迷走神经际观察系统的多维编码结构

　　所有畜牧业和程序均符合耶鲁大学的机构动物护理委员会以及国家卫生研究院（NIH）指南。所有小鼠均为年龄和性别匹配的成年人（超过8周），性别之间没有差异。 　　野生型C57BL/6J（000664），GLP1R-IRES-CRE（029283），GPR65-IRES-CRE（029282），NPY2R-IRES-CRE（029285）（029285）（010774），NTS-CRE（017525），VGLUT2-IRES-CRE（016963），SST-IRES-CRE（013044），TWIST2-CRE（008712），VIP-IRES-CRE，VIP-IRES-CRE（010908）（017769），PVALB-CRE（017320），VGLUT1-IRES2-CRE（023527），CHAT-IRES-CRE（031661），LOX-CHR2（024109），LOX-TDTOMATO（024109），LOX-TDTOMATO（007914）和SNAP25-25-2A-GCAMP6S-D（0.111）。DRD2-CRE（032108-UCD）小鼠来自突变小鼠资源和研究中心（MMRRC）。LOX-L10-GFP小鼠在11,12之前进行了描述。 　　UPB序列是从HCHR2（Addgene，质粒28017），HM3DQ（Addgene，质粒50474）和HM4DI（addgene，质粒50475）的编码序列克隆的，并在sv40 poly（a）和sv40 poly（a）之前插入了592-cag-cag-cag-ceNe-cag-cene-cag-ceNe-clene-clene-clene-clene-clene-clene-clene-clene-clene-clene-svymatos-sv40-040（融合的高清克隆套件（Takara，638909）。在UNC矢量核心产生了投影seq AAV（在滴定> 1012–1013个病毒基因组）。质粒已沉积到addgene。 　　UPB序列（5' -3'）： 　　UPB-OESOPHAGUS（UPB5，addgene质粒180783）： 　　ACAGCACCATCCTCAACTCCACCAAGTTACCCTCATCGGACAACCTGCAGGTGCCTGAGGAGGAGCTGGGGATGGTGGACTTGGAGAGGAAAGCCGACAAGCTGCAGGCCCAGAAGAGCGTGGACGATGGAGGCAGTTTTCCAAAAAGCTTCTCCAAGCTTCCCATCCAGCTAGAGTCAGCCGTGGACACAGCTAAGACTTCTGACGTCAACTCCTCAGTGGGTAAGAGCACGGCCACTCTACCTCTGTCCTTCAAGGAAGCCACTCTGGCCAAGAGGTTTGCTCTGAAGACCAGAAGTCAGATCACTAAGCGGA. 　　UPB-StOCH（UPB1，addgene质粒180784）： 　　ATGGACTATGGCGGCGCTTTGTCTGCCGTCGGACGCGAACTTTTGTTCGTTACTAATCCTGTGGTGGTGAACGGGTCCGTCCTGGTCCCTGAGGATCAATGTTACTGTGCCGGATGGATTGAATCTCGCGGCACGAACGGCGCTCAGACCGCGTCAAATGTCCTGCAGTGGCTTGCAGCAGGATTCAGCATTTTGCTGCTGATGTTCTATGCCTACCAAACCTGGAAATCTACATGCGGCTGGGAGGAGATCTATGTGTGCGCCATTGAAATGGTTAAGGTGATTCTCGAGTTCTTTTTTGAGTTTAAGAATCCCTCTATGCTCTACCTT. 　　UPB-DuodeNum（UPB6，addgene质粒180785）： 　　aatggcagctcgggcaaTcagtccgtgcgccctggtcacgtcatcatcatcaccacaatcgctatgctatgagacggtggtggaaatggtggtggtcttcattgccacagtgacaggctccctgagcctggtgactgtcgtgggcaatcctggtgtgctgctgtgctgtccatcacatcaaggtcaaggcagcagctgcagcagcagcagcagtcaaacaactacttcctcttcagcctggcgtgtgtgctgctcatcatcatcatcatccttctctccatccatgactctctacccgtgtaccatcatcatcatcatcatcaagggctactactackgcccccctgggcgcgcgcgtGGTCTGCGACCTGTGGCTGGCCTGGCCTGCGCGTGGTGCCCCTCCGTCATCATGACCTTCTCATCATCATCAGCTTGACCGCTACTACTTCTTCTGCGTCA。 　　UPB-COLON（UPB4，addgene质粒180786）： 　　ATCGATGGGCCTTAGGGAACTTGGCCTGTGACCTCTGGCTTGCCATTGACTGCGTAGCCAGCAATGCCTCTGTTATGAATCTTCTGGTCATCAGCTTTGACAGATACTTTTCCATCACGAGGCCGCTCACGTACCGAGCCAAACGAACAACAAAGAGAGCCGGTGTGATGATCGGTCTGGCTTGGGTCATCTCCTTTGTCCTTTGGGCTCCTGCCATCTTGTTCTGGCAATACTTTGTTGGAAAGAGAACTGTGCCTCCGGGAGAGTGCTTCATTCAGTTCCTCAGTGAGCCCACCATTACTTTTGGCACAGCCATCGCTGGTT. 　　UPB-Pancreas（UPB7，addgene质粒180787）： 　　AAGATGGCAGGCCTCATGATTGCTGCTGCCTGGGTACTGTCCTTCGTGCTCTGGGCGCCTGCCATCTTGTTCTGGCAGTTTGTGGTGGGTAAGCGGACGGTGCCCGACAACCAGTGCTTCATCCAGTTCCTGTCCAACCCAGCAGTGACCTTTGGCACAGCCATTGCTGGCTTCTACCTGCCTGTGGTCATCATGACGGTGCTGTACATCCACATCTCCCTGGCCAGTCGCAGCCGAGTCCACAAGCACCGGCCCGAGGGCCCGAAGGAGAAGAAAGCCAAGACGCTGGCCTTCCTCAAGAGCCCACTAATGAAGCAGA. 　　UPB肺（UPB2，addgene质粒180788）： 　　acaggacaccgggtgcagtggctgcgctatgcagcagtgctgctgctccttgtcctgtcattcattccttatccgcctgcctgcctgagaagcaccccccccccctgagcagcagcagcagcagcaggagaggagagaagaaccagaaccatgggactgctgacttgtgtgtcttctctcagacatcgggactatcgtgggggggtccgcgcgccagccatggcacgctatgttaaagtcattcttttttttttttttttggtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgaacattttttcacgccgccgccaaagcaaagcaaagcagcatatatcgagggggggggggggggggggggtgtgccca。 　　