共vid-19中的不合时宜的TGFβ响应限制了NK细胞的抗病毒功能

　　研究参与者的招聘得到了Charité机构审查委员会的批准（EA2/066/20，EA2/072/20，EAEA4/014/20和EA2/092/20）。所有患者或法律代表都提供了书面知情同意，以参与​​研究。45例Covid-19（世界卫生组织（WHO）疾病严重程度为1和2，根据WHO临床序列量表），有21名住院患者（3-4）患有中度Covid-19和79名患有严重Covid-19的患者，他们需要经过曝光（WHO 5-7，52）根据这一良好的呼吸道遇险综合综合症，该研究均应遵守这一症状。通过鼻咽拭子，所有Covid-19患者的SARS-COV-2 RNA呈阳性。有20例出现类似流感症状但SARS-COV-2（FLI）阴性的患者，总共有96名不存在病毒感染临床迹象的健康供体作为对照。所有参与者的临床特征总结在补充表1-3中。为了进行尸检，下一个亲戚给予了知情同意，并根据《柏林尸检法》和《德国感染保护法》第25（4）条进行了尸检。验证后组织的测序得到了Charité的伦理委员会（EA2/066/20，EA1/144/13和EA1/075/19）和Charité-Bih Covid-19委员会的批准，并遵守了赫尔辛基的宣布。《柏林医院法》第25条涵盖了匿名临床数据的额外使用，不需要进一步的道德或法律许可。 　　从每个供体的外周血中抽到EDTA收集管中，对于选定的样品（CD107A分析），将外周血抽入肝素管（BD Biosciences）。PBMC通过Pancoll人（Pan-Biotech）密度在室温下离心。细胞直接用于分析，或者在热灭活的胎牛血清（FCS; Pan-Biotech，P30-3602）中以10％的二甲基硫氧化物在-80°C下进行分析前，然后分析前，在分析之前。从每个供体中抽取血清样品中的空泡SSTTM管（BD Biosciences），在2,000g下离心10分钟，并在分析前以-20°C储存。 　　根据制造商的指示，将PBMC与FC阻塞试剂（Miltenyi Biotec）一起孵育。为了排除死细胞，使用活/死（LD）可固定的水上死细胞染色试剂盒（Thermofisher，L34965）对细胞进行染色。对于表面抗原染色，将细胞与单克隆抗人类抗体（补充表4）在4°C下孵育20分钟。在转录因子，细胞毒性分子和细胞因子的细胞内染色之前，应用了FOXP3转录因子染色缓冲液集（EBISOSCIENT，00-5523-00）。使用FACS Fortessa X20（BD Biosciences）分析样品。使用FlowJo软件v.10.3（Treestar）分析数据。将NK细胞种群的平均荧光强度（MFI）值标准化为谱系阴性标记 - 阴性细胞的MFI42。对于IFNγ（Biolegend，502527）和TNF（Biolegend，502908）的细胞内细胞因子染色，在37°C下在Brefeldin a（Sigma-Aldrich）的存在下，在37°C刺激NK细胞在37°C下进行4 h（500 ng ML – 1，Sigma-Aldrich）。另外，将NK细胞与K562靶细胞（美国型培养物收集（ATCC）CCL-243，通过ATCC验证）在37°C下进行4 h验证，在Brefeldin A.存在的情况下，在补充表4中，所有抗体均列出并分配给每个抗体，以使每个抗体均为b，c，c，c，c，c，d和e efter exterry均为exterry efter eftery efter nefip exterry extery eftersem，均为替代词，均为替代效果。列出的补充表1-3。 　　Frozen PBMCs were gradually thawed at 37 °C and resuspended in RPMI medium (Gibco, 31870074) supplemented with 20% heat-inactivated FCS (Pan-Biotech P30-3602), -glutamine (200 mM, Gibco, 25030081), penicillin–streptomycin (10,000 U ml–1, Gibco,5140122）和庆大霉素（Lonza Biowhittaker，BW17-519L）。使用活细胞使用活/死固定的水上死细胞染色套件（Thermofisher，L34965）进行区分，并根据制造商的说明在人FC阻断试剂（Miltenyi Biotec）中孵育。