Mitoribosomal小亚基生物发生和预启动的机理

　　The Flp-In-TRex human embryonic kidney 293T (HEK293T) cell line (Invitrogen) was cultured in Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) supplemented with 10% (v/v) tetracycline-free FBS, 2 mM Glutamax (Gibco), 1× penicillin–streptomycin (Gibco), 50 µg ml−1 uridine,在5％CO2大气下，在37°C下在37°C下10 µg mL -1 Zeocin（Invitrogen）和100 µg ml -1 blasticidin（Gibco）。细胞系常规测试了支原体污染。 　　为了基于SILAC的定量蛋白质组学分析，在ISCOVE修改的Dulbecco的培养基（IMDM）中生长细胞，用于氨基酸在细胞培养（SILAC）中稳定的同位素标记，并补充了“重型”（15N标记和13C标签和13C标签）或“ Light”，或“ Light” Arg，Lys和Pro和10％Die lie andiconeconeconeconecone fciconic ficconice hysecone ficconice hyoconific（throecconeconeconeconeconeconeconeconeconecone）（TORMOLO）。 　　在补充有10％FBS（Gibco），谷歌（Gibco）和Penicillin-Stretheptycin（Gibco）的RPMI 1640培养基（Gibco）中，将TRMT2B敲除细胞系培养在37°C，5％CO2，5％CO2。大细胞培养体积在汤森最佳生长1.6-L中生长，在110 rpm的振动套培养箱中生长5-l烧瓶。对于冷冻EM样品，使用了TRMT2B-敲除细胞系的大约10个BLN细胞。 　　对于身体制剂，我们使用了NS0小鼠细胞系，其中具有灭活的TRMT2B基因，该基因已在参考文献中表征。16。简而言之，将针对TRMT2B的第一个编码外显子的CAS9引导RNA（GRNA）插入了PX458载体（Addgene＃48138）。使用含有Lipofectamine 3000试剂（Thermo Scientific）的PX458质粒（Thermo Scientific）转染NS0细胞。转染后二十四小时，使用BD FACS ARIA III在96孔板中对GFP阳性细胞进行排序，每孔中含有0.2 mL RPMI培养基。通过PCR扩增大约250 bp trmt2b片段（5ʹ-TCAAGAGTCCTAAATGCACAACC-3ʹ和5ʹ-CCCAGGAGGAGTCATCTCATCTACAATGC-3ʹ）和测序。对于脱离目标分析，我们选择了五个脱离目标，根据Benchling CRISPR GRNA设计工具（https://benchling.com）的得分最高。通过大约250 bp的PCR扩增和测序分析每个脱离目标。 　　为了生成MRM3敲除和MS37-KNOCKOUT细胞系，设计了两对靶向MRM3或MS37的外显子1（补充表4）的GRNA，并将其克隆到PSPCAS9（BB）-2A-PURO（PX459）V2.0 v2.0 v2.0 v2.0 v2.0 v2.0以产生倒数式deletions。根据制造商的建议，使用Lipofectamine 3000用PX459变体转染了细胞。通过呼毒素治疗以1.5 µg mL -1的终浓度选择转染的细胞群体，持续48小时。此后，将细胞稀释以实现96孔板上的单细胞衍生克隆。通过Sanger测序筛选结果克隆以评估敲除，并通过Western印迹确认选定克隆中MRM3和MS37的丢失。如前所述34，生成GTPBP10-KNOCKOUT细胞系。 　　为了生成敲除细胞系，可以稳定地重新表达感兴趣的蛋白质（MS37，MRM3和GTPBP10），即HEK293T细胞系，允许使用允许以剂量依赖性方式对毒素诱导的表达表达毒素诱导的表达。在补充10％（v/v）无四环素的FBS，1×青霉素 - 链霉菌蛋白（Gibco），50μgml-1尿液尿中，100μgMl-1 Zeococin（Invitration）和10μgML-blastic-blastic-blastic-blastic-blastic-blastic-s的S（gibco）和10μgML-1（grastic gro）和10μgML-1（grastion）和10°1（10个尿布），将HEK293T细胞在37°C下在5％CO2下培养在5％CO2下培养。转染前1天，将基因敲除细胞播种在10厘米的盘子中，以达到70-90％的汇合。根据制造商的指令，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）进行了表达质粒PCDN5/FRT/TO（使用MS37，MRM3-FLAG和GTPBP10-FLAG）和FLP - 成分酶POG44的共转染。选择性抗生素，100μgml-1的湿霉素（Invitrogen）和10μgml-1 blasticidin s添加48小时后，每2-3天更换了每2-3天。为了诱导感兴趣的蛋白质表达，在分析之前，将细胞与50 ng ml -1强力霉素一起孵育48小时。 　　