Rubisco生化景观的地图

　　我们将大肠杆菌TOP10细胞，DH5α和NEB涡轮细胞的组合克隆。使用BL21（DE3）进行蛋白质表达。以前从BW25113菌株产生ΔRPI。从Keio Collection获得了RPIB淘汰赛。RPIA和EDD基因通过P1转导和随后使用PCP20的Kanamycin标记固化（参考文献32）将其淘汰。这三个敲除ΔRPIABΔEDD的结果为ΔRPI。EDD缺失使Rubisco菌株依赖于葡萄糖酸盐，这是我们在这项研究中没有使用的功能。 　　可以在补充数据3中找到有关本研究中使用的质粒的序列和更多细节。 　　Rubisco突变库在标准的PUC19载体中组装。该质粒用作11个亚图上连接目的地位点中的每一个。 　　使用为这项研究设计的质粒进行选择，该研究具有p15起源，氯霉素耐药性，控制rubisco表达的LACI，TERTON CONTRONS PRK表达和条形码。 　　在BL21（DE3）细胞中使用PET28在表达基因6的上游的PET28中进行蛋白质过表达。PSF1389是从胸臂式升天的质粒表达必要的Sumolase，BDSENP1的质粒。 　　所有引物均从IDT购买，寡核苷酸池购自Twist Bioscience。有关序列，请参见补充数据3。 　　R. rubrum rubisco序列对大肠杆菌进行了高度优化，并通过扩展数据中概述的方案系统地突变。对于每个碎片（大约200个碱基对（BP）），所有点突变体均设计并合成为寡核苷酸池。Eleven oligo sub-library pools, containing all single mutants within their respective region of around 200 bp, were purchased from Twist Bioscience and each sub-library was amplified individually using Kapa Hifi polymerase with a cycle number of 15. Each rubisco gene fragment was inserted into a corresponding linearized pUC19 destination vector, containing the remainder of the rubisco sequence flanking the insert, through golden gate集会。该组件产生了全长R的11个亚圆柱。Rubrumrubisco基因，每个亚图元包含大约200 bp的区域，包括所有单个突变体。这11个Rubisco库中的每一个都分别转换为大肠杆菌Top10细胞，在每种情况下，从琼脂板上刮下了10,000多个转化器，以确保在每个亚元素中对大约1,000种变体进行过度采样。从每个亚图木中纯化质粒，并以相等的摩尔比混合在一起，以产生完整的蛋白质序列文库。 　　为了产生最终的测定文库，用包括随机30核苷酸条形码的引物扩增了含有Rubisco和Prk（分别为TAC和TET诱导型）的诱导系统的选择质粒。分别用BSAI和BSMBI切割线性化的质粒扩增子和文库，并将其连接在一起并转化为Top10细胞。通过刮擦约500,000个菌落并三份转化为ΔRPI细胞来纯化质粒。这些转化在2×酵母提取物锥虫培养基中生长至对数相（光密度（OD）= 0.6），并将其作为25％的甘油储备冻结。 　　将细菌菌株在2×酵母提取物锥虫介质到饱和度中生长过夜，然后重新降低。一旦培养物达到指数生长（0.3 <od600 <0.8），将它们稀释到150μl的M9培养基中，在96孔板中，具有25μgml-1氯霉素的25μgml-1氯霉素，并指示的甲基氢二烯丙基赛和IPTG浓度为0.005或0.0005的最终OD600。在保持37°C和指定的O2和CO2浓度的同时，在火花板读取器（Tecan）中监测生长。摇动包括交替的5分钟轨道和5分钟的双轨道模式，每10分钟收集一次测量。计算长达40小时的增长率，并计算出增长率为OD600值0.001和0.01（我们曲线中最稳定的指数范围）的增长率。 　　