UPB-Heart（UPB8，addgene质粒180789）： 　　AGGACACTTCCAATGAGTCCAGCTCAGGCAGTGCCACCCAGAACACCAAGGAACGCCCAGCCACAGAGCTGTCCACCACAGAGGCCACCACGCCCGCCATGCCCGCCCCTCCCCTGCAGCCGCGGGCCCTCAACCCAGCCTCCAGATGGTCCAAGATCCAGATTGTGACGAAGCAGACAGGCAATGAGTGTGTGTGCAGCCCATTGAGTGCCTGCCCACGCCGCGCGCTGGCCTGCCCCTGCGCGCGCCACGCACGTGGCCCGCAGCAGCAGTTCGCCCAGCAGCAGCATCGctcgcaaccaggtgcgcgcaagaagcggcggcggcgcgcgcgcggcgcgcagcaaagtgacacgaacgaacgattttgccattgccattgctgctgctggccttcatcatcct。 　　逆行腺相关病毒（AAVRG）51代表VSN研究中的强大遗传工具52,53,54。Aavrg-tdtomato和Aavrg-GFP是从UNC向量核心购买的。aavrg-flex-tdtomato（28306-aavrg），aavrg-cag-flex-rc [jaws-kgc-gc-gfp-er2]（844445-aavrg）和paavrg-hsyn-con/fon-con/fon hchr2（h134r）-eyfp（55645-avene）是从中购买的。所有病毒均包含1012-1013个病毒基因组，并且偶尔使用0.05％快速绿色FCF（Sigma-Aldrich，F7252-5G）来促进可视化。 　　在所有手术中，在加热垫上用1-2％异氟烷麻醉小鼠，然后皮下注射Meloxicam（5 mg kg -1）和丁丙诺啡（1.5 mg kg -kg -1）。肺：使用汉密尔顿注射器通过气管导管注入病毒（用75μl盐水稀释的5μL）将其注入肺中。心脏：使用小鼠呼吸机（SAR-1000，CWE）通过插管血管导管对小鼠进行通风（潮汐体积0.21毫升，呼吸频率110呼吸）。心脏通过胸腔切开术轻轻暴露。在覆盖心脏大部分区域的多个部位，在多个位置使用纳米注射器对病毒（5μL）注射（每秒20 nL）。胃，十二指肠，结肠和胰腺：通过腹部切口轻轻暴露了靶器官。病毒在覆盖大部分区域的多个位置进行注射（胃：5μL；背侧和腹侧的所有子区域；十二指肠：2.5μl，距幽门螺杆菌的长度为1.5 cm；横向结肠：2.5μl，长度为1.5 cm; pancreas; pancreas; pancreas; pancreas; pancreas：5μl）。食道：气管下方的宫颈食管通过颈部切口外科手术暴露。通过腹部切口轻轻暴露于腹部食道和食道括约肌。将病毒注射到食道肌肉和血清层中（颈椎：2.5μl；腹部：1μl，在隔膜和食道括约肌之间）。 　　To visualize and quantify the anatomical location of VSNs innervating various visceral organs in the nodose ganglion (Extended Data Fig. 1a–c), the following AAVrgs were injected into visceral organs in wild-type mice for Extended Data Fig. 1a–c: heart (tdTomato)/lung (GFP), heart (tdTomato)/stomach (GFP), heart（TDTOMATO）/食道（GFP），胰腺（TDTOMATO）/胃（GFP），心脏（TDTOMATO）/DuodeNum（GFP）和结肠（TDTOMATO）。比较AAVRG的感染效率和常规的神经示踪霍乱毒素B亚基（CTB），AAVRG-TDTOMATO（2.5μL）和Alexa Fluor 647偶联的CTB（1.0 mg ml-1，2.5μL，2.5μL，Thermo Fisher Interific Intry Intry Intry Inter and co378）野生型小鼠（扩展数据图1D）。Aavrg和CTB标记了具有相似效率的部分重叠VSN，从而提高了Aavrg可能对CTB的特定VSN种群具有一些优先的Tropism的可能性。但是，值得注意的是，通过淋巴结注射的两个类似的AAV（AAV9-FLEX-TDTOMATO，AAV9-GFP）的VSN的共同感染也导致了类似的部分重叠标签11，这表明这种可能性很低。如扩展数据图2中所述，使用14个CRE小鼠线中的直流示踪对投影序列结果的广泛验证进一步降低了这种可能性。4–8。 　　为了验证器官内注射病毒的覆盖范围（扩展数据图1E – Q，S – U），Aavrg-Tdtomato或Fast Green FCF（5％W/V，与AAVRG相同的体积）被注入到野生型小鼠中。器官的处理如“组织学和免疫化学”中所述。注射的染料或病毒能够覆盖大多数子区域，并且在包括肺肺泡，胃和肠绒毛的大多数组织层中观察到病毒感染的细胞，以及心脏心室的整个心肌层。我们还注意到，心房和支气管墙没有很好地覆盖。为了检查AAVRG是否可以在DMV中标记迷走神经神经元，将AAVRG-FLEX-TDTOMATO（2.5μL）和AAVRG-GFP（2.5μl）混合并将其混合并共同注入Chat-IRES-CRE小鼠的胃中（扩展数据图1R）。为了检查病毒扩散的程度（扩展数据图1V，W），AAVRG-TDTOMATO和AAVRG-GFP分别注射到同一小鼠的指示器官中。为了确定投影seq AAV的感染效率（扩展数据图2a，b），投影seq aavs和aavrg-gfp被注入胃中。为了投影分析（图1），将带有UPB肺，UPB-HEART，UPB-OESOPHAGUS，UPB-StOCH，UPB-DUODENUM，UPB-DUODENUM，UPB-COLON和UPB-PANCREA的投影seq AAV注入相应的器官。第一天对心脏，宫颈食道和肺进行了顺序注射，腹部食道，胃，十二指肠，胰腺和结肠在第二天被顺序注射到同一只小鼠中。大约30％的VSN从七个器官标记（扩展数据图2C）。For RNAscope HiPlex assays of retrogradely labelled VSNs (Extended Data Fig. 2p, q), AAVrgs encoding reversed transcripts of fluorescent proteins, including AAVrg-FLEX-tdTomato (heart, stomach, duodenum), AAVrg-CAG-FLEX-rc [Jaws-KGC-GFP-ER2] (lung, oesophagus, pancreas)和aavrg-hsyn con/fon HCHR2（H134R）-EYFP（COLON） 用于避免病毒引起的荧光信号引起的rnascope的潜在污染。 　　为了追踪各种迷走神经途径的中心靶标，将Aavrg-tdtomato注入了野生型小鼠的内脏器官中（扩展数据图13），并将Aavrg-flex-tdtomato注入了指示的CRE线的内脏器官中（图4，扩展数据。手术后7天收集迷走神经节，并在手术后两到三周收集大脑。 　　从对照小鼠或胃注射Aavrg-tdtomato-upb2的小鼠中收集迷走神经节。使用Monarch Total RNA MiniPREP试剂盒（NEB，T2010S）提取RNA，并使用Superscript IV第一链合成系统（Thermo Fisher Scientific，18091050）反向转录到cDNA中。使用的底漆集（扩展数据图2B）： 　　UPB2（5' -3'）：catcgataccgtcgacacaggaccggggtgcagtg（forthl）;ctgctcgaagcggcgccgctggcagtatgataaccctcg（反向）。UPB4（5' -3'）：catcgataccgtcgacatcgatgggccttagggaac（forward）;TGCTCGAAGCGGCCGCAACCAGCGATGGCTGTGCC（反向）。 　　