深视觉蛋白质组学在遗传肝病中绘制蛋白质毒性

　　在两个不同的地点，Odense University Hospital（OUH）和Aachen RWTH University Hospital（UKA）中获得了患者活检和外植样样品。样本起源在补充表1中指示。按照道德准则，通过仅报告样本类型，纤维化评分和原点位点，可以通过识别此处提供的临床数据。 　　作为一项队列研究的一部分，通过丹麦患者组织（ALFA-1丹麦）和临床部门招募患者。该队列旨在调查被诊断为任何基因型和载体状态的AATD的非怀孕成年人（最低年龄18岁）的肝脏健康。这项具体研究包括16人被诊断出患有PI*ZZ的人同意接受该程序。该研究得到了丹麦道德委员会（S-20160187）的批准，参与者在入学前给予了知情同意。没有肝移植或肝硬化史的参与者被提供经皮肝活检。患者在2017年至2021年之间在OUH进行了肝核心针活检。在此期间，进行了肝核心针活检，储存在4％的福尔马林中，并嵌入石蜡中。为了评估纤维化阶段，将FFPE块切成3μmThick的切片，并安装在Flex IHC载玻片上（DAKO）。将组织切片用二甲苯脱蜡，在乙醇的系列稀释液中再水化，并用Sirius Red染色。根据NASH临床研究网络（NAS-CRN）的病理委员会，一名认证的肝病学家（S.D.）评估了克莱纳纤维化阶段（0-4）。 　　参考文献中详细描述了患者的招募。41。在该队列中，本研究包括19名被诊断出患有Pi*ZZ的人，其中14人因医疗指示而进行了肝核心针活检，并且有5人因终末期肝病而接受了肝移植。由于其在蛋白质组PCA上的离群位置较高，因此将一名患者的样本删除（补充表1）。样品存储在4％的福尔马林中，并嵌入石蜡中。通过经过认证的肝病学家对5μm厚的切片进行三色染色后，评估了纤维化阶段。块在室温下存储。道德批准由亚兴大学机构审查委员会（EK 173/15）提供。所有参与者均提供了书面知情同意书，并遵循《赫尔辛基宣言》（香港修正案）的道德准则以及良好的临床实践（欧洲指南）。 　　根据制造商的协议，将聚乙烯肾上腺素膜载玻片（2μM；微解异的GmbH）暴露于紫外线（254 nm）1小时1小时，然后用Vectabond（Vector Laboratories; Catector Laboratories; CatectorNo。SP-1800-7）涂层。将FFPE切片（3μm-thick，DVP，ML； 10-μm-thick，SCDVP）安装到这些载玻片上，并在37°C下干燥过夜。将载玻片在4°C下储存直至进一步加工，然后在55°C下烘烤载玻片40分钟，然后脱蜡和再水化（二甲苯2×2分钟，100％乙醇2×1分钟，90％乙醇2×1分钟，2×1分钟，75％乙醇2×1分钟，30％乙醇2分钟2×1分钟2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2×2 r.2×2×2×2×2×2×2×2×2 r.2×2×2×2×2d 2将载玻片在88°C下转移到预热的甘油供应抗原检索缓冲液（Dako pH 9 S2367+10％甘油）20分钟，然后在室温（22°C）处冷却20分钟。在水中洗涤后，将切片用PBS中的5％牛血清白蛋白（BSA）阻塞1小时，然后在4°C中在1％BSA/PBS中与潮湿染色室中的1％BSA/PBS隔夜孵育（1：1：200鼠标IgG1鼠标Igg1单核AAT AAT AAT 2C1，Hycult catalog No.hmbit no。抗Pan-CADH（EPR1792Y），ABCAM目录编号。在PBS中洗涤3次后，每次洗涤2分钟后，次级抗体（1：400山羊抗小鼠IgG1，Invitrogen目录NO。A21127; 1：400山羊抗兔AF647，Invitrogen Catalogno。A21245）在1％BSA/PBS中以90分钟为单位，紧随其后的是1％的PBS，紧随其后的是2-Min，紧随其后的是2-Min，紧随其后的是2-Min，以下是2-Min，sytt 2-Min，以下是2-Min，以（PBS中的1：40,000，Invitrogen目录No。S7020）和PBS中的三个最终2分钟洗涤。除去多余的液体，并使用Slowfade Diamond Antifade Mountant（Invitrogen，CatalogNo。S36963）覆盖样品。 　　