用sacii切割质粒文库，并发送进行续集II PACBIO测序。读取被其条形码对齐和分组。对给定条形码的所有读取均对齐，并使用SamTools33获得共识序列。如果它们是WT或具有与设计库相匹配的一个突变，则将共识序列保留。骨干中的任何突变都使条形码无效。生成了一个查找表，将每个条形码与其相关的突变联系起来。本研究中描述的数据分析方法可在https://github.com/savagelab/rubiscodms上公开获取。 　　通过用添加的氯霉素（25μgml -1），甘油（0.4％），20μMIPTG和20 nm苯苯二甲酸酯稀释到5 ml M9最小培养基中，将200μl的OD稀释到5 mL M9最小培养基中，将200μl的甘油量稀释到5 ml的M9最小培养基中，从而进行选择。这些培养物在37°C的11 ml培养管中在珀西瓦尔AR-22生长室中以不同的二氧化碳浓度在新的不伦瑞克科学Innova 2000振动器上以60°的角度在250 rpm上生长。生长培养，直到在5 ml的1.2±0.2达到OD。这对应于细胞的100倍膨胀，即六到七倍。 　　选择前后的培养物被旋转，我们使用QIAPREP Spin Miniprep试剂盒（Qiagen）裂解细胞，并进行了标准的质粒提取方案。Illumina扩增子是由条形码区域的PCR产生的。使用NextSeq P3试剂盒对这些扩增子进行了测序。 　　根据条形码读数计数的对数比计算变体富集。富集计算包括两个处理参数：最小计数阈值（CMIN）和伪计数常数（αP）。计数阈值是必须观察到的条形码读数的最小数量，以便将条形码包含在富集计算中。伪计数常数用于为每个条形码计数添加一个小的正值，以通过零错误绕开划分。我们使用一个伪计值，该值由每种条件下的读取总数加权。对于第jth变体和单个条形码，i，通过阈值条件，将变体富集计算为 　　为了确定这些参数的最佳值，我们计算了CMIN和αP的二维参数扫描上的变体富集，以找到在每个条件下所有复制的最大平均Pearson相关系数的最大均值Pearson相关系数。这些是CMIN = 5，αP= 3.65×10-7（在每个实验，N0，TOT或NF，TOT中的读取总数乘以0.3个伪计数），导致相关系数为0.978。然后使用方程式（1）计算每个突变体的变体富集EJ。 　　然后将变体富集归一化，以使野生型在所有条件下的富集值为1，而催化死亡突变体的中位数为0。对于“死”变体富集，我们计算了催化位置K191，K166，K166，K329，K329，d193，e193，e194和h294和h277的所有突变的中位数富集。在每种条件下的归一化富集计算为 　　如果EJ是公式（1）中给出的jth变体的富集，则EWT是野生型富集，是上面列出的所有催化残基的突变体的中位富集。 　　使用不同CO2浓度的DMS库富集用于估计每个变体的Michaelis -Menten动力学参数。在图1E中观察到的生长速率和KCAT之间的线性关系的指导下，我们假设细胞生长速率与Rubisco酶速度成正比，以推导CO2滴定拟合（请参阅“ Michaelis -Menteren Fit的衍生”，方程（S1）） 　　是突变最大速度相对于野生型的比率，是我们使用149μm的野生型KC，是突变kc。每种变体的一式三份滴定曲线使用非线性最小二乘曲线拟合拟合（3），同时需要VMAX和KC，Mut为正。 　　我们注意到，这些变体适合某些变体（尤其是较低的变体）对加工参数CMIN和αP的选择敏感。鉴于这些参数的半竞标性质，这显然是不良的依赖性，并且对推断值的信心降低。为了解决这一不确定性，我们进行了一个参数扫描（有11个不同的CMIN值线性间隔在0到50之间，而10个αP值在1×10-9和1×10-6之间间隔为log，并计算了这些参数所有组合的变体富集。然后，我们对所有参数集进行了十项重复的子采样，并进行了比例测定法。从每个变体的这组1,100个拟合值中，我们计算了一个基于四分位数的变化系数，该系数被用作该变化的数字。 　　使用Profile HMM同源性搜索工具Jackhmmer34创建了更宽的Rubisco家族的多个序列对齐（MSA）。