将细胞用以下抗人类抗体染色20分钟，在4°C：CD3（Ebiososcience，11-0039-42），CD4（Ebioscience，11-0048-42），CD14（Biolegend，325604），325604），CD19（Biolegend，3633008），CD45（3633008），39340，3940，39340，39340，39340，39340，39340，39340，39340，39340，39340，3940，3940，3940。（Biolegend，343119）和CD56（Biolegend，362511）。使用FACS ARIA II Cell Sorter（BD Biosciences），将NK细胞分为LD -LIN - （CD3，CD4，CD14和CD19）CD45+CD7+CD56+。 　　Sorted NK cells were cultured in RPMI containing rh-IL-12 (20 ng ml–1; PeproTech, 200-12H), rh-IL-15 (20 ng ml–1; PeproTech, 200-15), rh-TGFβ (10 ng ml–1; PeproTech, 100-21), rh-IFNα (10,000 U ml–1; R&D Systems, 11100-1) orRH-IFNβ（20 ng ML; R＆D系统，MAB1835-SP）在37°C下培养2-4天，并如图5％CO2培养。 　　如前所述43进行了铬释放测定。简而言之，将完整的PBMC在补充RH-IL-12和RH-IL-15的RPMI中培养过夜。对于选定的分析，添加了RHH-TGFβ。使用流式细胞仪确定PBMC馏分中的NK细胞频率。通过将2×106 K562细胞与450 µL RPMI中的2×106 K562细胞与50 µL的51CR（CR-RA-8，CR51，185 MBQ，5 MCI ML – 1）中孵育2 h，在37°C的旋转器上，将K562靶细胞在450 µL RPMI中孵育2 h。标记后，将目标细胞用RPMI洗涤两次，然后在指定的NK细胞上添加PBMC：目标细胞比率（9：1，3：1，1，1，1：1或1：3）。在共培养4小时（37°C与5％CO2）的共培养后，收集上清液，并使用Wallac Wizard 1470伽马计数器对释放的51CR释放。为了量化每个实验的最大51CR释放，仅从标记的靶细胞的伽马信号中减去了无效细胞培养的靶细胞上清液的伽马计数（自发51CR释放）。为每个样品计算了3：1 NK细胞中NK细胞诱导的NK细胞诱导的NK细胞诱导的51CR释放百分比的百分比。 　　如先前所述44（共识方案的协议2），测量了PBMC馏分NK细胞上的CD107a表达。简而言之，在RPMI中以2×106 mL – 1的培养PBMC过夜。随后将NK细胞与K562细胞共培养2小时，并对CD107A（Ebioscience，11-1079-42），CD56（Beckman Coulter，A82943），CD8（Beckman Coulter，IM2469），CD3（Beckman Coulter，A94680）和CD45（B3945（B3），B3945（B3），B3945（贝克曼·库尔特（Beckman Coulter）），B3945（Bec​​kman Coulter，IM2469）（Beckman Coulter，IM2469）（Beckman Coulter，by）和CD56（Beckman Coulter，IM2469）（Beckman Coulter）（Beckman Coulter），B1在Navios-EX FACS（Beckman Coulter）上分析了样品。使用Navios 2.0软件分析数据。CD107A在RPMI中培养的分类NK细胞（如“分类NK细胞的体外培养”部分中所述，并补充了RH-IL-12，RH-IL-15和RH-TGFβ，在2：1 NK细胞：2：1 NK细胞：2：1 NK细胞率的K562细胞后共培养后，分析了2：1 NK细胞：4小时的K562细胞。