对于对照SCRNA-seq，从40岁和性别匹配的C57BL/6J野生型小鼠（每样品中10只小鼠）收集迷走神经节（左右），并使用先前描述的方法急性分离并富集VSN。在10倍微流体设备的每个通道中加载了约5,000–10,000个VSN，以靶向3,000–6,000个单元，作为一个样品的输出。在耶鲁大学基因组分析中心（YCGA）中制备了单细胞cDNA文库，并使用Illumina Novaseq S4 Sequencer进行了1.50亿次读取，以实现每个细胞的精细测序深度的细胞深度为30,000-50,000。对于投影态度，首先将30个年龄和性别匹配的野生型小鼠（分为四个样品）被注入不同的投影seq AAV中的胸腔和腹部器官（“内脏器官AAV感染的详细信息”）。七天后收集迷走神经节。在检查的VSN中，有29.5％（102/346）为TDTOMATO+。如上所述对VSN进行了测序。 　　使用Cell Ranger软件v.3.0.2（10X Genomics），将转录组数据与MM10小鼠基因组参考（对照SCRNA-SEQ）或自定义小鼠基因组参考进行对齐。将以下质量控制指标应用于过滤SCRNA-SEQ中的低质量细胞：每个细胞的基因数> 500；每个细胞的基因数< 8,000; percentage of mitochondria genes < 10%. A total of 56,575 cells were sequenced (31,182 control scRNA-seq samples: 7,842, 7,580, 7,939, 7,821; 25,393 Projection-seq samples: 6,403, 6,381, 5,803, 6,806). Control scRNA-seq and Projection-seq data were then integrated and processed using the R package Seurat v.355, and 42 cell clusters identified using the top 30 principal components (PCs) were visualized using UMAP56 (Extended Data Fig. 2f). A total of 32,558 neurons selected from 25 Slc17a6+ clusters (16,267 control scRNA-seq samples: 4,961, 3,894, 4,288, 3,124; 16,291 Projection-seq samples: 3,863, 3,431, 4,449, 4,548) were re-clustered into 67 populations with the top 100 PCs (Extended Data Fig. 2g, top). A total of 27,800 placode-derived neurons selected from 52 Phox2b+ clusters (13,210 control scRNA-seq samples: 3,835, 3,091, 3,452, 2,832; 14,590 Projection-seq samples: 3,443, 2,973, 4,019, 4,155) were re-clustered into 52 clusters with the top 100 PCs and visualized with UMAP separately (Fig.1b for Projection-seq; Extended Data Fig. 2g, bottom for control scRNA-seq) or together (Extended Data Fig. 2h). DEGs for the 52 clusters were identified using the Wilcoxon rank-sum test implemented in Seurat from the Projection-seq dataset (Extended Data Fig. 2d). VSN clusters were then manually grouped into 12 subpopulations on the basis of expression of DEGs and their locations on the UMAP plot. E-VSNs selectively express markers for damaged sensory neurons, such as Sprr1a and Ecel116,57,58 (Extended Data Fig. 3a). The percentage of E-VSNs increased after the Projection-seq process (control: n = 627, 4.7%; Projection-seq: n = 1,528, 10.5%), and consistently more Sprr1a+ VSNs were observed after AAVrg injection (Extended Data Fig. 3b–d), demonstrating that neurons damaged during both cell dissociation and Projection-seq procedures can be easily identified. Thus, E-VSNs were removed from further analysis. 　　Further analysis was performed for the Projection-seq dataset. A total of 42 out of 1,701 Prdm12+ (2.5%) neural-crest-derived jugular VSNs and 4,791 out of 14,590 (32.8%) Phox2b+ placode-derived nodose VSNs18,59 were recognized as UPB-positive (expression level >0.8），表明我们研究中从七个主要内脏器官中逆行标记的VSN主要来自淋巴结，而不是颈神经节。因此，我们专注于nodose vsn。删除E-VSN后，在4,609个UPB标记的nodose vsn中有3,539个（76.8％）表示单个条形码（Lung-Upb，855; Oesophagus-upb，595; heart-upb; heart-upb; heart-upb，177; ate-upb，177;胃 - 胃，1,166; 1,166; duododenum upb，upb，upb，110; upb，110; pancr; pancr;在4,609（16.1％）的VSN中，有740个表达的VSN标记了两个UPB。相关矩阵（扩展数据图2E）是根据在七个检查的内脏器官上标记的单个UPB和双UPB的数量计算的，并使用R PheatMap软件包绘制。相关分析表明，这两个UPB主要来自物理相邻的，而不是随机器官（扩展数据图2E）。该观察结果与逆行追踪结果一致（扩展数据图。图1b，v，w），表明（1）在样品制备过程中，UPB泄漏是最小的；（2）两种器官接近的双标记VSN支配区域。Single UPB-labelled VSNs were designated as organ-specific VSNs, VSNs dual labelled with UPB-stomach and UPB-oesophagus were designated as oesophageal-sphincter projecting neurons and VSNs dual labelled with UPB-stomach and UPB-duodenum were designated as pyloric-sphincter projecting neurons.