野，我们将V形植入物71放入胸腔腔中，将气管推到一边。然后，我们将苍蝇放在空气悬浮的球形跑步机上，并在红外摄像机上可见，用于球跟踪（0.6 L min-1）。虽然苍蝇适应了这个新环境（大约15分钟），但鉴定了成像区域，并将光遗传刺激激光器中心置于颈部。 　　我们使用Thorimage 3.2记录和Thorsync 3.2软件来同步成像数据。我们记录了10,000个显微镜框架（大约10分钟），同时还使用放置在苍蝇周围的摄像机并提出光遗传刺激的行为数据。在典型的10分钟记录过程中，我们提出了40个刺激（5-S刺激和10-S间刺激间隔）。每当记录质量仍然足够好时（也就是说，许多神经元可见并且苍蝇仍然健康），我们都会记录多次会议以增加刺激试验的数量。在没有光遗传学刺激的情况下，许多GNG DN在自发行为过程中都是活跃的。因此，为了区分由于COMDN刺激引起的GNG DN活性与行为的自发启动，我们仅分析了果蝇在光遗传学刺激之前立即行走的试验。由于苍蝇是非常自发的活动，因此分析以前在行走而不是休息的试验增加了可用于试验平均的数据。它还使我们能够避免激光导致静止控制动物的行为，从而掩盖了我们的分析。 　　在扩展数据图2中，我们将光遗传学引起的神经活动与自然行为观察到的活动进行了比较：前进步行，前修饰和向后行走。自然的前锋步行经常是由苍蝇自发产生的。相比之下，我们需要用5 s的加湿空气刺激天线，以增加自然修饰的可能性（扩展数据图2B）。我们使用以下参数提供了加湿的空气泡芙（220a，Aurora Scientific）：80 mL min-1气流，100％湿度，5 s持续时间和20 s速度刺激间隔。要具有潮湿的空气泡芙（即流速的突然变化），而不是从干空气转换为加湿的空气（默认的嗅觉计构型），我们仅将“气味”管连接到最终阀，而不是“空气”管。此外，为了增加自发向后行走的可能性（扩展数据图2C），我们用定制的圆柱形跑步机取代了球形跑步机，我们发现这增加了向后走路的动机。具体而言，我们设计了直径为10毫米，80毫克3D打印的车轮（RCP-30树脂），并通过数字光处理（EnvisionTec Perfactory P4 Mini XL）使用立体光刻进行打印。该轮安装在低摩擦珠宝持有器上（ST-3D蓝宝石轴，VS-40蓝宝石轴承，弗洛伊迪格SA）。我们用红外可见的点标记了轮子的侧面，以促进红外摄像机跟踪旋转和速度计算以对向后步行的回合进行分类。使用方向盘时，我们在车轮左侧添加了一个额外的第三个红外摄像头，在该轮的左侧可见点标记。 　　为了记录DFD DNS中的神经元活性，在切割VNC后，我们首先安装并解剖了果蝇，如上所述，对于完整的动物。我们证实了该动物在适当的情况下对光遗传学刺激做出反应，并且动物仍然健康。然后，我们使用了一对显微镜（FST，Clipper Neuro剪刀，第15300-00号，精细的科学工具GmbH）来切割T1 Neuromere中的整个VNC。我们仅在颈椎结缔组织周围的脂肪体后切下。我们验证了通过用镊子在其后部区域拉开VNC。然后，我们进行了两光子成像和光遗传学刺激，就像在完整的苍蝇的实验中（即，在记录颈椎结缔组的横截面时对颈部的激光刺激）。我们记录了5,000个显微镜框架（约5分钟），并进行了20次刺激重复。苍蝇从舞台上自由地悬挂，没有放在球形跑步机上，因为VNC受伤，导致没有明显的腿部运动。事后，我们记录了宫颈结缔组织和T1 Neuromeres的体积堆栈，以验证切割的位置。 　　为了调查前向和向后步行涉及的主动控制附属物的数量，我们将苍蝇安装到用于成像和行为实验的相同阶段。我们记录了10次在球形跑步机上对光遗传学刺激的反应试验，在每个刺激之间留下25 s。然后，我们使用冷麻醉来截肢苍蝇的腿，然后让苍蝇恢复至少10分钟。截肢对前腿，中腿或后腿进行双侧进行，使用剪刀剪刀（FST，Clipper Neuro剪刀，第15300-00号，精美的科学工具GmbH）。我们在胫骨 - 毛孔关节的水平上截肢了腿，以最大程度地减少病变，同时去除tarsal粘附。一旦他们康复，我们再次在球形跑步机上记录了苍蝇进行十项试验。根据以前的运动（尤其是DNP09）（参考文献3），用于研究行走表型的控制蝇是广州S。 　　对于行为实验，我们将苍蝇固定在用于两光子成像的相同阶段，但没有将头部前部粘贴到支架上。然后，我们没有进一步的解剖，将动物放在球形跑步机上。在记录了十项对完整动物的光遗传学刺激的反应试验之后，我们通过反转支架并将剃须刀将剃须刀推向脖子来斩首苍蝇。为了实现这一目标，我们将剃刀刀片的碎屑安装在一对裁剪钳的尖端上，以进行更精细的控制。我们小心翼翼地不要伤害苍蝇的腿并进行干净的切口，而不必拉出穿过脖子连接的胸腔器官。为了限制干燥，我们然后用一滴紫外线纯胶将脖子的树桩密封。我们只有在斩首后四肢移动时才继续进行苍蝇的实验。然后，我们将无头蝇放在球形跑步机上，让它们恢复至少10分钟。然后，我们在球形跑步机上记录了十项对光遗传学刺激的反应试验，在没有接触球形跑步机的情况下，苍蝇从支架上悬挂了十项试验。在测试基于连接组预测的实验中，我们稍微修改了该实验程序。