对于DVP和SCDVP实验（图1-3），使用Zeiss Axioscan 7成像截面。对于所有激发波长（493 nm，577 nm和653 nm），使用50％光源强度。照明时间在一个部分上指定，并应用于一个实验组中的所有连续样品。以2μm的间隔记录了三个Z堆栈，使用Plan-Apochromat×20，0.8数值孔径M27物镜和14位的AxiooCam 712摄像头记录，其嵌套为1，瓷砖重叠为10％，缩放为0.173μm×0.173μ3μm。然后，使用扩展的焦点（方差方法，标准设置）将多觉图像分为单个场景，将Z堆栈组合成单个平面，并使用专有的Zeiss ZEN Imaging软件在Pan-Cadh通道上缝制。 　　对于下游机器学习应用的实验（图4），在Perkin Elmer Operaphenix高内心显微镜上成像，该显微镜由Harmony v.4.9软件控制，以40倍放大倍率和0.75个数值孔径，并以1个箱形为1，每个瓷砖重叠为10％。仅记录一个Z平面，为每个幻灯片和通道手动指定。同时记录停用后，对这三个通道进行了连续成像，以避免通道之间发生任何泄漏。 　　使用包装的导入工具将图像作为.czi文件导入到生物图像分析软件（偏差）中4。在偏见中，然后将图像丢弃至1,024×1,024像素，重叠为10％，而空空瓷砖被排除在进一步的分析之外。通过将Cellpose v.2.0与基于抗Pan-Cadh STAINS42的默认CYTO2模型一起使用Cellpose v.2.0以无偏见的方式鉴定出所有细胞的轮廓。将口罩进口到偏置中，并去除触摸瓷砖边界的重复物以及触摸边界的细胞（每侧0.1％）。将进一步的过滤应用于最小大小3,000像素的保留细胞，富含肝细胞种群。对于基于低，中和高骨料负载的分类，使用以下参数的多层感知器将每个活检或外植物组织的所有细胞分为五类：重量尺度0.01；动量0.01;最大迭代10,000;epsilon 0.0005和隐藏层中的五个神经元。分类基于细胞轮廓面膜内的AAT最大，中值和平均强度，不涉及人类干预。低级别归因于最低归一化平均强度的细胞，中等至第三高，高到最高归一强度。其他两个中级类被丢弃。根据突出的核和组织学特征选择参考点；随机选择100个细胞进行切除。 　　对于单个形状实验，选择了六个特征性的低纤维化样品（所有F1）和区域，这些区域呈现出清晰的边界样表型（即直接邻域中的AAT+细胞对AAT-细胞中的一排AAT+细胞）或被AAT-细胞包围的单个AAT+细胞。从最内部的细胞开始，然后将螺旋状移动到最外面的细胞，从而避免了连续切割的材料的交叉污染。 　　使用Perkin Elmer Harmony软件（v.4.9）在图像采集期间校正图像。使用Python库Scportrait（https://github.com/mannlabs/scportrait）进行平面更正图像图块的缝线。使用ALEXA647通道中成像的抗Pan-CADH染色来计算缝合的瓷砖位置作为参考，然后转移到其他图像通道中。在缝合过程中，瓷砖重叠设置为0.1，滤光度sigma参数为1，最大移位参数为50。 　　然后在Scportrait中进一步处理缝合的图像。基于使用验证的“ Cyto” Model42的Cellpose v.2.0，根据七次降采样的抗Pan-CADH染色来鉴定细胞轮廓。分割以100像素重叠的瓷砖模式进行。从重叠区域分辨出细胞轮廓后，将所得的分割掩模抬高到原始输入尺寸，在此尺寸中，通过施加侵蚀和扩张操作，壳的边缘以7的范围来平滑面膜的边缘。 　　然后，使用生成的分割掩码来提取280像素×280像素的单细胞图像数据集。在提取过程中，使用相同的单细胞图像掩模来从每个单元的每个通道获取像素信息。然后将所得的单细胞图像重新缩放到[0，1]范围，同时保留相对信号强度。对所得的单细胞图像数据集进行过滤，以仅包含来自手动注释区域内的细胞，该区域包含肝细胞，而不包含纤维化组织的细胞。 　　进一步过滤由Scportrait生成的过滤的单细胞图像数据集，以删除落出5-97.5％尺寸百分位数的任何单元。其余细胞的表示是通过使用自然图像预言的Convnext Model31来产生的。为此，将描述Alpha-1通道的单细胞图像重新缩放到N Pixels×N像素的预期图像尺寸，并三式三次生成伪RGB图像。