通过以1,000克离心7分钟收获细胞。将细胞重悬于MIB缓冲液（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5、10 mM KCl，1.5 mM MGCL2、1 mM EDTA，1 mM EGTA，1 mM EGTA和1 mM DTT）中，并通过在冰上搅拌而溶胀。SM4 buffer (0.28 M sucrose, 0.84 M mannitol, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA and 1 mM DTT) was added to adjust the final concentrations of sucrose and mannitol to 70 mM and 0.21 M, respectively.细胞的裂解是在500 psi的氮气气腔中进行20分钟。通过800克离心15分钟来清除裂解液。Supernatant was collected and the pellet was resuspended in half of the volume of the MIBSM buffer (70 mM sucrose, 0.21 M mannitol, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA and 1 mM DTT) used at the previous step and homogenized in teflon Dounce homogenizer.将匀浆离心800克15分钟，并收集上清液。在上一步中，使用MIBSM缓冲量的一半重复使用颗粒的过程。所有上清液均合并。Mitochondria were pelleted from cell lysates by centrifugation at 10,000g for 15 min at 4 °C, resuspended in MIBSM buffer and loaded on top of the step sucrose gradient (1.0 M and 1.5 M sucrose in 20 mM HEPES-KOH pH 7.5, and 1 mM EDTA) in SW40 tubes (Beckman Coulter) and centrifuged in a SW40Ti转子在28,000 rpm（139,000g）的4°C下1小时。从试管中收集线粒体，重悬于20 mm Hepes-KOH pH 7.5的同样体积，并在4°C下以10,000g离心10分钟。线粒体的颗粒在液氮中被快速冻干，并储存在–80°C。 　　将纯化的线粒体解冻并裂解两次裂解缓冲液（25 mm Hepes-KoH pH 7.5，100 mm KCl，20 mm mg，20 mm毫克（OAC）2，2％Triton X-100，2％Triton X-100，2 mm DTT，1x无EDTA的无EDTA蛋白酶抑制剂（ROCHE）和40 u-1 in-1 MIN-1 MIN-1（启动）冰液在4°C下以15,871克离心10分钟清除，然后将每个1 mL装载在0.4毫升的蔗糖垫上（0.6 m蔗糖，25 mM Hepes-koh hepes-koh pH 7.5，5.5，50 mm kcl，10 mm kcl，10 mm mg（oac）2，0.5％x-100 and trit x-100 and and and and and and and and and and and and and and and r.在4°C下以100,000 rpm（436,000g）的1 h（436,000g）的120.2转子（贝克曼·库尔特）在4°C下持续1小时。在10 ml的15–30％蔗糖梯度（25 mM Hepes-Koh pH 7.5、50 mm KCl，10 mm mg，OAC）2、0.05％β-DDM和2 mM DTT）上，以39,000 rpm（130,000 rpm）在39,000 rpm（贝克曼·库尔特）以130,000分钟为单位将大约100 µL的分数分馏，并测量与SSU相对应的分数。 　　为了评估单个蛋白质的稳态水平，使用SDS-PAGE和Western印迹分析了总细胞提取物或纯化的线粒体。裂解了野生型HEK293T细胞和MRM3敲除，MS37-KNOCKOUT和GTPBP10-KNOCKOUT系的细胞颗粒（50 mm Tris-HCl pH 7.4，150 mm NaCl，NaCl，5 mm MgCl2，MMGCL2，1％毫米EDTA，1％Triton X-00和1％pielation triton x-00和1％pic pic pic pic pic pic pic（Roche）。蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher科学）。PBS并在第二天与特定的原代抗体一起孵育，并与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二级抗体一起孵育，并使用增强的化学发光（ECL; Biio-Rad）可视化。 　　为了将新合成的线粒体DNA编码蛋白标记，将细胞在80–90％的汇合度中播种成六孔盘中。