由于完整的对照动物被光遗传学刺激引起，以避免误报并发现对较少良好的DNS的行为表型，因此我们试图减少苍蝇的自发运动。首先，我们使用了25 s，而不是在光遗传刺激试验之间使用10 s。其次，我们用室温盐水溶液填充了飞架，以通过红外照明加热。对于扩展数据图2。5和6，除了后来研究的DNP42，OVIDN和DNG11之外，对照蝇（无DN> cschrimson）是Phinney Ridge遗传背景，它们与广州遗传背景的对照蝇进行了比较。 　　我们手动在1到6的尺度上（1至6（其中1个非常好，3是满意的，6是不够的），在每次10分钟的记录中，我们手动评分了神经记录（信噪比，闭塞等）以及苍蝇的行为（刚度，腿部损伤等）。我们只保留了两个标准至少处于“令人满意”质量水平的会议。除非另有说明，否则我们分析了苍蝇在刺激发作之前行走的试验。因此，我们没有保留少于十次步行试验刺激之前的苍蝇数据。我们选择这样做的原因有几个：（1）GCAMP6S衰减非常缓慢。即使苍蝇在刺激前约2秒移动，我们仍然观察到残留的荧光信号，从而增加了刺激时变化的变化。只有很少的情况使动物坚固地静止2 s，这使得反相反的分析不可能。（2）我们观察到对照蝇在激光刺激时引起了对照苍蝇。因此，如果它们在刺激前休息，间接驱动DN活性，并使很难区分光遗传学诱导的与唤醒诱导的活性更难。刺激之前休息的数据表现出相似的募集模式，尽管并不相同（请参阅https://doi.org/10.7910/dvn/hhngvga的数据）。DNP09在内侧宫颈结缔组织（至于苍蝇在刺激前行走）和横向区域的额外激活显示出很强的激活。以前行走的动物中ADN2激活的中央神经元在以前静止的动物中也活跃。此外，我们观察到更广泛的激活较弱。MDN激活时的DN信号在刺激前静止时会稍微散布。 　　对于无头动物的实验，我们排除了苍蝇的数据，其中一条腿在斩首后明显不动，至少一条腿没有显示自发的协调运动，或者当腹部被粘在球形跑步机上时，其他运动是不可能的。 　　为了进行分析，除非另有说明，否则我们使用自定义Python代码。行为数据预处理的代码可以在GitHub（https://github.com/nely-epfl/twoppp）上的“ Twoppp” Python软件包中找到。71。可以在GitHub存储库中找到更多详细分析的代码（https://github.com/nely-epfl/dn_networks）。 　　作为步行速度的代理，我们使用Fictrac72跟踪球形跑步机的旋转。如参考文献中所述，将来自果蝇前面的红外摄像机的数据用于这些测量。29。在100 Hz处获得的原始速度痕迹很吵，因此用中位过滤器（宽度= 5 = 0.05 s）和高斯滤波器（σ= 10 = 10 = 0.1 s）进行低通滤波。 　　圆柱跑步机的速度计算如下。首先，使用霍夫圆检测在苍蝇左侧的摄像机中检测到车轮。对于每个框架，我们沿着车轮表面提取了一个线条曲线，显示了侧面涂有涂料的点图案。然后，我们将此线轮廓与上一个帧的线轮廓进行了比较，以确定最可能的旋转移位。我们将这种转换转换为车轮角度的差异，然后将其转换为每秒以毫米的线性速度，以使其与球形跑步机旋转的量化相媲美。此图像处理容易出现高频噪声。因此，我们用高斯滤波器过滤了原始速度（σ= 20 = 0.2 s）。 　　We tracked nine keypoints from a camera on the right side of the fly: anal plate, ovipositor, most posterior stripe, neck, front leg coxa, front leg femur tibia joint, front leg tibia–tarsus joint, mid-leg tibia–tarsus joint and hindleg tibia–tarsus joint (see Fig. 1d) using SLEAP (v1.3.0)73. 　　我们根据步行速度，肢体运动能量和前腿高度的启发式阈值使用可解释的分类器对行为进行了分类。例如，我们将前进和向后行走归类为分别超过1 mm s -1和-1 mm s -1或以下的前向速度。所有参数均显示在补充表4中。如果没有满足条件，我们将行为归类为未定义。 　　前修饰由两个条件的逻辑“或”组成：（1）抬高前腿，或（2）前腿以高运动能量移动。将前腿高度计算为前腿胫骨 - 毛刺接头与COXA中位置位置之间的垂直距离。像素坐标从图像的顶部开始。因此，当前腿较低（例如在休息期间）和前腿高时（例如，在头部修饰过程中）时，这是积极的。基于相应的胫骨 - thosus关节的运动计算前腿，中腿和后腿的运动能（ME），如下所示：，其中ΔXT和ΔYT是两个连续帧之间X和y的差异。然后，我们计算了一个0.5-S（即50个样本）窗口内运动能的移动平均值，以专注于运动能量的较长时间尺度变化。 　　除非另有说明，否则我们使用自定义Python代码。对于所有图像分析，Y轴是沿着苍蝇身体的背腹，X轴是内侧的。图像和过滤器内核大小指定为（y，x）像素单位。