为了检查支配不同生理系统的VSN，将食管，胃，十二指肠和癌症的VSN单独标记为肠道VSN（图1C，d）。使用先前发布的方法60（https://github.com/dragonmasterx87/interactive-3d-plotting-in-seurat-3.0.0）生成了3D UMAP图（图1C，底部）。使用Wilcoxon rank-Sum测试（扩展数据）鉴定了器官特异性VSN的DEG或在胸腔（胃，十二指肠，结肠癌和胰腺U-Upb的胃）和腹部（胃，十二指肠，结肠和胰腺U-Upb的组合）之间（胃，十二指肠，结肠癌和胰腺U-Upb的组合）之间的DEGS。通过将DEG与AnimalTFDB 3.0小鼠数据库61（http://bioinfo.life.hust.hust.edu.edu.cn/animaltfdb/#！/）进行比较，从而鉴定了小鼠转录因子（图1D，扩展数据图3G）。例如，对于DRG神经元规范至关重要的POU4F1在肺VSN中优先表达（扩展数据图3G）。使用上游分析（上游调节器）模块，通过IPA分析（QIAGEN）预测了UPB标记的VSN中的调节网络（图3H），其中显示了POU4F1下游调节剂的表达。为了在器官引起的VSN和各种器官细胞类型之间（图3i的扩展数据）之间的细胞–细胞相互作用分析，首先从指定器官的UPB+ VSN中从投影seq数据中提取，然后与先前发表的SCRNA-SEQ数据集进行集成，该数据集使用R型套装V.3555555555。The following datasets were used: heart62 (CM, cardiomyocyte; EDC, endothelial cell; EP, epicardial cell; FB, fibroblast), lung63 (ATI, alveolar epithelial type I cell; ATII, alveolar epithelial type II cell; B, B cell; C&S, ciliated and secretory cell; DC, dendritic cell; EDC, endothelial cell;FB，i骨，巨噬细胞；duodenum65 (duodenal enteric neuron subtypes: EXMN, excitatory motor neuron; INMN, inhibitory motor neuron; IN, inter neuron; IPAN, intrinsic primary afferent neuron) and pancreas60 (ISL, islet cell; ACI, acinar cell; DUCT, duct cell; MES, mesenchymal cell; IMVS, immune and vascular细胞）。然后，使用细胞 - 肠类型（或十二指肠肠神经元亚型）进行细胞 - 细胞相互作用，并使用细胞中的细胞类型（或十二指肠肠神经元亚型）进行分析 （https://github.com/teichlab/cellphonedb，v.2.0.0）Python软件包。使用基因本体学资源富集工具67,68,69（http://geneontology..org），对心脏，肺，肠道和胰腺VSN的DEG进行GO途径分析（沿组织轨迹）进行了GO途径。 　　测量了从淋巴结神经节到开头和各种器官末端的距离，并将其标准化为从颈部到直肠的身体长度（图1E – G）。The mean distances were calculated as Positionorgan (lung: 0.241 ± 0.005; heart: 0.280 ± 0.005; oesophagus: 0.228 ± 0.005; stomach: 0.469 ± 0.006; duodenum: 0.567 ± 0.006; transverse colon: 0.589 ± 0.005; pancreas: 0.545 ± 0.007; n = 4 mice).VSN簇的器官位置得分（图1E）（表明它们沿着人体的tostral-cauaudal轴的目标偏好，计算为使用群集中的器官特异性VSN的百分比（porgan-cluster中的器官特异性VSN（Porgan-cluster）（porgan-cluster）（porgan-cluster = Upborgan = Upborgan+ All upborgergan+ vsns nuper upborgan+ vsn的数量），计算为positorgan的加权平均值。σ（porgan-cluster×positionorgan）/σporgan-cluster。测量器官特异性VSN的器官轨迹得分（图1F，G）被测量为其沿UMAP图上器官轨迹的投影位置（如图1E所示）。使用SlingShot70鉴定了组织层轨迹，并使用TradeseQ71发现了沿该轨迹的DEG。通过使用假频率函数，通过弹簧弹圈测量了DEG+ VSN的组织层轨迹评分作为其相对位置。根据内部 - 驱动器位置，每种组织类型的分数（粘膜或内皮上皮，0；肌肉，1；结缔组织，2），对于DEG+ VSN的组织层指数（图2A – C）（图2A – C）（图2A – C）（每个器官）的deg+ vs+ vs nevers层均基于deg+ vs norker inters+ vs+ vsn的层+ vs+ vs的层。目标组织层中的VSN末端/在所有组织层中的DEG+ VSN末端的数量）×iDextissue）（图2A – C）。 　　如前所述11,12进行迷走神经节注射。简而言之，将小鼠用1-2％的异氟烷​​麻醉，并保持在加热垫上。左右迷走神经节都被手术暴露。含有1：1稀释的AAV9-FLEX-TDTOMATO和AAV5-CAG-GFP的病毒混合物使用纳米注射器III注射器（Drummond）注射了0.05％（w/v）快速绿色FCF（每侧160 nl，每秒20 nl）。手术后四个星期，将小鼠安乐死以进行组织收集（请参阅“组织学和免疫化学”）。 　　根据制造商的协议（高级细胞诊断）进行了RNASCOPE HIPLEX分析。迷走神经节急性解剖，并在冷冻装饰培养基中新鲜冷冻（OCT）。使用低温恒温器（Thermo Fisher Scientific）切割冷冻切除术（VCATFISH的10μM；对于其他14μm），安装在超冻土加上幻灯片（Thermo Fisher Scientific）上，并存储在-80°C下，直到使用。在室温下，将载玻片立即浸入RNase无RNase PBS中的新鲜4％多聚甲醛（PFA）中60分钟，然后以50％，70％和100％乙醇脱水。然后在室温下用蛋白酶IV消化样品30分钟。与设计探针（补充表1）在40°C下进行2小时杂交后，将切片用赫普Liplex AMP 1-3处理，然后在反染色和安装之前处理hiplex fluoro T1 -T3。使用配备有电动级的Leica SP8共焦显微镜对载玻片进行成像，PMT检测器，HYD SP探测器，四个激光线（405 nm，488 nm，552 nm和638 nm）和20倍物镜（HC PL APO 20×/0.75 CS2）。成像基因座精确地记录在第一个组中的LAS X软件中，以进行图像注册，然后应用于以下组的相同部分成像。每组之后，将荧光团通过10％切割溶液裂解（ACD，324130）。然后将切片与第2组的赫普氟T4 – T6，第3组中的hiplex氟T7 – T9和第4组的赫普氟T10 – T12杂交。总共检测到12个基因在一个截面上检测到12个基因。