Subsequently, cells were re-stained using a Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit, human Fc blocking reagent and the following antibodies: CD3 (eBioscience, 11-0039-42), CD4 (eBioscience, 11-0048-42), CD14 (BioL​​egend, 325604), CD19 (BioL​​egend, 363008), CD45 (BioL​​egend,393409），CD7（Biolegend，343119），CD107A（BD Bioscience，562622）和CD56（Biolegend，362511）。使用FACS Fortessa X20（BD Biosciences），在LD – Lin - （CD3，CD4，CD14和CD19）中确定CD107a表达的频率。 　　NK细胞：如前所述评估靶细胞粘附45。简而言之，如上所述，通过密度梯度将PBMC与外周血分离。根据制造商的说明，使用NK细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）通过阴性选择富含细胞。隔离后，根据制造商的说明，使用细胞Trace远红细胞增殖试剂盒（Invitrogen，C34564）将NK细胞标记20分钟。用细胞增殖染料（Invitrogen，65-0842-85）将K562靶细胞在37°C下标记10分钟。标记后，将细胞用RPMI洗涤，在1：4 nk细胞中混合：靶细胞比，并在300g下离心1 s。在通过流式细胞仪定量结合之前，将细胞在37°C下共培养1小时。 　　如上所述，通过密度梯度从新鲜抽取的外周血分离PBMC。根据制造商的说明，使用NK细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）通过阴性选择富含细胞。通过流式细胞仪确保富集。分离后，在补充了RH-IL-12（Peprotech，200-12H），RH-IL-15（Peprotech，200-15）和Rh-TGFβ（Peprotech，100-21）的RPMI 1640中，将NK细胞刺激为24-48 h。将NK细胞用DMEM洗涤，并与SARS-COV-2感染的Vero E6细胞（Cercopithecus aethiops肾上皮细胞； ATCC CRL-1586，通过ATCC）或Calu-3细胞（人支气管上皮细胞； ATCC HTB-55验证），ATCC HTB-55，ATCC ATCC验证。如前所述，在感染前24小时，将大约175,000个Vero E6细胞和300,000 Calu-3细胞在24孔板中播种。 　　For masking experiments, NK cells were incubated with the neutralizing antibodies anti-NKp30 (clone F252), anti-NKp44 (clone KS38), anti-NKp46 (clone KL247), anti-NKG2D (clone BAT221 and clone ON72), anti-DNAM-1 (clone F5) and anti-2B4 (clone CO54)在室温下45分钟前共培养，如所示。对于所有阻断实验，将靶细胞与抗HLA-I一起孵育（克隆A6/136）。E. Marcenaro（意大利热那亚大学）提供了单克隆抗体。 　　Cells were infected with the SARS-CoV-2/München 984 virus isolate (B.1 lineage, hCoV-19/Germany/BY-ChVir-984/2020, accession ID: EPI_ISL_406862; Pango lineage v.3.1.1, lineages v.2021-06-15) or the variant B.1.351（HCOV-19/德国/BW-CHVIR22131/2021，登录ID：epi_isl_862149）在细胞培养通道2（参考46）上，感染（MOI）为0.001（MOI）为0.001（VERO E6）或MOI（CALU-3）。将病毒在无血清培养基（Thermo Fisher）中稀释。为了感染，除去上清液，将细胞用0.5 mL PBS（Thermo Fisher）冲洗一次，并在37°C的细胞上接种1小时，将含有病毒的稀释液冲洗1 h。接下来，感染后12小时增加了500 µL NK细胞悬浮液。添加NK细胞后，收集粘附细胞12小时（VERO E6）或24小时（Calu-3），以分离病毒RNA。