从R. rubrum Rubisco序列开始，Jackhmmer应用了五个搜索迭代，其位得分阈值为每个残基的位数为0.5位，与非冗余蛋白序列的UNIREF100数据库35。为了计算每个位置的系统发育保护，对于每个可能的氨基酸，我们计算了在MSA相应位置的总序列的比例。系统发育保守性是最大部分，其中最大值在所有可能的氨基酸上获取。因此，如果位置在MSA的90％的序列中具有丙氨酸，则系统发育保护为0.9。 　　用PET28（用14×HIS和SUMO亲和力标签编码所需的Rubisco）和PGRO质粒（Takara）转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞。在卡纳米霉素选择（50μgml -1）下，在100 mL的2×酵母提取物锥虫培养基中，在37°C下生长菌落，至0.3-1的OD。将阿拉伯糖（1 mm）添加到每种培养物中，然后在16°C下孵育30分钟。用IPTG（Millipore）在100μM下诱导蛋白质表达，并在18°C下过夜细胞。培养物向下旋转（15分钟； 4,000克； 4°C），并如报道6纯化。简而言之，使用BPER II（Thermo Fisher）旋转培养物并裂解。将裂解物离心以去除不溶性的部分。使用Ni-NTA树脂（Thermo Fisher）通过HIS标签纯化纯化Rubisco，并通过用BDSUMO蛋白酶（参考文献6产生）通过Sumo Tag裂解洗脱。将纯化的蛋白质浓缩并在4°C下储存直至动力学测量（在24小时内）。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳解决样品，以确保纯度。 　　KCAT和KC测量均使用相同的耦合酶混合物，其中磷酸化和随后的1,3-双磷酸甘油酸酯（Rubp羧化的产物）与NADH氧化偶联，可以遵循340-NM的吸收率。遵循Kubien等人36和Davidi等人6，反应混合物（扩展数据表1）在100 mm处包含缓冲液，pH 8，20 mm mgcl2，0.5 mm Dithiothreitol，2 mm ATP，2 mm ATP，10 mm肌酸磷酸盐，1.7 mm nadh，1 mm nadh，1 mm Edta和20 u mm eDta和20 u ml -13-磷酸​​甘油醛脱氢酶和肌酸磷酸激酶。反应量为150μl，在吸光度测量开始之前，样品被摇动一次。在具有O2和CO2对照（TECAN）的火花板读取器上收集吸光度测量。通过已知浓度的NADH溶液的标准曲线（由具有标准1-CM路径长度的NADH溶液的标准曲线（由标准的1-CM路径长度，Thermo Fisher确定），NADH的灭绝系数是通过NADH溶液的标准曲线确定的。随着时间的流逝，吸光度下降会产生NADH氧化的速率，因此会产生羧化速率。由于Rubisco为每个羧化反应产生两个3-磷酸甘油酸的分子，因此我们假设NADH氧化速率与羧化速率的比率为2：1。 　　使用以前建立的方法测量每个Rubisco的羧化速率常数（KCAT）6。简而言之，在室温下以CO2（4％）和O2（0.4％）的培养孵育15分钟，将Rubisco激活15分钟，并添加（最终浓度为80 nm），以适当稀释的测定混合物（扩展数据表1）含有不同的2-羧酸含量-1arabinitol-1,5-磷酸盐（CABP）浓度的plate pritecan Ateribratible（cabp）的浓度（cabp）读取（cabp）读取（cabp）的读数（cabp）读取（cabp）读取（cabp）读取（cabp）的读数为1,5-含量为iff（cabp）读取（cabp）的读数。30°C，在相同的气体浓度下。15分钟后，将RUBP（最终浓度为1 mm）添加到反应混合物中，并测量340 nm处的吸光度以量化羧化速率。线性回归模型被用来绘制反应速率与CABP浓度的关系。通过将Y截距（反应速率）除以X截距（活性位点的浓度）来计算KCAT。一式三份纯化蛋白以确定KCAT。 　　