可以在GitHub上的“ Twoppp” Python软件包（https://github.com/nely-epfl/twoppp）上的“ twoppp” Python软件包中找到用于两光量数据预处理的代码。71。可以在GitHub存储库中找到更多详细分析的代码（https://github.com/nely-epfl/dn_networks）。 　　胸部颈椎结缔组织的记录遭受了框架间运动的较大运动，包括大型翻译以及较小的非伴随变形。与以前用于类似Data71的运动校正程序相反，在这里，我们使用了在DFD> Lexaop-GCAMP6S动物中看到的高基线荧光，而不是依靠额外的红色颜色通道进行运动校正。因此，我们直接在绿色GCAMP通道上进行了运动校正。我们比较了可用红色通道的数据的性能，并且只能发现ROI信号的差异可忽略不计。无论我们是使用GCAMP通道还是来自其他红色荧光蛋白的记录，无论是神经元正在编码步行还是休息都没有变化。 　　我们在每个显微镜框架上进行了质量登记，以补偿大型宫颈结缔组织。我们裁剪了显微镜图像（从480×736到320×736像素）。然后，我们使用视光流量计算每个帧的运动场相对于每个飞行的一个选定帧。我们使用双线性插值纠正了此运动的框架。先前在参考文献中描述了用于光流动运动校正的算法。70。我们仅使用光流组件来计算运动场并省略了功能匹配约束。我们将运动场的梯度正常以促进平滑度（λ= 800）。 　　对于每个像素，我们为整个记录计算了整个时间的标准偏差图像。这可以很好地替代像素是否属于神经元：它具有高标准偏差，因为神经元有时是活跃的。我们将此图像用作记录的空间图来告知ROI检测。示例标准偏差图像也用作图2C的背景图像。 　　我们将主成分分析（PCA）应用于两光子记录中所有像素的子集。然后，我们将前五个主要组件的负载投射回图像空间。这为我们提供了集成功能信息以识别神经元的其他空间图。然后，我们使用半自动程序来检测ROI。我们在标准偏差图中进行了峰值检测。我们通过查看标准偏差图和PCA图，在视觉上检查了这些峰的正确性。我们手动添加了ROI，例如，峰检测算法错过了，例如，由于神经元仅活跃。功能性PCA图使我们能够区分具有不同功能的附近神经元。它们可能是标准偏差图中的一个大峰值，但显然会分配给不同的主要组件。我们能够为每次苍蝇注释50至80个ROI。可见神经元的数量因GCAMP6S表达水平，解剖质量，记录质量和苍蝇行为活动水平而有所不同。 　　我们通过将所有像素在ROI中心（11个像素高和7像素宽）对称地放置在菱形形状内的所有像素来提取每个带注释的ROI的荧光值。这为我们提供了每种神经元/ROI的时间的原始荧光痕迹。然后，我们使用中位过滤器（宽度= 3 = 〜0.185 s）和高斯滤波器（σ= 3 = 3 = 〜0.185 s）对那些原始的荧光轨迹进行了低通滤波。 　　由于细胞之间的表达水平可变，GCAMP荧光通常是相对于基线荧光的荧光变化。在这里，我们最感兴趣的是神经元是否被激活。为了在神经元之间具有可比性的定量，我们还将每个神经元的荧光标准化为其最大水平。因此，我们计算出，其中F是神经元的时变荧光，F0是其荧光基线，FMAX是其最大荧光。我们将FMAX计算为整个记录中F的95％分位数。在极少数情况下，神经元会被阻塞，或者对运动校正算法的轻微故障会导致某些残留运动。这两者都使估计最小荧光挑战。当苍蝇休息时，几乎所有神经元处于其最低水平（除了几个29），并且神经系统的运动通常较少。因此，我们将F0计算为“静止基线”，如下所示。首先，使用我们的行为分类器，我们在光遗传刺激期之外鉴定了长时间静止的静止（至少在归类为静止静止的1 s，至少在上一个静止后1 s的1 s）。对于每个神经元，我们随后计算了与静止发作相一致的重复的中位荧光。然后，我们在休息开始后的2秒内搜索了时间的最小值。在多个静止案例中进行中位数提供了一种计算基线的更稳定的方法，而不是简单地采用最小荧光。对于不行为的蝇（也就是说，在扩展数据中显示的具有切除的VNC的果蝇），我们无法计算静息基线，而是将5％的分位数用作F0。使用F0和FMAX的归一化提供了一种方法，可以比较具有相似单位的多个神经元之间的荧光。因此，每当我们报告绝对Δf/f时， 值为0是指静止期间的神经活动，1个是指95％的神经活动。当我们报告相对于刺激前值的ΔF/f（图2b – f，i和扩展数据图2）时，ΔF/f的单位持续存在，值为0.5表示神经元的活性水平已更改的一半，就像从静止状态变为其95％的分数状态。 　　为了处理补充视频1和2和图2B中显示的原始荧光视频，我们首先低通用时间过滤器与ROI信号相同的时间过滤器（中值过滤器宽度= 3 = 〜0.185 s，高斯滤波器σ= 3 = 3 = 3 = 〜0.185 s）。此外，我们应用了空间过滤器（中值滤波器宽度= [3,3]像素，高斯滤波器σ= [2,2]像素）。然后，我们应用了上述相同的ΔF/f计算方法，但对于每个单独的像素而不是单个ROI。因此，视频中使用的单元与图2和扩展数据中用于ROI信号的单元相同。 　　我们在两个不同的采样频率下记录了两种不同的数据模式：在大约16.23 Hz处记录了两光子成像数据，并以100 Hz的形式获取了来自相机的行为图像。