对VCATFISH进行了以下更改：（1）hiplex Fluoro后未安装载玻片，而是以16×浸入物镜（HC Fluotar L 16×/0.8 Imm Motcorr visir）在4×SSC中成像；（2）在首轮成像（4组，12个探针）后，使用hiplexup试剂去除探针，并将切片与另外12个探针（2 H，40°C）杂交进行第二轮分析。总共分析了22个基因（参见“ VCATFISH分析”）。 　　用氨基甲异烷（每公斤1.5 g）麻醉小鼠，并用含有10 U ML-1肝素（Sigma-Aldrich，H4784）的15 mL冷PBS（pH 7.4）对心铁灌注，然后用25 ml冷4％PFA。剖析了快速绿色FCF注射器官（扩展数据图1E，G，J，S – U）在带有数码相机（Amscope）的立体声显微镜下进行了剖析和成像。对于所有其他人，解剖了内脏器官和/或迷走神经节，在4°C下在4％PFA中固定后（内脏器官过夜，30分钟为神经节），然后在4°C下保持冷PBS。大脑在固定后（4％PFA，过夜，4°C），在30％蔗糖PBS溶液中冻结两天在4°C下进行两天，在OCT中冷冻，然后在-80°C下储存直至冷冻。 　　对于大脑样品，将40μm的冷冻切片安装在超冻砂剂加上幻灯片上。Cryosections were washed (3× PBS), permeabilized (0.1% Triton X-100, PBS), blocked (5% normal donkey serum, PBST (PBS, 0.05% Tween-20)) and incubated with primary antibodies (chicken anti-GFP, 1:1,000, Aves Labs; rabbit anti-RFP, 1:1,000, Rockland) diluted in blocking buffer for 2 h at室温。Then, the slides were washed (3× PBST), and incubated with fluorophore-conjugated secondary antibodies (Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure donkey anti-chicken IgY, 1:1,000; Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure donkey anti-rabbit IgG(H+L), 1:1,000, Jackson ImmunoResearch) diluted在室温下阻止缓冲液2小时。孵育后，将样品洗涤（3×pBST），并用荧光素-G与DAPI一起安装，然后用Leica SP8共聚焦显微镜进行成像。 　　除非明确提及，否则用立方方法72清除内脏器官，并用以下方案染色。简而言之，将解剖器官浸入1/2-水均二二硅的试剂1（25 wt％尿素，25 wt％Quadrol，15 wt％Triton X-100）中，在37°C下摇动3-6小时，然后在37°C下摇动7天。每两天更换R1。接下来，洗涤组织（3×PBS/0.01％NAN3），被阻塞（2％正常驴血清，0.1％Triton X-100，PBS/0.01％NAN3），并与一级抗体（鸡抗GFP，1：200; Rabbit Anti-Rfp，1：200）在She Profe buffer buffers中孵化（鸡抗GFP，1：200; rabbit anti;然后洗涤样品（0.1％Triton X-100，PBS/0.01％NAN3），并与荧光团偶联的二级抗体一起孵育，在室温下摇动五天，在阻塞缓冲液中稀释了五天。抗体孵育后，将样品洗涤并浸入1/2-PBS二稀释的试剂2（25 wt％尿素，50 wt％蔗糖，10 wt％三乙醇胺）中，然后在室温下在37°C下在室温下在37°C下进行2天。最终将样品浸入油至少1小时，并在定制的成像室中扁平至大约500μm，并使用上述Leica SP8共焦显微镜成像，并具有10倍物镜（HC PL APO 10×/0.40 CS2，工作距离：2.1 mm）或40×PL Flurot（HC PL Flurot）。类似地处理了一些心脏样本，但没有使用耶鲁大学CNNR成像核心的Lavision Vltramicroscope II灯泡显微镜进行扁平化和成像（扩展数据图5A）或Leica SP8 Compocal显微镜具有16倍嵌入目标（HC Fluotar L 16×16×/0.8 Immcorcor visir，sypsir locy discom），工作距离。心脏切片（厚度为1毫米）和胃肠道器官确定病毒扩散（扩展数据图。 GFP和DSR过滤器集，1倍物镜（计划M系列）和Leica DFC7000 T摄像头。由于多种技术挑战，胰腺被排除在解剖学分析之外（保持其原始结构并在清除，抗体渗透和成像效率后区分各种组织层）。 　　修改的立方协议用于清除迷走神经节：在R1中清除样品一天，在原始和次级抗体中孵育（鸡抗GFP，1：1,000；兔抗RFP，1：1,000； Alexa Fluor 647符合的Adginipure Adpinipure抗浓度的抗浓度抗浓度，ALEXAD； ALEXAF； ALEXA JUUG，1：1：1,000; 1：1,000,000; 1：1：1,000; 1：1,000; 1：1,000; 1：1,000; 1：1,000; 1,000; 1：1,000; 1：1,000,000; 1：1,000,00,000 ca。驴抗兔IgG（H+L），1：1,000）分别过夜，并用R2处理一天。清除的神经节与Leica SP8共聚焦显微镜成像。 　　在实验过程中，GPR65TDT-GCAMP6S小鼠被连续地被麻醉（1-2％异氟烷/氧）。插入气管管以进行空气注射。插管上食道和幽门括约肌，并多次用盐水冲洗以去除残留的食物颗粒。用六个PE-10管的束插入十二指肠（大约0.5厘米），以单独递送盐水，水和葡萄糖（1 m），确保（确保原始的香草营养奶昔），10×PBS和150 mm HCl（pH = 0.84）。左迷走神经节暴露在稳定的平台上12。在钙成像过程中，按以下序列将一系列刺激输送到同一小鼠：（1）肺膨胀20 s，用600 mL min-1流量（通过气管管的氧气），两次间隔为2分钟；（2）小肠通过十二指肠套管快速注射600μl盐水；用100μl，300μl和600μl盐水通过食道套管延伸30 s（持续时间通过关闭或开放幽门插管来控制）；（4）用100μl盐水，水，1 M葡萄糖，确保10×PBS和150 mM HCl的小肠输注，并在输注之间进行3分钟的间隔。使用两光子显微镜（920 nm激发，Leica TCS SP8，来自Spectra-Physics的Mai Tai Laser，HYD SP探测器），从15μm的两个焦平面上测量GCAMP6S荧光。每个平面的成像频率为每帧1.72 s。最后，将电刺激应用于迷走神经，并在GCAMP和TDTOMATO（552 nm，一个光子激发）信号中均采用神经节的Z-stack进行细胞登记。 　　GCAMP成像后，将迷走神经节立即嵌入OCT中，原位冷冻，切成10个um冷冻切片。RNAscope HiPlex assays for the following 22 genes were performed (Fig. 3b, Extended Data Fig. 9): Trpa1 (R1T1), Runx3 (R1T2), Uts2b (R1T3), Gabra1 (R1T4), Slit2 (R1T5), Kcng1 (R1T6), Piezo2 (R1T7), Ddc (R1T8),VIP（R1T9），TRPV1（R1T10），TDTOMATO（R1T11），GPR65（R1T12），CHODL（R2T1），GLP1R（R2T2），GRM5（R2T3），SLC17A7（R2T4），P2RY1（R2T4），P2RY1（R2RY1（R2RY1（R2RY1）），Car8（R2T3），Car8（R2T7），NTS（R2T8），CCKAR（R2T9）和CALCA（R2T11）。