激活纯化的Rubisco突变体（40 mM碳酸氢盐和20 mM MGCL2），并与测定混合物一起添加到96孔板中（扩展数据表1，在这种情况下，使用了相同的Hepes pH 8缓冲液，但可以替代EPP）。添加碳酸氢盐的浓度范围（1.5、2.5、4.2、7、11.6、19.4、32.4、54、90和150 mm）。在室温下以0.3％O2和0％CO2进行预衡的板和摩擦。将RUBP添加到最终浓度为1.25毫米的最终浓度中，水作为每个重复的对照。NADH氧化是通过KCAT分析中的A340测量的。使用自定义脚本对吸光度曲线进行分析，以执行超参数搜索，以选择一个正方形，以将坡度作为羧化速率，最能代表A340中大多数单调降低。通过使用非线性最小二乘法拟合Michaelis-Menten曲线来得出KC。根据重复确定误差线：（1）多天重复：Michaelis -Menten fit fit s.e. S.E.基于这些拟合，计算中位数。（2）一式三份：适合使用不同的超参数提取初始速率的吸光度数据，随后使用这些拟合的中位数。根据技术重复的基础，计算了三组不同的初始费率：一组基于中位吸光度值，一组基于中位数减去S.D.，另一个基于中位数和S.D。Michaelis – Menten适合这三组计算的速率，错误条显示了低边界，中间和高边界组之间的差异。 　　km，rubp的确定方式与KCAT和KC相似。使用RUBP浓度的滴定来在5％CO2和0.5％O2的大气下产生速率饱和曲线。简单的线性回归用于适合吸光度衰变。KM，RUBP是通过使用非线性最小二乘法拟合Michaelis-Menten曲线来得出的。从拟合过程中从协方差矩阵的对角线的平方根确定误差。分光光度测定的值在图3F和扩展数据图中报告。6b，d和9b。 　　如参考文献所述，进行了14CO2固定测定法。6进行较小的修改。测定缓冲液（100 mM epps-naOH pH 8，20 mm mgcl2，1 mm EDTA）用N2气体播放。如上所述纯化的Rubisco在测定缓冲液中稀释至约10μm（使用紫外吸光度定量）。然后将其用一量含有40 mM NAH14CO3的测定缓冲液稀释以激活。在25°C的7.7 mL隔层玻璃闪烁小瓶（Perkin-Elmer）中，用100μgml-1碳氧藻酶，1 mM Rubp和NAH14CO3浓度在25°C下进行反应（0.5 mL）。该测定是通过添加20μl活化的Rubisco来启动的，并在2分钟后通过添加200μl50％（v/v）甲酸停止。 　　通过在含有10 nmol的RUBP的最高14CO2浓度下进行1小时测定14CO2的比活性。将反应在热块上干燥，重悬于1毫升水中，并与3 ml Ultima Gold XR闪烁剂混合，以用hidex闪烁柜台进行定量。 　　[14C] -2-CABP结合测定法对每种测定中使用的Rubisco活性位点浓度进行了量化。在含有40 mm冷NAHCO3（最终体积100μL）的测定缓冲液中激活了大约10μMRubisco溶液的10μl样品，至少10分钟。然后，加入1.5μl的1.8 mm 14c-羧苯甲醇双磷酸盐并在25°C下至少孵育1小时。[14C] -2-CABP结合的Rubisco通过尺寸排除色谱法（Sephadex g-50罚款，GE Healthcare）与游离[14C] -2-CPBP分离，并通过闪烁计数进行量化。 　　使用在不同日期执行的三到四个实验的串联数据适合Michaelis -Menten方程。该测定法用于确定图4C和扩展数据中的值图9C。 　　参考文献中描述的方法。37适用于膜入口质谱（MIMS）仪器（凸仪）。通过测量大气O2和“零” O2处的32 m/z离子来校准O2离子信号。通过平衡MIMS缓冲液（200 mM HEPES pH 8，100 mm NaCl，20 mM MGCL2），在25°C下持续1小时，可以实现大气O2校准剂。通过将大约5 mg na2s2O6添加到比色杯时，确定了“零” O2离子信号。通过将各种量的NaHCO3添加到100 mM HCl的溶液中并记录44 m/z离子信号来校准CO2。在这两种情况下，离子计数的线性拟合到气体浓度都提供了一个简单的转换，以确定气体浓度和消耗率。