为了分离病毒RNA，将35 µL的Magna Pure 96外裂解缓冲液（Roche）添加到粘附细胞中。将所有样品在70°C下热灭活10分钟。根据制造商的建议，使用Magna Pure 96系统（Roche）进行病毒RNA的隔离和纯化。如前所述47，使用具有逆转录（RT – PCR； E Gene分析）的实时PCR对病毒RNA进行定量。所有感染实验均在生物安全3级条件下进行，并具有增强的呼吸道个人保护设备。 　　如前所述48，基于病毒RNA拷贝和RT -PCR循环阈值值的校准曲线获得了病毒载荷（RNA副本）测量值。为了检查颞病毒负荷动力学，包括至少两个病毒载量测量和两个免疫细胞计数测量的患者，并计算了线性回归。两个参数的最大偏移量设置为7天，仅考虑持续时间少于40天的感染。使用Seaborn（RegPlot）软件包V.0.11.1和Scipy（Stats.linregress）软件包（v.1.6.0）进行回归分析。对于指定的分析，根据其第一个免疫细胞计数的值低于或高于阈值的值，将患者分类为低还是正常的绝对免疫细胞计数。使用以下阈值：每µL 40个NK细胞；每µL 40 B细胞；每µL 360 T细胞；每µL 200 CD4+T细胞；每µL 300 CD8+T细胞；每µL 600个淋巴细胞（CD45+CD14-）。对测试阳性（通过SARS-COV-2 RT – PCR）的住院患者进行了分析，其中包括在感染期间任何时候在重症监护病房病房中测试阳性的患者，包括研究队列中严重的COVID-19患者（扩展数据图1，补充表3）。 　　来自13例严重Covid-19（52个样本）患者的冷冻PBMC，症状发作后第2天到第68天，有11例Covid-19（11个样本）的救护车患者（补充表1-3）和5个健康供体（补充表1-3）和在RPMI中取消了FC，并在RPMI中取代了FC，并取代了20％的补充，并取得了20％的补充。根据制造商的说明，试剂（Miltenyi Biotec）。用以下抗人类抗体染色每100 µl多达1×107个细胞：CD3（Miltenyi Biotec，130-113-133），CD14（Miltenyi Biotec，130-113-152），CD19，CD19（Miltenyi Biotec，Miltenyi Biotec，130-113-172），CD4和CD4和3045（304）（304）（304）（304），Biotec，130-113-305）。为了允许细胞汇总，每个样品还与八个不同的总Seq-c抗人类主题标签之一（LNH-94; 2M2; 2M2，barcoded，biolegend，394661，394661，394663，394665，394665，39467，39467，39469，39469，39469，394671，394673孵育）孵育。在分类之前添加4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）以使死细胞排除。将NK细胞鉴定为DAPI – CD3 – CD14 – CD19 – CD45+CD56+。所有分数都使用MA900多施加细胞分选项（Sony Biotechnology）。使用MacSquant流式细胞仪（Miltenyi Biotec）进行细胞计数。进一步处理分类的NK细胞以进行SCRNA-SEQ。 　　为了生成NK细胞特异性的TGFβ-响应数据集，使用生命/死固定的Aqua死细胞染色试剂盒（Thermofisher，L34965）歧视解冻的PBMC中的活细胞在人体FC阻断试剂（Miltenyi Biotec）（Miltenyi Biotec）中孵育。将细胞用以下抗人类抗体染色20分钟，在4°C：CD3（Ebiososcience，11-0039-42），CD4（Ebioscience，11-0048-42），CD14（Biolegend，325604），325604），CD19（Biolegend，3633008），CD45（3633008），39340，3940，39340，39340，39340，39340，39340，39340，39340，39340，39340，3940，3940，3940。（Biolegend，343119）和CD56（Biolegend，362511）。使用FACS ARIA II Cell Sorter（BD Biosciences），将NK细胞分为LD -LIN - （CD3，CD4，CD14和CD19）CD45+CD7+CD56+。