我们使用在30 kHz处获得的触发信号同步了这些记录。当有必要以相同的采样速率（例如，补充视频1和2）分析神经和行为数据时，我们通过平均在一个两光子框架中获得的所有行为样本来将所有测量值降低到两光子成像框架速率。在数字中，我们以其原始采样率报告数据。 　　无论触发是光遗传刺激的发作，我们都以相同的方式进行（图2、4和5和扩展数据图1、3、5、6和10）还是天然（自发或泡芙引起的）行为的发作（扩展数据2）。为了计算刺激触发的平均值，我们将所有试验与刺激的发作对齐，并在刺激发作之前5 s和刺激后5 s之间考虑时间。在图2中，我们仅考虑了在刺激之前1 s行走的试验（行为分类应用于1-S刺激前间隔的平均值）。我们仅考虑至少在刺激之前进行十项步行试验的苍蝇。图1和图2中的行为反应。2a，4b – g和5f，g和扩展数据图1d – f，2a – c，5、6和10显示了所有试验中的平均值（包括多个动物），阴影区域表示跨试验的平均值的95％置信区间。当显示行为概率时，显示了在刺激发作后特定时间发生特定行为的试验部分。图2D和扩展数据图中的神经反应随着时间的流逝。2a – c和3c，H显示了所有动物的所有试验中的平均反应。为了想象刺激时神经活动的变化，每种神经元减去刺激之前1 s的神经活动的平均值。如果在给定时间点，给定神经元的跨试验中平均值的绝对值小于平均值的95％置信区间，则将数据掩盖为0（即，图中是白色的）。该程序使我们能够拒绝嘈杂的神经元，而在试验中没有一致的反应。因为我们在刺激发作之前减去了基线活性，所以我们还观察到DNS在光遗传刺激（神经元出现蓝色）时变得较少活跃。但是，GCAMP6S荧光不能可靠地反映神经抑制作用。因此， 我们不能声称某些神经元的激活减少是由于抑制作用。取而代之的是，由于苍蝇在刺激发作前走路，因此这些神经元很可能编码步行，并且当苍蝇停止向前行走时，这些神经元就变得不那么活跃。 　　图2C和扩展数据中的单个神经元反应图2a – c，f和3b，G显示了单个神经元/ROI的最大响应。我们检测到刺激的上半年（2.5 s）的最大响应。然后，我们计算了该神经元在其最大响应的最大响应时间中心的1 s中的平均响应。如果在1 s的至少一半中，平均值与0（即平均> CI）有着自信的不同，则我们认为神经元反应灵敏，否则我们掩盖了对零的响应拒绝噪声神经元，而在试验中没有一致的反应。图2b显示了与图2C相同的，但是将这种处理应用于像素而不是单个神经元/ROI。与以前的ROI处理相反，如果像素不响应，则不会将像素掩盖到0。图2E显示了多个苍蝇的图2c的覆盖层。这些苍蝇中的每一个数据通过对齐最大和腹神经元的Y坐标以及最外侧神经元的X坐标来相互注册。图2F是图2E的密度可视化。为了计算密度，我们设置了单个像素值，其中神经元位于其响应值中，并将其跨越苍蝇。然后，我们应用了一个高斯滤波器（σ= 25像素，内核归一化，以使其中心的值为1，以保持单位可解释），然后除以苍蝇的数量以创建“平均飞行”。扩展数据图2D以相同的方式生成。 　　图2G – I包括对神经反应的统计分析。我们将每只苍蝇的活化神经元的数量（图2G）量化为响应值阳性的神经元（如图2C所示）。我们通过将活化神经元的数量除以记录中检测到的神经元数来量化每只苍蝇激活神经元的分数（图2H）。在图2i中，我们将求和的ΔF/f定量为被积极激活的神经元的响应值的总和（请参见图2D中的红线）。在这里，我们忽略了具有负反应值的神经元，因为GCAMP荧光的降低不应解释为反映抑制作用（见上文）。我们使用了双面Mann-Whitney U检验（scipy.stats.mannwhitneyu74）来统计分析这些比较。样本量和p值在图传说中描述。Mann-Whitney U检验是一项排名测试。因此，将三个样本与三个样本进行比较（例如，ADN2与对照），其中所有样本在相同的相对位置（即等级）都会产生相同的P值，即使绝对值略有不同。这导致p值在图2G – I之间是相同的，反映了不假定基本分布的等级测试的保守选择。 　　图4B – E和5F，G和扩展数据图。5和6显示了比较完整和无头蝇的行为反应的统计检验。图4F，G和5F，G和扩展数据图。5和6显示了统计测试，将无头实验苍蝇与无头对照苍蝇的行为反应进行了比较。在每种情况下，我们都使用双面Mann-Whitney U检验（scipy.stats.mannwhitneyu74）比较刺激发作后的前2.5 s之内的平均值。我们对技术重复（试验）进行平均，仅使用统计检验比较生物学重复（单个苍蝇）。补充表5中指示了四舍五入到三位数的精确P值。 　　扩展数据中的统计测试图10显示了具有完整的实验苍蝇的腿部吸附实验蝇的行为反应的比较，以及具有腿部吸引的对照苍蝇的腿部吸引的实验苍蝇。在每种情况下，我们都使用双面Mann-Whitney U检验（scipy.stats.mannwhitneyu74）来比较5 s刺激后的总位移。我们对技术重复（试验）进行平均，仅使用统计检验比较生物学重复（单个苍蝇）。补充表6中的精确p值舍入三位数。 　　