以下标准用于对VSN亚群进行分类（图3b，扩展数据图9）：A-VSNS：Runx3+和/或Piezo2+/P2Ry1+，TMC3-;B-VSN：GABRA1+;C-VSN：SLIT2+，PIEZO2+，DDC+，TMC3+，TRPV1-，P2RY1-的多击。D-VSN：TMC3+，TRPV1-;F-VSN：GPR65+;G-VSN：TRPV1+，UTS2B+，VIP+，GLP1R+，CCKAR+的多个命中;H-VSN：TRPV1+，TMC3-，TRPA1+;I-VSN：TMC3+，CAR8+，CCKAR+，PIEZO2-的多次命中。J -VSN：TRPV1+，CALCA+和一些P2RY1+，Piezo2-;K-VSN：TRPA1+，KCNG1+，TRPV1+，Calca+;L-VSN：P2RY1+，TRPV1-。首先在体内GCAMP图像和rnascope图像之间注册了充当细胞注册地理地标的TDTOMATO+神经元（扩展数据图9E）。然后，使用注册的TDTOMATO+细胞的坐标来计算体内3D图像和rnascope截面之间的转换矩阵。我们认为，来自给定rnascope截面的TDTOMATO+细胞也应位于转换的体内图像堆栈中的同一平面中，因此，我们使用了一个平面校正脚本，模拟了来自多个Rnascope部分的TDTOMATO+细胞的虚拟平面。然后将转换矩阵应用于体内图像堆栈（LASX软件中的3D扩展/插件） 生成类似于rnascope部分的体内成像平面。然后根据其相邻的TDTOMATO+细胞的相对距离和深度对TDTOMATO-神经元进行注册（扩展数据图9E – G）。每个样本的注册由至少两个人独立进行。总共有57.5％（349/607，6只小鼠）的响应性VSN被明确注册，这与三叉神经节中开发的类似方法相当。未成功注册的细胞从进一步的分析中删除。 　　感兴趣的区域是从GCAMP图像中手动提取的。除非具体提及，否则将刺激诱导框架设置为0。基线信号（F）定义为在刺激诱导和神经元活性之前的10帧周期内的平均GCAMP6S荧光（17.2 s，框架-20到帧-10）。如果在刺激期间的最大GCAMP6S荧光比基线高100％以上（肺通货膨胀和胃伸展：在40帧/68.8 s之间，注射后的40帧/68.8 s，则在90帧/154.8 s输入后）。峰值响应在刺激周期内被确定为最大ΔF/F。为了比较肺拉伸敏感VSN中的适应速率，在激活框架下对GCAMP6S痕迹进行排列（扩展数据图。图11c，箭头，设置为0），而激活持续时间计算为峰值帧和后峰值框架之间的VSN活性（ΔF/F）达到10％的峰值响应的峰值框架之间的框架数量（峰值响应10％）。对于肠伸展，激活框定义为先前的峰值框架，即VSN活性（ΔF/F）达到峰值响应的10％。 　　在单个簇中靶向的各种CRE线中靶向的基因+ VSN的百分比（扩展数据图4C）被计算为使用对照scren-seq数据集在每个群集中所有VSN的数量归一化的基因+ VSN的数量。每个群集中基因+ VSN的倍数富集（扩展数据图4D）被计算为目标群集中基因+ VSN的百分比，该群集在所有群集中都通过基因+ VSN的整体百分比标准化。 　　原发性食道，胃，十二指肠，结肠，心脏和肺VSN簇被确定为包含超过4％相应UPB单标记的VSN的簇（扩展数据图5C，6B，7C，7C，7C，7C，8A，8A，E，E，K），添加了以下添加：G2，G5，G5-DUODENUM VSN和I4％（i4％）（3.64％）（3.64％）（3.95％）。使用以下标准定义了丰富胃区域4、6-8（扩大数据图7e，h）的VSN簇：（1）簇包含超过4％的双UPB（区域4：食管/胃；区域6：胃/pancreas;胃/pancreas; ate/pancreas;区域7：胃/胃/胃/胃/胃/胃；（2）在群集中，标记为VSN的双UPB的百分比至少比标记为VSN的胃B的百分比和其他UPB的百分比（分别为食管，胰腺，结肠癌，结肠癌，Duododenum）高。富含胃区域5的VSN簇（仅S-仅S-仅S扩展数据图7H）的定义为：（1）簇包含超过4％的胃B标记为VSN；（2）在集群中，标记为VSN的胃B的百分比至少比胃/食道/胃/胰腺，胃/结肠/胃/胃/十二指肠双UPB的VSN的百分比高5％。在八个主要的十二指肠VSN簇（F1，F4，G2，G5，H2，H2，H3，I5和J3）中，三个（F1，H2，J3）更富集在胃中/双重标记的VSN中，这表明它们优先地投影了幽门螺杆菌的Duodeenum。因此，其他五个DuodeNum VSN簇的重点是进行DEG分析（扩展数据图8A）。DEG的分数（扩展数据图5E，6C，7F，8B，F，L）被计算为指定簇中的DEG+ VSN数量除以面板中指示的所有富集簇中的DEG+ VSN数量。在鉴定出的富集簇中的基因+ VSN百分比（扩展数据图5d，6d，8h）被计算为基因+ VSN的数量除以该群集中VSN的总数。 　　四种类型的肠道VSN结束类型，三种类型的心脏VSN结束类型和五种类型的肺VSN终结类型是根据其形态和位置分类的，使用VGLUT2TDT小鼠中的整个安装准备工作（图2D，扩展数据图4B，5B，5B，6A; n = 4-7）。用于对指定胃肠道区域中ME和IMA的定量分析；肺中的肺泡，纵向和斑块末端；和心脏中的静脉曲张结尾和IMA（扩展数据图5F，6L，7B，M，8D，J，N），使用Leica Application Suite Suite X软件测量了每种感觉终结类型的面积，并除以每个样品的总面积以得出每个样品的总面积，以得出支架强度。对于胃肠道中的igles，肺部的神经上皮体（NEB）末端和心脏的花朵喷雾末端，计数末端簇的数量（扩展数据图5F，6L）。igles的数量除以每个样品的总面积，以得出神经强度。胃肠道末端的归一化神经敏感强度（扩展数据图7b，m，8d，j，n）被计算为在指示的CRETDT小鼠中形成的指示感觉终结类型的神经强度，由指示的CRETDT小鼠除以在VGLUT2TTTDT小鼠中形成的指示式终结类型的支出强度。指示的胃区域中各种感觉终结类型的倍数变化（扩展数据图7d，j）被计算为在指定的胃部区域上相应的感觉终结类型的神经性强度除以VGLUT2TDT小鼠在整个胃中相应感觉终结类型的神经感知强度（n = 4）（n = 4）。 　　心脏VSN主要分布在四个簇中（扩展数据图5），其中DEGS：D1（PIEZO2），H4（DRD2）和I3/I4（AGTR1A）。在压电2TDT小鼠中，大多数心脏传入是静脉曲张的表面末端。在DRD2TDT小鼠中，心脏传入与分支和平行IMA的密度神经支配。Agtr1a+ VSN主要在心脏和主动脉弓中形成花喷的末端。因此，我们的结果揭示了各种VSN心脏终结类型的身份（扩展数据图5H）。 　　尽管表征了五种类型的肺VSN末端，但仅揭示了两组主要的原发性肺VSN簇（扩展数据图6）。A3-VSN纤维在Agtr1ATDT，VGLUT1TDT，PVALBTDT和P2RY1TDT小鼠沿节段支气管上行驶，并以围绕NEB包裹的气道分叉终止。值得注意的是，Agtr1ATDT和P2RY1TDT小鼠中的VSN纤维还形成了围绕Larynx17和上食管上的味蕾的相似末端（扩展数据图6H），这表明不同器官中的VSN芽结束可能具有相似的遗传签名。在Twist2TDT和P2RY1TDT小鼠中标记的K1–3/L2-VSN形成了肺泡末端。其他三个未用投影seq有效标记的VSN肺末端全部在支气管气道上，这与我们的观察结果一致，即我们的观察到流明的病毒没有有效地覆盖支气管壁（扩展数据图1i）。NPY2R+传入形成密集的纵向末端，包裹在细支气管周围；NPY2R+和P2RY1+ VSN在节段支气管上或支气管分叉周围形成斑点的末端。压电2+肺传入主要形成两种终结类型：（1）芽结束在NEB周围（扩展数据图6G），因为Piezo2部分在A3-VSN中；（2）在带有分支末端的支气管分叉附近（图3E，左），主要来自C3簇（占Lung-Upb标记的VSN的1.5％）。