在含有RH-IL-12和RH-IL-15的RPMI中培养排序的NK细胞，在37°C下，在SCRNA-SEQ之前，在37°C下4天，在37°C下培养4天。 　　用于细胞捕获和SCRNA基因表达（GEX）的10倍基因组学工作流，使用铬单细胞5'库和凝胶珠套件和单个细胞5'特征条形码库套件（10x基因组学）应用于分类的NK细胞。使用单个索引试剂盒A集合A片段化，适配器连接和最终索引PCR获得最终GEX A。使用A量子HS DNA测定试剂盒（Life Technologies）进行库定量，并使用使用HS NGS片段（1-6,000 BP; Agilent）使用碎片分析仪确定片段大小。使用高输出V2试剂盒（150个周期）在NextSeq500设备（Illumina）上进行测序，并具有5​​'GEX库的推荐测序条件（读取1：26 NT，读取2：98 NT，INDEX 1：8 NT）。 　　使用CellRanger-3.1.0处理铬单细胞数据。MKFASTQ和计数管道用于默认参数设置中进行反复进行反复，将读取与reddata-cellranger-HG19-19-1.2.0基因组，条形码和唯一分子标识符（UMI）计数以及完整细胞的调用。预期细胞的数量设置为3,000。使用Seurat r包装（V.3.1.1）49进行了进一步的分析。使用八个Cite-Seq主题标签（TotalSeq-C，Biolegend）分离合并的样品。假定特定主题标签的30％CITE-seq读取的细胞被假定为正面染色。从进一步分析中删除了无（不确定的原点）或矛盾分配（双重）的细胞。如先前所述50，对健康供体，Covid-19和严重COVID-19患者的NK细胞，COVID-19和严重COVID-19患者的转录组轮廓进行了标准化并整合。检测并缩放可变基因。使用比例数据，RUNPCA和RunuMAP在默认参数设置中缩放数据，并使用30个主组件进行unpca和RunuMap。通过目视检查线粒体基因的分数，检测到的基因数量和每个细胞的UMI计数，进行质量控制。未观察到明显的异常。转录相似的细胞使用共享最近的邻居（SNN）模块化优化聚类，SNN分辨率为0.2。使用findallgenes鉴定了簇的标记基因，其对数折叠变化> 2.5，最少为0.1表达细胞。先前出版物16,20,51告知了用于手动群集功能的手动注释的基因。六个簇中有一个揭示了B细胞特异性和单核细胞特异性基因（CD19，CD14），并被排除在进一步分析之外。 　　使用MonoCle2 R软件包进行了假轨迹分析。将每组的细胞（健康，救护物和严重的Covid-19）随机下采样至3,871个细胞。总体11,613个细胞用于单封管中的计算。在五个簇中的前1,000个差异表达的基因（由最低Q值排名）用于订购细胞。光束方法用于识别分支点22中表达水平显着差异的基因。 　　除了聚类和轨迹分析步骤外，使用模拟工作流程分析了从存在和不存在TGFβ的NK细胞中得出的单细胞数据。TGFβ响应特征是根据接受和未经TGFβ处理的样品之间差异表达的基因定义的。为了比较样本，将两侧Mann-Whitney U检验用于对数符号计数。鉴定出差异表达的基因（调整后的P≤0.05，富集的对数折叠变化> 2.2，耗尽<2.2）。差异表达基因的热图基于Z转化的对数差异计数的方式。使用欧几里得距离和病房连锁标准进行层次聚类。所有生成的测序数据都沉积在NCBI基因表达综合（登录号GSE184329）中。 　　从公共可用的PBMC单细胞测序数据集（GSE149689）中提取NK细胞数据，该数据集由来自健康参与者的4个样本组成，来自COVID-19的患者的11个样本以及来自严重流感的患者的5个样本。在第一步中，将单个样品和59,572个细胞整合在一起，并将SNN分辨率为0.1的UMAP表示中，并将其细分为10个簇。细胞型定义基因的热图用于鉴定来自PBMC的10,604个NK细胞。如下所述，对TGFβ诱导的NK细胞基因进行了GSEA进行。 　　公开可用的肺单核数据集（欧洲基因组 - 酚类存档参考ID：EGAS00001004689）由三名因肺炎死亡的患者组成的患者与肺炎无关，他们与Covid-19（作为对照组）无关（作为对照组），并因COVID-19与COVID-19与COVID相关的肺炎肺炎31的转换为HG19参考，该参考是HG19参考。序列ID：NC_045512）使用CellRanger v3.0.1（10x基因组学）。