灵长类动物大脑中抑制性神经元的发展和演变

　　加利福尼亚大学戴维斯分校的灵长类动物中心提供了9个来自PCD40，PCD50，PCD65（n = 3），PCD80（n = 2）（n = 2），PCD90和PCD100猕猴的皮质组织的标本。所有动物程序均符合《动物福利法》的要求，并在加利福尼亚大学戴维斯分校的机构动物护理和使用委员会实施之前批准了方案。PCD40代表胚胎卡内基阶段20，标志着兴奋性神经元和INS神经发生的大概开始，而PCD100是Cortex42兴奋性神经发生的近似末端。来自PCD110（n = 2）的猕猴数据是从参考文献中获取的。9。此外，我们使用了公共鼠标数据集，包括胚胎第13.5天（E13.5）和E14.5神经节eminences，它们富含DLX6+细胞10，以及来自10x Genomics E18 Mouse Cortex示例数据集的三个样品，该数据集具有130万个细胞（GSE93421; GSE93421; gse93421; gse93421; space; space 1，3和4）含量。我们还使用了E14的小鼠公共数据集，包括新生儿皮层，亚皮质11和全脑发育结构以及成人结构43,44；P9纹状体45;和成人OB12。总的来说，我们分析了来自发育中的猕猴的109,112个细胞的单细胞转录组，从发育中的小鼠和141,065个总小鼠细胞中分析了76,828个细胞。根据先前的患者同意，根据赫尔辛基的宣言，在严格遵守法律和机构伦理法规的情况下收集了去识别的人体组织样本。协议获得了旧金山分校的人配子，胚胎和干细胞研究委员会以及人类研究委员会（机构审查委员会）的批准。 　　对于PCD40到PCD100猕猴，在立体声解剖显微镜（Olympus SZ61）下在PBS中进行了解剖。由于关键的解剖标志仍在形成，因此很难在早期的时间点区分许多区域。因此，在中央沟或MGE和LGE的前端出现之前，解剖了推定区域，例如运动与体感皮层。为了进行单细胞解离，将样品切成小块，并与制造商的指示在37°C下根据制造商的说明进行10分钟的预热液（Worthington Biochemical Corporation）孵育。孵育30-60分钟后，用玻璃移液尖端轻轻地进行样品，并通过卵球形梯度进一步旋转PCD100猕猴样品以清除碎屑。然后将细胞在300G处沉淀，并将其重悬于补充0.1％BSA（Sigma）的PBS中。如McGinnis等人46中所述，在条管中制备了用于Multiseq的样品，并在4°C下保持在4°C的标签方案。使用10倍基因组铬控制器和版本2或3 3个PRIME RNA捕获试剂盒完成单细胞RNA测序。大多数样品以每个孔的大约10,000个细胞加载；每条车道加载多达25,000个电池以用于多路复用样品。使用相关的10倍基因组RNA库制备套件完成转录组库的准备。如McGinnis等人46所述完成的Multiseq条形码库制备。图书馆准备后，在Illumina Hiseq和Novaseq平台上对图书馆进行了测序。 　　FASTQ文件是使用BCL2FASTQ2从Illumina BCL文件生成的。使用Kallisto版本0.46（参考文献47）和RheMac10基因组组装对基因进行定量，并使用比较注释的Toolkit48进行了新的注释，以及Musculus Ensembl版本100的转录注释。为每个物种的自定义kallisto参考，为每个物种的自定义kallisto参考量化了，用于量化的空间，并在静脉内构成了定义的及其及其及其融合的范围。Kallisto索引使用长度为31的K-MER。公共数据以RAW FASTQ文件或被转换回FASTQ文件的BAM文件下载。所有数据都是使用相同的Kallisto管道从原始读取中处理的，以最大程度地减少注释和对齐伪像。 　　Kallisto – BUS输出矩阵文件（包括内含子和外显子）输入了Cellbender（版本0.2.0; https：//github.com/broadinstitute/cellbender），该文件仅用于删除可能的环境RNA。在进一步的分析中包括了由Cellbender模型计算出的，只有大于0.99个概率的液滴（不是环境RNA）。从数据集中过滤了少于800个基因的液滴，大于40％的核糖体或15％的线粒体读数。然后使用scrublet（释放0.2.2;使用阈值参数0.5）检测到双重球并从数据集中删除。 　　大部分分析管道基于Scanpy基础架构和Anndata数据结构49。细胞中的计数通过读取深度，对数转换，然后在所有细胞中为每个基因缩放。然后，通过应用Scanpy软件包中实现的原始SEURAT变量基因选择方法，使用前12,000个可变基因进行主分析，并使用用于以下步骤的100个最具方差的主组件。批次校正仅限于以下要求，即在一个以上的测序样本中可变的基因可变，并且使用批处理均衡的K-Nearest邻居（BBKNN）50使用主要成分的欧几里得距离，以在开发数据中每批找到3个邻居，并且每个数据集中有12个邻居在每个数据集中的开发和成人成年成年人和成年成人鼠标数据中。然后，使用BBKNN衍生的k-nearest-neighbour图的leiden聚类，然后根据KNN图将其应用于SCANPY分辨率参数设置为10（或在开发鼠标数据集中7）。