扩展数据图2a – c（右）和2E显示了在自然（自发或泡芙释放）行为期间神经对光遗传学刺激的神经反应与神经活动之间的相关性。相关的两边显着性被测量为随机样品具有与报告的相关系数高的概率（scipy.stats.pearsonr v1.4.1（参考文献74））。 　　在所有显示统计检验的数字中，显着性水平均表示如下：*** P< 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05 and not significant (NS) P ≥ 0.05. 　　We used the female adult fly brain (FAFB) connectomics dataset7 from Codex75 (version hosted on Codex as of 3 August 2023, FlyWire materialization snapshot 630; https://codex.flywire.ai/api/download) to generate all figures. We merged the ‘neurons’, ‘morphology clusters’, ‘connectivity clusters’, ‘classification’, ‘cell stats’, ‘labels’, ‘connections’ and ‘connectivity tags’ tables. We then found DNs by filtering for the attribute super_class=descending. We identified DNs with known, named (for example, DNp09) genetic driver lines from Namiki et al.14 by checking the ‘cell type’, ‘hemibrain type’ and ‘community labels’ attributes (in this priority) and using the following rules. Otherwise, we used the consensus cell type38 (for example, DNpe078). We semi-automatically assigned names using the following rules: 　　Next, we stored the connectome as a graph using SciPy sparse matrix74 and NetworkX DirectedGraph76 representations. We identified DNs with somas in the GNG by checking the third letter of the consensus cell type to be ‘g’ (that is, DNgeXXX)38. 　　We only considered neurons with at least five synapses to be connected and computed the number of connected DNs based on this criterion (Figs. 3, 5b,c,e and 6a–c and Extended Data Figs. 4–9). This is the same value as the default in Codex, the connectome data explorer provided by the FlyWire community37,75. Analysis of connectivity across three brain hemispheres (two brain halves from the FAFB dataset7 and one from the hemibrain dataset77) revealed that connections “stronger than ten synapses or 1.1% of the target’s inputs have a greater than 90% change to be preserved”38. We visualized all DNs connected to a given DN (Figs. 3a,b and 5d and Extended Data Figs. 5 and 6) using the neuromancer interface, and manually coloured neurons depending on whether they are in the GNG. 　　