用Soupx（V1.4.5）52进行环境RNA去除。First, the 10 samples and 53,709 cells were integrated as previously described50 for the NK cell single-cell sequencing dataset and subdivided into 33 clusters in a UMAP representation with a SNN resolution of 1. A heatmap of 13 genes was used to identify NK cells from the lung, and cluster 25 was defined as the NK-cell-specific cluster of 845 cells.根据Gassen等人31，鉴定出其余的细胞群体。 　　根据对数n伸数计数的差异，使用1,000个随机化分析的所有细胞的平均值（错误的发现率<0.5 <0.5和归一化的p <0.2）53，对每个单元进行了GSEA。为了可视化，绘制了指定基因集合（上调或下调）内每个细胞的归一化富集评分。从分子特征数据库（MSIGDB，v.6.2）54,55获得基因集（Hallmark，Reactome和Kegg）。NK细胞特异性TGFβ反应基因集在本研究中是新生成的。在肺部组织居民NK细胞中，TGFβ抑制基因的GSEA-富集图（得分曲线）是在表达细胞的中位数之间在其他默认参数设置中表达细胞的中位数进行的。仅考虑在至少一组中表达的基因。如果未发现表达细胞，则中间设置为0。 　　在含有IL-12，IL-15和IL-2（25 ng ML – 1; peprotech，212-12）的RPMI中培养来自健康供体的NK细胞48小时，如所示，另一个健康供体（补充表1）或患有严重的COVID-COVID-COVID-COVID-19（补充餐桌3）的血清的20％和20％。除非另有说明，否则使用IL-12，IL-15和血清。对于指定的实验，将患者血清与针对TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3（R＆D Systems，MAB1835-SP）的抗体预孵育，抗IL-6（5 µg ML – 1; R＆D Systems，MaB206），MAB206，MAB206，MAB206），Anti-IL-10（30 µG ML＆D Systems），或MAB＆D Systems，Mab217，MaB2217，Mab2217（5 µg mL; ebioscience，16-0157-82）在添加到培养物和使用相同的培养条件下，如图10分钟所示。48小时后，测量了T-bet的蛋白表达水平，使用流式细胞仪或病毒复制在4小时与K562细胞共培养后，分析了NK细胞中CD107a表达的频率，如上所述。 　　使用基于珠的多重细胞因子阵列（人类细胞因子25-Plex Procartaplex面板1B，Thermo Fisher Scientific）测量细胞因子水平。在测定之前，将血清样品在提供套件的稀释缓冲液中稀释1：3。使用人类TGFβ1单纯胶囊试剂盒（Thermo Fisher Scientific）检测到TGFβ。在测量血清TGFβ1之前，通过将血清与1 N HCl孵育，然后根据制造商的说明将TGFβ1的生物活性形式与1.2 N NaOH进行中和。将样品与抗体涂层的磁珠一起在室温下孵育30分钟，然后在4°C下孵育过夜，然后在室温下孵育1小时。随后的所有孵化步骤均根据制造商的说明进行。使用Luminex Magpix系统读取测定板，并使用Xponent Analysis软件（Luminex）进行量化。根据制造商的说明，使用SIMOAIFNα优势试剂盒（Quanterix）分析IFNα血清浓度。 　　所有统计测试均用图形PAD PRISM V7软件进行，如每个分析所示（*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001和****p≤0.0001; ns; ns，不重要）。至少三个独立实验的代表性数据如图2和图2所示。1d，e，g，2f和4c，f和扩展数据图。15a，b，c，d。扩展数据中显示了两个独立实验的代表性数据图​​15J，k，n，o。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。