肺VSN类型的注释在扩展数据中总结了图6M）。 　　大多数胃VSN分布在9个簇中（扩展数据图7C）。We divided the stomach into five regions based on their proximation to other UPB-targeted organs (Extended Data Fig. 7a, b) and took advantage of dual-UPB labelled VSNs that innervate regions close to both organs to decode each region individually (region 4: stomach/oesophagus-UPB dual-labelled VSNs; region 6: stomach/pancreas-UPB dual-labelled VSNs;区域7：胃/结肠双重标记的VSN；与其他胃部区域相比，PIMA和CIMAS，但在食管括约肌周围没有其他结局（扩展数据图7D，顶部）。因此，将三个簇（J1，J3和I1）富含在胃/食管双重标记的VSN中（扩展数据图7E，F，TOP）。然后，我们确定了DEG（用于J1/J3的P2Ry1，I1的Calb2），并检查了P2RY1TDT和CalB2TDT小鼠的幽门括约肌周围的IMA。大多数（75.0％）的P2RY1+ IMA周围周围的P2RY1+ IMA是PIMAS，所有CalB2+ IMA都是CIMA（扩展数据图7G），这表明J1/J3-VSNS形成PIMAS和I1-VSN形成CIMAS。除J1-和I1-VSN外，在S/D-VSN中还富含三个簇：F1（SST，GPR65），H2（VIP）和C4（GLP1R，Piezo2），而VGLUT2TDT小鼠中所有传入的类型均在区域8 phoric pyloric phhoric phhoric phhoric phhoric phhoric phhoric phhoric phhoric phhoric周围均富含所有传播。如报道，SST+和GPR65+ VSN在胃中形成了ME，如112,16所报道，SST+结尾主要在ANTRUM中，而GPR65+末端更均匀地分布在整个胃中，表明F1-VSNS形成MES。GLP1R+和PIEZO2+ VSN都主要形成igles，表明C4-VSN会形成胃igles。VIP+ VSN在区域8中表现出PIMA形态，这表明H2-VSN也形成了PIMA（扩展数据图7d – g）。 　　我们还使用解剖学跟踪结果来促进其他胃vsn簇的注释。我们首先确定每种末端类型的相对神经支配强度（称为解剖折叠变化或a型且类型烟区）（ME，ME，PIMA，PIMA，CIMA和IGLE）（4、6、6、7和8）（4、6、6和8），计算为各种胃部在各种胃部的范围内的终端区域的细胞支配强度。图7J）。根据解剖结果（扩展数据图7、8），F-和G-VSN形成粘膜末端（MES）；H2-，H4-，J1-和J3-VSN形成PIMAS；I1-VSN形成CIMA；和C4-VSN形成igles。然后，我们使用MATLAB脚本在胃中（i2，i4，i5，i6，i7，j2和j4）进行了七个VSN簇（i2，i4，i5，i6，i7，j2和j4）的感觉结束型仿真使用MATLAB脚本，假设每种都可以独立地形成四种终结类型（ME，PIMA，CIMA和IGLE）之一。因此，总共测试了47 = 16,384种可能性。对于每种可能性，每种末端类型（ME，PIMA，CIMA和IGLE）在每个胃部区域（4、6、6、6、7和8）的相对神经支配强度（称为投影 - seq折叠变化或sfafferent类型 - 孔孔区域）（ME，PIMA，CIMA和IGLE）（4、6、6和8）的相应VSN的近距离表格的百分比是计算的形成这种结局类型的VSN表示为σ（在所有VSN簇中，该胃部区域的双标记VSN的百分比构成相应的结尾类型）/σ（在所有构成相应结束类型类型的VSN簇中的胃 - 胃抬高单标记VSN的百分比）。然后，我们计算了所有结尾类型的所有胃区域的解剖学和投影序列衍生的神经强度之间的总方差，表示为σ（n = n =区域4、6、7、8）（sfme-n-afme-n - afme-n）2 +σ（n = n =区域4、6、6、6、7、8）（sfpima-n-n-n-n-afppima-afpima-a）2 +σ（n =区域4、6、7、8）（sfcima-n-afcima-n）2 +σ（n =区域4、6、7、8）（sfigle-n-n-afigle-n）2。差异最低的试验定义为最佳拟合度。为此条件绘制了Affafferent Type-starch区域和Sfafferent Type-starch区域（扩展数据图7J）。模拟表明J2，J4和I7用于CIMAS，I2和I4 – I6用于Igles。我们的数据和以前的发现进一步支持了这一预测16，即Agtr1a+和Oxtr+ VSN（主要是I-VSN）都形成了靠近胃牛trum的igles（扩展数据图7K，L）。 　　用以下DEG来表征五个富含胃/双重标记VSN的十二指肠VSN的簇：GPR65（F4），VIP（H3/G2/G5），GLP1R（G2/G5）（G2/G5）和AGTR1A（I5）（I5）（扩展数据）。GPR65+和VIP+ VSN主要形成了十二指肠中无法区分的MES肠绒毛（VIP+ MES的密度要低得多），这表明F-和G-VSN簇均形成MES。相比之下，代表i5-VSN的AGTR1A+神经元主要在十二指肠中形成igles（扩展数据图8b – d）。同样，在五个主要结肠VSN簇中，Agtr1a是I-VSN的DEG，Agtr1a+ VSN在结肠中主要形成igles（扩展数据图8E – G）。TRPV1在I-和H4-中都高度表达，但仅部分在F3-VSN中，而Igle，Ima和Me结尾的百分比与TRPV1+ VSN形成的结尾与I，H4和F3簇中TRPV1+ VSN的百分比息息相关。在食道中观察到了广泛的TRPV1+ IMA，并且在五个原发性食道VSN簇中，J3在J3中高度表达了TRPV1，这与J3 VSNS在胃中形成IMA的概念一致。压电2+迷走性食道传入（来自C5-8簇）形成的密度IMA，这表明与C4-VSN（胃igles）不同，C5 – C8 VSN也会形成食道食管IMA。可能由于感染效率低，因此没有明显的食管ME或Igle簇。值得注意的是，在所有检查的CRE线中，NTSTDT小鼠的传入优先形成了食管igles（扩展数据图8n），后来用于研究食道igles的中心投射。然而，食管ME主要由TRPV1+和GPR65+ VSN形成，这表明它们可能具有与其他胃肠道器官中ME相似的遗传特征（扩展数据图8N，P）。肠道VSN类型的注释在扩展数据中总结了图8Q。 　　Correlations among various VSN characteristics, including 7 visceral organs (lung, heart, oesophagus, stomach, pancreas, duodenum and colon), 4 tissue layer types (epithelium, specialized epithelial cells, muscle and elastic connective tissue), 6 VSN ending types (epithelial, budding, pIMA, cIMA, plate of puncta and varicose), 11 VSN在图3F中绘制了亚群和4种响应模式（机械持续，机械瞬态，多型和化学）。根据两个特征中变量之间的连接数量和连接的数量和模式，计算了VSN特征对之间的相关索引（图3G），具有两个假设：（1）相关性与总连接的总数负相关：两个特征与一个特征相关（相关性= 1）与一个特征相关性（一个相关性= 1）是一个可变量的相关性，一个可变量是一个可变量，一个可变量是一个可变量，一个可变量是相关的，一个可变量是相关的。