然后使用Huggingface Transformers软件包v.4.26（参考文献43）进行推理。 　　使用UMAP算法44将结果的2,048个图像特征投射到二维空间中。UMAP维度是根据前50个主要组件和15个最近的邻居计算的。使用Scikit-Learn45的光谱聚类算法，将所得的UMAP空间分为50个簇。计算每个群集的几何中心，并选择了与欧几里得最小距离群集中心的50个细胞进行激光显微解剖。 　　使用PY-LMD软件包46在SCporTrait中生成了选定单元的轮廓轮廓，从而将细胞轮廓扩张，核大小为3，并应用25的平滑滤波器。此外，定义每种形状的点的数量被压缩了30倍，以提高激光显微解剖切割性能。使用希尔伯特算法（https://github.com/galtay/hilbertcurve）优化了切割路径，即彼此相互切割的切割路径。 　　对齐参考点后，将导入轮廓轮廓，并使用LMD7（Leica）激光显微解剖系统在半自动化模式下切割形状，并具有以下设置：POWER 45；光圈1;速度40;中间脉冲计数1；最终脉冲0;头部电流为42–50％；脉冲频率2,982和偏移190。显微镜使用LMD Beta V.10软件进行操作，用于重力阶段转移到384孔板（Eppendorf，Catalog，0030129547）中，使最外面的行和柱空为空。为了防止分类错误，将“风罩”板放在样品阶段的顶部。然后将板密封，以1,000克离心5分钟，然后在-20°C下冷冻以进一步加工。 　　如前所述，使用Bravo移动机器人（Agilent）47制备肽。简而言之，将384孔板解冻，并用28μl的100％乙腈（ACN）将形状（均组合和个体）从壁上冲洗到井的底部。将井在45°C的Speedvac中完全干燥，然后添加6μl的60 mm碳酸氢盐三甲基铵（Supelco，CatalogNo。18597）（pH 8.5）补充了0.013％n-Dodecyl-beta-maltoside（Sigma-Maltoside）（Sigma-altos）（sigma-aldrich cataldrich，catcatal，cattail catcat catcat cat catcate）。密封板并在95°C下孵育1小时。调整为10％ACN后，将样品在75°C再次孵育1小时。随后，将6 ng和4 ng的胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶分别在1μl的60 mM三乙基碳酸氢铵缓冲液中添加到每个样品中，并在37°C下消化蛋白质16小时。通过将三氟乙酸添加到终浓度为1％，从而淬灭反应。然后在-20°C下冷冻肽样品。 　　为了加载，首先将新的evotip浸入1丙醇中1分钟，然后用50μl的缓冲液B（ACN含0.1％甲酸）冲洗两次。在另一项1-丙醇浸泡步骤3分钟后，用两个50μl缓冲液A（0.1％甲酸）洗涤的尖端平衡。将样品加载到70μl预加载的缓冲液A中。一次额外的缓冲液洗涤后，用150μl缓冲液A覆盖了含肽的C18磁盘，并通过磁盘短暂离心。所有离心步骤均以700克进行1分钟。在液相色谱（LC）-ms之前，最终将最终尖端存储在缓冲液A中。 　　使用与Orbitrap星体质谱仪（Thermo Fisher Scientific）结合的Evosep One LC系统（Evosep）分析肽样品。从evotip中洗脱肽，最高35％ACN，并使用evosep低流量“耳语”梯度分开，用于DVP样品，或一个实验性的Evosep“ Whisper Zoom”梯度，用于单个形状和DVP-Machine学习样品，每天在40个样品上，每天在Aurora time theplate上，均包含40个样品，包括15-CM lenge of 15-cmment of 15-Cmmment of 15-cm length of 15-cm length of 15-cm length of 15-cm length of 15-cm，1.7μmC18珠（Ionopticks）。使用柱加热器（Ionopticks）在50°C保持色谱柱温度。 　　Orbitrap星体质谱仪配备了Faims Pro接口和易于喷雾源（均为Thermo Fisher Scientific）。使用了-40 V的FAIMS补偿电压，总载气流量为3.5 L min -1。