首先，在无蛋氨酸/半胱氨酸的DMEM中进行了两个洗涤步骤5分钟。随后，将细胞与补充谷氨酸100X（Gibco），丙酮酸钠100倍（Gibco），10％透析FBS和100 µg ML-1丙氨酸（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）的新鲜蛋氨酸/半胱氨酸DMEM孵育37°°C。使用166,7 µCI ML -1的EasyTag Express [35S]蛋白标记混合物（蛋氨酸和半胱氨酸）（Perkin Elmer）在37°C下进行标记。标记后，用1 mL PBS洗涤细胞三次，并通过离心收集最终的颗粒。将细胞在1×PBS-PIC中裂解，并在冰上添加50个单位苯并酶（生命技术）孵育20分钟，然后将SDS添加到1％的最终浓度中。并在冰上进一步孵育30分钟。细胞裂解后，将30 µg总蛋白在螺栓上分离为12％Bis-Tris Plus（Invitrogen）SDS-PAGE凝胶。然后将凝胶在帝国蛋白质染色（Thermo Fisher）中孵育1小时，并与固定溶液（20％甲醇，7％乙酸和3％甘油）一起孵育1小时。接下来，将凝胶在65°C下真空干燥2小时。将所得的凝胶暴露于储存磷光筛网中，并用台风FLA 7000磷光受imager可视化。 　　如先前所述2进行了线粒体和蔗糖梯度离心分离。In brief, 1 mg of mitochondria was lysed in lysis buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl or 50 mM KCl, 20 mM MgCl2, 1× PIC, 260 mM sucrose and 1% Triton X-100) freshly supplemented with 0.4 U µl−1 final concentration of RNase Block Ribonuclease Inhibitor (Agilent), loaded onto a linear蔗糖梯度（10–30％，11 mL总体积）中的1倍梯度缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.5、50 mM KCl，20 mM MGCl2和1×PIC），在4°C时在79,000g下离心15小时（Beckman Coulter SW41-TI转子）。总共25个馏分，每个级别的体积为450 µL，通过从梯度的顶部进行的移液收集，每个级分15 µL用于蛋白质印迹分析。对于馏分1和2，对于第18和19部分，将每个分数的7.5 µL组合在一起并解决。 　　对于基于SILAC的蛋白质组学，HEK293T-敲除或MRM3-KNCOKOUT细胞在“重”中生长，其中包含15N标记和13c标记的ARG和LYS，或“轻型”标记的介质，以超过7倍以上。将细胞系合并在一起，线粒体分离和如上所述进行蔗糖梯度分析。 　　从1和2结合的馏分1和2加入的馏分中制备了来自Silac蔗糖梯度离心实验的肽，分别连接了3和4。在–20°C下，在20×100％冰冷的乙醇中将收集的分数沉淀。将沉淀的蛋白重悬于6 M GUHCL/TRIS pH 8.0溶液中，并在最大输出（10-S ON/OFF循环）中超声检查5分钟。在室温下孵育5分钟后，样品进行了第二轮超声处理，然后以最大速度离心10分钟。DTT在最终浓度为5 mm的情况下，将其添加到获得的上清液中，并在55°C下孵育30分钟，然后在黑暗中在室温下与15 mm氯乙酰胺一起孵育15分钟。在消化之前，进行了蛋白质定量，并相应地添加了胰蛋白酶（Pierce，胰蛋白酶蛋白酶MS级，Thermo Fisher Scientific）。蛋白质消化在37°C过夜进行，轻度摇动。12–14小时后，使用1.2％甲酸将胰蛋白酶灭活，并在室温下以3,000克旋转10分钟。使用先前平衡的脱盐柱（Thermo Fisher Scientific）对样品进行脱盐，并分别用100％乙腈和0.5％甲酸洗涤，并洗脱（0.5％甲酸和50％乙腈）。因此，使用SpeedVac真空浓缩器将肽干燥，并重悬于0.5％甲酸中以进行质谱。 　　对于带有串联质谱分析的液相色谱法，使用易于NLC 1000（热渔民科学），将肽分离在25厘米，内径为75-μm的内直径分析柱（新目标）上，该肽（新目标）被填充1.9μmreprosil-pur 120 c18-aq培养基（Maisch）。该色谱柱保持在50°C。缓冲液A和缓冲液B在水中为0.1％甲酸，在80％乙腈中为0.1％甲酸。将肽在分段梯度上从6％到31％缓冲液B分开57分钟，从31％到44％的缓冲液B，在250 NL min -1时5分钟。在Orbitrap融合三元质谱仪（Thermo Fisher Scientific）上分析了洗脱肽。肽前体M/Z测量以60,000分辨率在350–1,500 m/z范围内进行。仅选择27％归一化碰撞能量的高能碰撞分离（HCD）碎片，仅选择了2至7的电荷状态的最激烈的前体。使用自动增益控制（AGC）目标2×10-5和86毫秒的最大注射时间以50,000的分辨率测量肽片段的M/Z值。周期时间设置为1 s。碎裂后，将前体放在45 s的动态排除列表中。 　　对于蛋白质识别和定量，使用集成的仙女座搜索引擎37使用最大版本1.6.1.0（参考文献36）分析原始数据。搜索了肽片段化光谱，以根据人类参考蛋白质组的规范序列（蛋白质组ID UP000005640，2018年9月从Uniprot下载）。