如果一个特征的每个变量都连接到其他特征的每个变量（意味着最大的可能连接数量），则可能的连接的最小数量）和两个特征完全不相关（相关索引= 0）；（2）具有相同数量的连接，如果连接更均匀分布，相关性更强，这意味着两个特征中所有变量之间连接数量的统计差异较小。我们首先计算了每个特征中变量的数量（从分析中删除了没有连接的变量）以及每对特征之间的连接数量。然后，我们计算了归一数字的连接数（C），表示为（连接数 - 可能的连接的最小数量）/（可能的连接的最大数量 - 可能的连接的最小数量），， 对于每对特征。接下来，我们计算了特征（V1和V2）每个变量连接的统计差异。由于两个方差都同等地促进了相关性，因此相关指数最终被计算为（1 -c）/（（v1+1）×（v2+1））。 　　Mouse line and organ combinations were selected on the basis of Projection-seq anterograde tracing results: lung alveoli ending (Twist2-ires-Cre, lung), lung NEB ending (Agtr1a-Cre, lung), oesophageal IGLE (Nts-Cre, oesophagus), oesophageal IMA (Piezo2-GFP-ires-Cre, oesophagus), heart IMA（Drd2-cre，心脏），胃igle（glp1r-ires-cre，胃），胃粘膜结尾（GPR65-IRES-CRE，胃），胃IMA（VIP-IRES-CRE，胃），duodenal Igle（Duodenal Igle（Agtr1a-cre，duodenal colodenum），duodenal mucosal and colonal colone and colone and colone and colone and duoden and duoden and duoden and duoden and duoden and duoden and-cre，duoden and cre umium，（Agtr1a-cre，结肠）。在“内脏器官的AAV感染”中描述了器官注射AAVRGS。脑处理和成像在“组织学和免疫化学”中描述。 　　在不同序列水平的各种内脏器官（-7.20，-7.32，-7.48，-7.48，-7.56，-7.76，-7.76，-7.92，-7.92，-8.0 mm）上，由从各种内脏器官（-7.20，-7.32，-7.48，-7.92，-8.0 mm）逆转标记的迷走神经传入所支配的面积。The percentage innervation of indicated brainstem sub-nucleus at certain Bregma level (Fig. 4c, Extended Data Fig. 13d, e) was calculated with the following steps: (1) the fluorescence intensity in each sub-nucleus (FIBregma-subnucleus) was calculated as average fluorescence in the sub-nucleus minus background fluorescence measured in a region in the sub-nucleus with no fluorescence-labelled vagal纤维；（2）测量每个亚核（abregma-subnucleus）的面积；（3）总荧光（TFBREGMA）计算为σ（Bregma，subnucleus）（fibregma-subnucleus×abregma-subnucleus）；（4）在特定七核下的亚核的支配百分比（PI）计算为fibregma-subnucleus×abregma-subnucleus/tf×100。vSNS在各种粘性器官中标记的VSN之间的相关差异（扩展数据图13F）均均为fip as s fip as s fip sucme（所有Subnuci）（所有Subnuci c celecrape carnucie）（所有Subnuci c c c c c c celecrane fip carnucie carnucie calucie calucie（均为所有子量）。1 - PIPATHWAY 2）2和基于MATLAB中的Seqlinkage函数的相关方差矩阵生成系统发育树。 　　所有统计分析均使用GraphPad Prism 8进行。所有数据均报告为平均值±S.E.M.除非具体提及。确定对比较的显着性，并使用两尾学生的t检验报告了P值。首先使用单向方差分析确定多个比较的显着性，然后使用Tukey的多重比较测试报告了调整后的P值。 　　样本量代表用于实验和数据分析的小鼠数量，这是根据结果的一致性确定的。我们的结果中没有观察到个体间的可变性，这表明样本量足以证明发现。图例和方法中报告了精确的小鼠数量。该研究没有报告治疗组和对照组之间的对比，因此不适用随机分组。为了进行测序和追踪实验，没有治疗和对照组，也没有关于分子身份的假设。因此，盲目不适用。 　　在多只小鼠中独立重复代表性的图像和实验，其结果相似：图2D，Puncta板：胃（n = 4），心脏（n = 3）；静脉曲张：心脏（n = 5），主动脉（n = 6）;PIMA：结肠（n = 3），心脏（n = 6）;CIMA：胃（n = 4），食道（n = 3）;上皮：胃（n = 4），肺（n = 5）;芽：肺（n = 5），食道（n = 3）;扩展数据图1a，n = 3;扩展数据图1f，n = 2;扩展数据图1H，i，n = 3;扩展数据图1K – q，n = 3;扩展数据图1R，n = 2;扩展数据图1S，t，n = 3;扩展数据图1V，n = 2;扩展数据图1W，n = 4;扩展数据图2a，n = 5;扩展数据图2B，n = 2;扩展数据图2K，L，n = 4;扩展数据图2p，n = 4;扩展数据图3C，n = 4;扩展数据图4B，食道（n = 3），胃（n = 4），十二指肠（n = 3），结肠（n = 3），主动脉（n = 6）;扩展数据图4E，n = 3;扩展数据图5a，n = 4;扩展数据图5G，piezo2（n = 9），drd2（n = 6），agtr1a（n = 3），npr2r（n = 2）;扩展数据图6E，n = 4;扩展数据图6G -K，NPY2R（n = 3），TRPV1（n = 5），P2RY1（n = 6），Agtr1a（n = 4）（n = 4），piezo2（n = 9），vglut1（n = 4），pvalb（n = 3），twist2（n = 3）;扩展数据图7G，L，P2RY1（n = 4），Calb2（n = 3），GLP1R（n = 5），VIP（n = 5），GPR65（n = 7）（n = 7），SST（n = 5），agtr1a（n = 12）;扩展数据图8C，GLP1R（n = 3），agtr1a（n = 4）;扩展数据图8G，TRPV1（n = 4），agtr1a（n = 3）;扩展数据图8O，p，nts（n = 5），trpv1（n = 3），agtr1a（n = 4），gpr65（n = 3）;扩展数据图9a，e，f，n = 5;扩展数据图10a，n = 5;扩展数据图13A，肺（n = 3），心脏（n = 3），食道（n = 2），胃（n = 3），十二指肠（n = 3），结肠（n = 3），胰腺（n = 3）；扩展数据图14，所有组的n = 3。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。