将电喷雾电压施加1,900 V进行电离，并将射频水平设置为40。OrbitrapMS1光谱，以240,000的分辨率（M/Z 200）从380至980 m/z获取，具有归一化自动化增益控制（AGC）目标（AGC）的500％和最大注射时间为100毫秒的最大注射时间。 　　对于与数据无关的采集（DIA）模式中的星体MS/MS扫描，我们在前体选择范围内确定了380–980 m/z的实验方法：（1）用于DVP样本，使用5 th的窗口宽度，最大注入时间为10 ms，使用了800％的归一化AGC目标。（2）对于DVP计算机学习样本，窗口宽度为6 th，最大注射时间为13 ms和归一化的AGC目标500％。（3）对于单一形状和其他DIA扫描，根据在380–980 m/z的选择范围内的前体密度优化窗口宽度。总共获得了45个可变宽度的直径窗口（补充表3），最大注射时间为28 ms，AGC目标为800％。使用高能量碰撞解离，并具有25％的归一化碰撞能，将分离的离子分裂。详细的方法描述以每个补充数据表提供默认格式。 　　将原始文件与DIA-NN v.1.8.1（参考文献48）的每个实验组中的匹配列表中的无库模式一起搜索。从Uniprot（20,404个条目，于2023年1月2日下载）获得了仅包含规范序列的FASTA文件，并手动更改了引起疾病的氨基酸（E342K）。我们允许丢失的裂解速率高达1，并将质量精度设置为8，MS1精度为4，并将扫描窗口设置为6。根据基因推断蛋白质，并将神经网络分类器设置为“单通路模式”。对于DVP和DVP计算的学习样本，然后在标准设置下使用DirectLFQ GUI在“ report.tsv”文件中的前体强度进行标准化，包括最少数量的非nan离子强度来推导蛋白质强度1（参考49）。另外，将单个形状数据额定于量化的一组蛋白质（在所有样品中量化的451种蛋白质中量化的451种蛋白质；补充表3），从而校正了蛋白质数量对形状尺寸的依赖性。 　　使用R V.4.4.1分析数据。DirectLFQ输出文件“ PG_MATRIX.TSV”用于所有后续数据分析，包括报告的蛋白质计数。如果蛋白质组的数量超过（1）平均-1.5 s.d.，则包括样品。对于DVP，导致5.9％（102）辍学；（2）平均-0.5 S.D.用于DVP计算机学习样本；（3）拟合的对数曲线 - 1.5 scdvp的四分之一间间范围，考虑了大小和蛋白质组学深度之间的关系，导致15.4％（40）259个辍学。手动检查数据分布后选择较低的截止。尽管每次患者活检中收集了一些样品，但仅使用第一个复制来进行统计分析，并从不同的样品中进行了所有报告的测量。根据非转化强度值计算变异系数。对于主成分分析（PCA），R软件包PCATOOLS v.2.16.0用于完整的数据矩阵上，根据方差删除了较低的10％变量。在样品中至少30％数据完整性的蛋白质上进行了统计分析，假设使用Limma软件包v.3.60.3的正态性，具有双面调节的t检验，将“ FDR”作为多重测试校正方法。将每个患者的统计配对用于DVP和单个形状实验。除非另有说明，否则强度和倍数变化报告为log2转换值。使用Webgentalt 2024对指示数据库进行了GSEA，其FDR <0.05被认为是显着的50。在标准设置51上使用字符串数据库计算交互网络51。从人类蛋白质图集资源部分中检索血浆蛋白，其搜索词“ sa_location：分泌为血液和tissue_category_rna：肝脏；富含组织的52。响应的时机由Limma调节t检验的B值之间的绝对差异进行排名，比较了三个AAT负载组：低至中度至中度至中等。在任何一个或两个比较中，仅具有超过70％数据完整性和显着性（FDR <0.05）的蛋白质。通过在Log2（AAT） - 强度<25的样品中通过Log2转化的单个蛋白质的线性模型拟合线性模型来计算跨纤维化阶段的差异途径表达，并且通过在F1和F4样品之间将特定途径中蛋白质的斜率通过两边的Wilcoxon等级测试进行比较。使用“ FDR”方法校正指示的P值以进行多次测试。使用“简单功能”软件包映射空间数据。通过将AAT或CRP表达分组为十个等距箱中的AAT或CRP表达来构建补充表中的BINNED表达，并在每个垃圾箱中跨样品中蛋白质的中位表达。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。