Neurotransmitter identification was available from the connectome dataset based on classification of individual synapses with an average accuracy of 87%39. Here we report neurotransmitter identity for a given presynaptic–postsynaptic connection. To define neurotransmitter identity for a given presynaptic–postsynaptic pair, we asserted that the neurotransmitter type would be unique using a majority vote rule. This was chosen as a tradeoff between harmonizing neurotransmitters for a neuron (especially GABA, acetylcholine and glutamate78) and avoiding the propagation of classification errors. 　　We used the networkx library76 to plot networks of DNs in Figs. 3c,d and 5e and Extended Data Fig. 5–9. Again, we considered neurons to be connected if they had at least five synapses. In the circular plots, we show summed connectivity of multiple DNs. For example, the network for DNp09 in Fig. 3c shows only one green circle in the centre representing two DNp09 neurons. All connections shown as arrows are the sum of those two neurons. DNs are considered excitatory if they have the neurotransmitter acetylcholine and inhibitory if they have the neurotransmitter GABA. Whether glutamate is excitatory or inhibitory is unclear; this depends on the receptor subtype60, which is unknown in most cases. To emphasize this, we highlight glutamatergic network edges in a different colour (pink). 　　In Fig. 3e, we show the cumulative distribution of the number of DNs reachable within up to n synapses. Statistics on DN connectivity across multiple synapses were computed using matrix multiplication with the numpy library on the adjacency matrix of the network. Lines in colour represent a DN network traversal starting at specific comDNs. The black trace represents the median of all neurons. Only a maximum of approximately 800 DNs can be reached because the others have maximally one DN input. In Fig. 5b,c, we sorted DNs by the number of monosynaptic connections that they make to other DNs. In Fig. 5b, the same sorting is applied to show the number of connected GNG DNs (orange). 　　