如果其表达值低于以下两个或多个基因的平均值，则将神经胶质与兴奋性祖细胞和神经元簇一起从数据集中删除：GAD1，GAD2，DLX1，DLX2，DLX2，DLX2，DLX5和DLX6。Cajal -Retzius细胞（RMTW_ZIC1/RELN）符合此阈值，并充当有用的外部组。这些细胞被认为是根据ZIC1和RELN表达源自尾脑膜壁（RMTW）衍生而来的，即使已知它们具有多个origins51。除去非INS后，在数据集中使用此决赛重复了缩放，主组分分析并重复以下步骤。 　　高分辨率的莱顿簇根据成熟阶段分配了有丝分裂后初始类别的连续分化轨迹成子群体。然后，通过使用群集基因表达平均值和单个莱顿群集标记的群集基因表达平均值和独特性的分层聚类，将这些高分辨率簇手动合并为初始类。合并群集的命名法结合了初始类别和特定标记基因的推定空间起源。根据RMTW，MGE，LGE，CGE和VMF的规范标记基因的表达来推断每个类别的空间起源，例如LHX5，NKX2.1，MEIS2，NR2F2和ZIC1，并受到免疫抑制和这些基因的富集的支持。为了合并物种分析，将基因归一化并在物种中缩放，然后使用BBKNN与物种内部和内部的25个邻居合并，以进行下游分析，它们的共同最近的邻居用于Sankey斑块的比较。聚类后​​，为每个基因计算每个类别的平均表达，这是每个数据集中最初可变的一对一直系同源物中最初显示两种物种（6,227个基因）的最初可变的一对一直系同源物中的平均表达式。然后，通过皮尔逊基因表达载体的皮尔逊相关性比较了这些类别。 　　我们使用Scvelo的动力模型（版本0.2.3）52使用Kallisto的剪接和未填充计数基于RNA速度来得出共享潜在时间。接下来，我们使用相关的Cellrank（版本1.3.1）软件包15来得出过渡集群中未成熟细胞的吸收概率，以便可能初始类。此步骤是必要的，因为像孩子一样的新生神经元比彼此的状态更相似。通过沿分化路径使用邻接，可以推断哪种成熟状态可能会吸收给定的未成熟细胞。然后，我们将新生的神经元分为该类别的细胞低于0.5分位数的细胞。最近的研究表明，这些转录不成熟的神经元与基于经典核苷的方法标记的新生神经元相对应。为了识别沿轨迹激活或灭活的基因，我们使用了基于潜在时间值（x）与基因表达值（y）实现在Scipy中的线性回归。这产生了每个基因的线性回归系数和两尾p值，使用在statsmodels中实现的Holm-Sidak方法（释放0.12.2）软件包以衍生Q值，对这些基因进行了多种假设测试的校正。通过计算集合相交的Jaccard指数进行比较，该基因集的定义为两个集合之间的相交元素数量除以两组联合中的元素数量。 　　与猕猴过渡细胞的重新分配类似，我们还使用了具有同样加权的KNN和RNA速度核的Cellrank衍生的吸收概率，以估计成年细胞的前体状态。由于吸收概率在末端状态下受细胞数量的偏见，并且这次的目标不是将每个发育单元分配到一个末端状态，因此我们每类最大采样了1,000个单元，其中最稀有的类具有MGE_CRABP1/MAF的707个单元，并且我们报告了每种端流中最高概率的均具有最高概率的阶级，并且我们报告了每种终端的端子。这使我们能够提供估计哪个类别的终端类别的起源，这反映在图2中的Sankey图中的边缘的权重。我们还计算了每个初始类别中每个终端状态中每个初始类别中细胞的平均吸收概率，以减轻组成效应，我们表现为热量。值得注意的是，不包括RMTW_ZIC1/RELN和VMF_TMEM163/OTP，因为它们分别是兴奋性皮质和下丘脑类。 　　固定在4％的PBS中，在4°C下在4°C的PBS中固定小鼠，猕猴和人体组织，并持续搅动。然后将多聚甲醛替换为新鲜PBS（pH 7.4），并通过在PBS中稀释的30％蔗糖（pH 7.4）中孵育24-48 h，然后将样品冷冻保存（pH 7.4）（pH 7.4），然后嵌入OCT（Tissue-Tek，Tek，VWR）和30％咖啡的OCT（Tissue-Tek，Tek，VWR）和30％。然后将组织在–80°C下冷冻，并在16–20μm下冷冻。对于RNASCOPE RNA原位杂交，根据晚期细胞诊断rnascope多重荧光试剂盒V2测定法（ACD，323120）的方案对固定的冷冻切除术进行染色。为了进行免疫染色，通过将组织载玻片放在95°C柠檬酸盐缓冲液中，然后使其在室温下冷却来进行抗原检索。在阻塞缓冲液（0.1％Triton X-100、5％驴血清和PBS中的0.2％明胶）中稀释抗体。将切片与主抗体在室温下在明亮的光线下孵育过夜，以在光箱中的光漂白自动荧光。所使用的主要抗体和稀释液记录在补充表7中。 　　Alexa染料偶联的驴二抗在室温下在黑暗中孵育1小时。使用EVOS M7000显微镜获得所有瓷砖扫描。所有图像均使用自定义Python脚本和ImageJ的最大相关网格/收集缝线（版本1.2）缝制。然后，使用ImageJ（版本1.53C）滚动球背景减法和手动亮度/对比度调整在ImageJ宏内处理它们。使用自定义的ImageJ宏进行CrabP1+细胞的图像定量，其crabp1+区域自动使用最大熵自动阈值。在纹状体或MGE中的至少五个随机区域中，将其他基因产物的阳性分类为每个细胞，并将其定义为CrabP1+区域内的> 1个点，不明确属于另一个细胞。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。