将蛋氨酸氧化和蛋白质N末端乙酰化设置为可变修饰。半胱氨酸氨基甲米甲基化被设置为固定修饰。消化参数设置为“特定”和“胰蛋白酶/P”。用于蛋白质鉴定的肽和剃须刀的最小数量为1。独特肽的最小数量为0。在肽光谱匹配和蛋白质假发现率为0.01的蛋白质鉴定。“第二肽”选项已打开。使用“运行之间的匹配”选项在分数之间进行成功的标识。使用Limma，版本3.34.9（参考38），版本3.4.3进行差异表达分析。 　　为了进行冷冻EM分析，将3μl的大约100 nm的形状体应用于发光的（20 mA，30 s）的孔 - 碳网格（Quantifoil R2/1或R2/2，铜，网格300），用连续的碳（约3-Nm厚度）覆盖，并在30 s厚度孵化30 s in 30 s In Emportion In Emperionited Envirency in Actrol in 100％humitive noted n ot 100％张难。将网格印迹3 s，然后使用Vitrobot MKIV（FEI/Thermo Fisher）在液体乙烷中垂裂。在FEI Titan Krios（FEI/Thermo Fisher）透射电子显微镜上收集数据集，该透射电子显微镜在300 keV上以20 eV的狭缝宽度为20 eV，在GIF量子量滤波器（GATAN）上。使用K2峰顶检测器（GATAN）的像素尺寸为0.81Å或0.83Å（放大×165,000），每Å2分数的剂量为30-32个电子。使用0.8–3.8μm的散焦范围。详细参数在补充表1和2中列出。 　　使用RISION 3.0（参考文献39）对所有数据集进行了梁诱导的运动校正。使用Motiocor2（参考文献40）对电影堆栈进行了校正和加权剂量。通过运动校正的显微照片用于与GCTF41进行对比传递函数（CTF）估计。通过Gautomatch（https://www.mrc-lmb.cam.ac.ac.uk/kzhang）挑选颗粒，然后使用参考辅助粒子拾取程序。SSU和LSU颗粒的基于参考的采摘是使用相应的挑选参考分别进行的。进行无参考的2D分类以从错误的挑选对象中排序有用的粒子，然后进行3D细化，然后进行3D分类，并进行局部角度搜索。UCFS Chimera42用于可视化和解释地图。去除对应于未对准或低质量颗粒的3D类。通过RISION 3.1（参考文献43），合并了良好的类别，并进行3D细化和CTF细化（横梁倾斜，每颗粒子散焦和每粒晶状体散光），然后进行贝叶斯抛光。基于采集区域和数据收集日期将粒子分为多镜组。进行了第二轮3D细化和CTF细化（横梁倾斜，三阶和第四阶畸变，放大倍数，各粒子散焦和每粒晶状体散布），然后进行3D细化。 　　为了对SSU状态进行分类，使用覆盖因子结合的掩模的粒子信号减法的非平衡焦点3D分类是用Relion 3.1进行的（扩展数据图2和3）。汇总了每个状态的颗粒，将减去信号恢复，并使用相应的溶剂掩模进行3D细化。为了改善本地分辨率，准备了几个本地面具并用于局部掩盖的3D细化（扩展数据图2和图3以及补充表1和2）。名义分辨率基于黄金标准，在重建的半映射之间应用0.143标准。将图对B因子进行B因子锐化和局部分辨率滤波3.1进行，并超过整体地图，并合并了模型的细化。 　　SSU的起始模型是蛋白质数据库（PDB）ID 6RW4（参考2），而LSU的pdb IDS 6ZM5（参考文献4）和5oom44。这些SSU和LSU模型被安装在地图中，然后进行手动修订。RBFA，TFB1M和METTL15的初始模型分别用PDB IDS 2E7G，4GC9和1WG8作为模板生成。配体和特定的扩展或插入是根据密度手动构建的。低分辨率区域还考虑了PSIPRED46的二级结构信息预测。MTIF3和MTIF2模型从以前的Work2（PDB IDS 6RW4和6RW5）进行了修改。FMET-trnamet来自PDB ID 6GAZ（参考3），并添加了F5C的修饰，而mRNA则是手动内置在密度中的。BL12M的CTD是由PDB ID 1CTF生成的。使用Ramachandran和Torsion Crestaints47的COOT 0.9用于模型的手动拟合和修订。 　　水分子是通过COOT自动挑选的，然后进行手动修订。通过级Web服务器（http://grade.globalphasing.org）或从CCP4 7.0库（参考文献48）中获得的修改后残基和配体的几何约束。除了RefMac5的水（参考文献49）外，将氢添加到分子中。 　　对最终模型进行了对能量最小化和原子位移参数的改进（ADP）估计，phenix.Real_space_refine v1.1.18（参考文献50），具有无ramachandran限制的旋转式约束，针对与B-fircactor锐化和局部分辨率过滤的组合图。使用COOT的输入模型作为参考，也将参考限制用于非修饰蛋白质残基。金属配位限制是通过苯金利亚套件中的deadystet产生的，并用于一些修改。手动并使用了未修饰的残基和修饰的残基或配体之间的非典型共价键限制。精制模型用Molprobity51和Emringer52验证，在近苯基套件中。在补充表1和2中列出了模型改进统计。UCSFChimerax 0.91（参考文献53）用于制作数字。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。