In Extended Data Fig. 4, we show the effect of the choice of different constraints of the underlying connectome network on DN–DN connectivity degree. Statistics on DN connectivity across multiple synapses were computed using matrix multiplication with the numpy library on the adjacency matrices of the network. The segregation of excitatory and inhibitory connections was obtained by applying a mask on the direct connection signs. This implies that an inhibitory neuron acting on another inhibitory neuron would not be counted as excitatory but simply ignored in Extended Data Fig. 4d–f. 　　In Fig. 6a, we generated a shuffled network of the same size by keeping the number of neurons constant and keeping the number of connections constant. Then, we randomly shuffled (that is, reassigned) those connections. Here we only considered the binary measure of whether a neuron was connected (number of synapses >5）而不是其突触重量。然后，我们使用scipy.optimize74库将功率定律或指数符合指数。使用五个神经元的恒定bin宽度显示了所有四个分布的度分布的直方图。使用线性回归（R2）量化拟合的质量。 　　我们应用了具有分辨率参数γ= 1的Louvain Method48来检测DNS无向网络中的簇（即两个神经元之间的连接通过其突触强度和神经递质身份缩放，但连接的方向性不考虑）。在这里，所有连接都考虑到了馈线，横向和反馈。简而言之，Louvain方法是一种贪婪的算法，可最大化模块化（即，与簇之间的连接相对密度）。为了简化在优化过程中分析网络的，我们没有考虑神经元之间连接的方向性。如果神经元之间存在相互的连通性，我们会添加突触的数量（如果兴奋性为阳性，抑制作用为阴性；此处的谷氨酸被认为是抑制性的，为了简单起见，将神经调节剂忽略）。由于其随机初始化和贪婪的性质，该方法发现了群集分配的不同局部优势。因此，我们运行了100次算法。根据这100次运行的结果，我们定义了一个共簇矩阵：该矩阵的大小与连接矩阵（DNS×DNS数量）相同。每个条目代表两个DNS最终在同一集群中的频率。该矩阵分配了每对DNS在同一群集中的概率。使用此元关键，我们可以肯定，通过聚类发现的DNS分类不是局部最佳的，并且它是可重现的。然后，我们将层次聚类应用于此矩阵（使用Scipy.cluster.Sierarchy库中的“ Ward”优化方法74）以获取图6B所示的DNS的最终排序。我们使用此最终排序来检测图6b中灰色中显示的簇，如下所示：我们从排序的DNS的一侧开始，然后顺序增长了群集。如果下一个DN至少有25％的时间位于同一Louvain簇中 我们将其分配给与以前的DN相同的群集。如果没有，我们将使用此DN开始一个新的群集，并继续测试随后的DNS，以确定它们是否满足了此新群集的标准。最后，我们只保留至少有十个神经元的簇。这产生了12个簇（灰色正方形）。我们应用了相同的元群集和排序方法来分析洗牌网络（相同数量的DNS，相同数量的连接和相同数量的突触，但混乱的连接）。在这个洗牌的网络上，我们发现了34个较小尺寸的簇（图6C），暗示了我们网络中的聚类比洗牌控件更好（原始网络的模块化= 0.27，而模块化网络的模块化= 0.12）。如果突触是兴奋性的，则显示为正（红色），如果是抑制性的，则显示为负（蓝色）。 　　然后，我们分析了集群之间和之间的连接性。为此，我们积累了两个簇之间的突触数量（兴奋性和抑制作用为阴性）。为了能够比较不同尺寸的簇之间的这个数量，我们将这一数量的突触除以接收突触连接的群集中的DNS数量。对于原始DN – DN网络簇的图6D，该数量可视化，并将其作为“归一量的突触数”作为洗牌网络的图6E。如果阳性（红色），则从一个群集到另一个群集的连接主要是兴奋性的。如果负（蓝色），则连接主要是抑制性的。我们在聚类之前没有镜像Connectome数据，因为它需要在左右神经元对之间解决差异，在许多情况下，这也无法识别为整个大脑的相应细胞类别。 　　如上所述，我们应用了100次Louvain算法以增加聚类的鲁棒性。我们计算了有关该数据集（平均值和标准偏差）的集群的统计数据，专门针对包括群集的大小和数量的指标。然后，我们使用单方面的Welch的t检验（scipy.stats.ttest_ind74 at Quarly_var = false）将这些分布与改组图的分布进行了比较。