这些校准必须在使用测定法的每一天进行。 　　Rubisco酶在20 mM HEPES pH 8、100 mM NaCl，20 mM MGCL2和20 mM NaHCO3中激活。将活化的酶添加到630μl用空气平衡的MIMS缓冲液，浓度为1.2μm。在最终浓度为0.3 mg ml -1中加入牛碳酸酐酶（Sigma Aldrich），将NAHCO3添加到最终浓度为4 mM中。将反应在密封的MIMS反应室中搅拌大约2分钟，以收集预反应信号。通过添加2 mM rubp开始反应。O2和CO2的消耗速率是通过校准的转换来校正的，并使用校准期间确定的系数转换为反应速度。通过以下公式一式三份确定特异性：sc/o =νc[o2]/νo[dic]，其中dic是溶解的无机碳池。 　　具有野生型Rubisco的ΔRPI菌株在选择性条件下生长（在M9培养基中在37°C下过夜，甘油和20 nm ATC在M9培养基中，IPTG浓度在5％CO2下变化24小时。之后，将浊度培养物离心（10分钟； 4,000克； 4°C），每个样品大约20 mg颗粒。用200μl的bper II裂解球体，并将上清液转移到新的管中，并与SDS载荷染料混合。用于透射式涡轮低荧光PVDF的Bio-Rad RTA转移试剂盒与Trans-blot涡轮转移系统结合使用。使用剃刀刀片小心地将PVDF膜仔细切割在50至70 kDa之间。分别孵育了来自Agrisera（1：10,000）（1：10,000）的初级抗RBCL II大亚基II抗体和ABCAM的DNAK抗体（1：5,000）。DNAK（Santa Cruz Biotechnology）和山羊PAB的二级辣根 - 过氧化物酶偶联的抗体抗小鼠抗小鼠抗小鼠抗体抗体，用于RB IgG IgG辣根过氧化物酶（ABCAM（ABCAM）均为1：10,000）。随后，应用了生物rad Clarity Max Western ECL底物，并使用GELDOC（Bio-Rad）对最终结果进行成像。 　　I190T（图1E）是我们比较文献和适应性数据的体外KCAT测量值的唯一离群值。由于该值是没有误差估计值38的，因此我们重新测量了该突变体的KCAT，发现其为4.24 s-1，是野生型值的52％，低于先前报道的80％。尽管如此，与其余趋势相比，该值似乎是异常的（扩展数据图6B）。一种潜在的解释是，该位置的突变对蛋白质表达具有强大的负面影响。鉴于I190T与关键活性位点赖氨酸K191相邻的另一种可能性是，I190T对赖氨酸甲酰胺产生负面影响，这是由于某种原因在体内比体内更明显的。 　　遵循Stiffler等人20，我们假设细菌生长速率的差异与生长限制酶活性的差异成正比。 　　在对数相增长的推定下，经过时间t后的读取的预期对数比率，并标准化为野生型读数。 　　（请注意，等式（S2）还将包含一个归一化因素，以说明在选择前和选择后条件获得的读取总数。但是，这是突变体和野生型计数的共同因素，因此可以取消计数，因此可以取消实际分析。实际上，实际上还包括在此中省略的次数，用于拟议中的适应性，以实现的范围，以实现的范围，以实现的范围。是，和简化的产量， 　　为了使富集归一化，我们除了相对于具有突变的催化残基的变体的中位数（从而催化死亡的Rubisco）的野生型计数的对数富集。然后，我们为惯例添加一个，即死亡变体以0的富集为中心，而野生型的富集为1。因此，归一化的突变体富集是， 　　然后替换方程（S3），我们获得了 　　使用等式（S1）中的假设以及死亡突变体的酶速度为0的事实，我们获得了预期的归一化富集，这是Rubisco速度的函数， 　　最后，使用Michaelis -Menten方程，我们获得了预测的富集作为CO2浓度和酶动力学参数的函数。 　　因此，在实践中，我们使用方程式（S7）作为在一系列二氧化碳浓度范围的每个变体的归一化富集值的拟合方程。对于每个拟合参数，我们都具有突变体和野生型之间的最大速度比例，vmax，mut/vmax，wt和野生型KC与文献值为149μm的突变体KC之比。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。