结果统计数据是对原始网络和洗牌控制之间差异的保守量化，因为每个数据点都是独立采用的。在执行100个迭代的层次聚类时，保留了来自生物网络的大簇，而洗牌网络的随机关联变得不一致。实际上，簇大小的差异报告统计低估了图6b，c。所示的矩阵之间的差异。100次迭代是由随机种子初始化引起的，条件是算法收敛。每当在3 s内未达到收敛标准时，我们都会重新启动它。的确，我们从经验上观察到，当算法在3 s中不收敛时，它至少在30分钟内不会这样做，因此终止了。 　　根据与FAFB中每个神经元相关的细胞类型数据（见上文），我们能够从REF中找到许多DNS。Connectome数据库中的4,14,15,22,64。然后，我们检查了其中的哪个具有很高的突触连接到其他DNS或非常低的数字。然后，我们过滤了可用的清洁SPGAL4线的线。此外，我们集中在VNC中的主要预测在机翼神经胶体之外的线上，因为我们删除了实验范式中的机翼，因此可能无法看到光遗传学诱导的行为。这给我们留下了另外15个DNS来测试我们的预测。据报道，DNP01（巨型纤维）激活触发完整和无头蝇的起飞44,45，因此我们没有重复这些实验。这使我们有14行进行测试。这些飞行线的源和精确基因型在补充表2中报告。然后，我们对这14条线进行了实验。Because intact control flies become aroused by laser illumination, but not headless control animals, to avoid false positives, we only analysed DN lines that either had a known optogenetic behaviour in intact flies (that is, DNp42, aDN1, DNa01, DNa02, oviDN and DNg11) or that had a clear phenotype in headless flies (that is, DNb02, DNg14 and沉默的）。因此，我们排除了Web，DNP24，DNG30，DNB01（参与参考文献79的飞行扫视，但在球形跑步机上没有明显的表型）和DNG16，因为它们尚未满足这些条件，并且仅在图5和扩展数据中分析了剩余的NINE驾驶员线。5和6。 　　我们使用Neuprint网站与雄性成年神经线（MANC）Connectome数据集13,80进行互动。在那里，我们根据其名称（MDN，DNP09等）搜索神经元，并检查了其突触后神经元中是否有任何DN。我们发现了参考文献中使用的所有神经元。14（即DNP09，DNA01等），MDN和Ovidn。我们找不到ADN2，ADN1，MUTE，WEB和DNP42。 　　我们使用了Cheong等人13（图3，补充2）中显示的数据来定义Namiki等人已知的DN是否投影到特定的VNC Neuropil。简而言之，如果至少5％的突触前部位在该区域，则将DN视为投影给给定的神经胶体。我们在MANC数据集中手动找到了MDN，并确定了它们使用相同标准连接的区域。为了生成图6F，对于每个群集，我们积累了将已知DNS的数量投射到给定的VNC区域。然后，我们将其除以已知DNS的数量，以获取将已知DNS的分数投射到给定区域。该图旁边还显示了每个群集未知DN的数量。DNS和VNC神经胶质之间关联的原始数据显示在补充表8中。 　　我们研究了文献2,3,4,13,16,18,19,21,30,34,70,81,82,83,84，以识别与DNS相关的行为，并将其分为广泛的类别（前修饰，起飞，起飞，着陆，步行，步行和飞行）。该文献摘要可在注释的35种DN类型中获得补充表8，我们发现仅两个：dng11的证据相互矛盾，以引起前线摩擦21，同时主要针对飞行相关的神经胶质13；DNA08针对飞行功率控制电路13，但据报道以ASP22的名称参与求爱（参考文献23）。在图6G中，我们将DNG11分配给了“前”，DNA08将DNG11分配给了“飞行”。我们积累了与每个群集给定行为相关的已知DN的数量。然后，我们除以相应群集中已知DN的数量，以在具有已知行为的群集中获得一小部分DNS。该图旁边还显示了每个群集未知DN的数量。DNS和行为之间关联的原始数据显示在补充表8中。 　　我们使用来自FAFB的数据来鉴定每个DN簇的大脑输入神经胶体，该神经基于每个DN – DN突触的神经胶体注释。因此，定位信息由每个突触连接的位置而不是突触前伴侣的细胞体给出。这使我们可以考虑神经元的局部处理和模块化。补充表7中详细介绍了大脑区域的首字母缩略词，分别为左右脑半球的“ L”和“ R”代表。结果报告为在给定群集的DNS中的所有突触后连接中，在神经胶质中产生的突触的比例。 　　所有实验均符合相关国家（瑞士）和机构（EPFL）道德法规进行。在方法中详细介绍了动物，年龄和畜牧等动物的特征。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。