SARS-COV-2 OMICRON病毒会导致小鼠和仓鼠的疾病导致疾病

　　VEO-TMPRSS2（参考文献35,50,51）和Vero-HACE2-TMPRSS2（参考文献52）细胞在Dulbecco修改后的EAGLE培养基（DMEM）中培养，并补充了10％胎儿牛血清（FBS），10 mm Hepes pH 7.3和100 u mlinecillin-胎牛血清（FBS），10％胎牛血清（FBS）。VERO-TMPRSS2细胞补充了5μgml-1 blasticidin或1 mg Ml-1遗传素（取决于细胞系），在某些具有血浆素的培养基中。Vero-HACE2-TMPRSS2细胞补充了10 µg ml-1嘌呤霉素。所有细胞通常使用基于PCR的测定法对支原体进行了阴性。 　　先前描述了带有取代（D614G和/或N501Y/D614G）的WA1/2020重组菌株53。B.1.1.529分离株（HCOV-19/USA/WI-WSLH-221686/2021（GISAID：EPI_ISL_7263803），HCOV-19/japan/japan/nc928-2n/2021（NC928）（NC928）（NCISAID：EPI_ISL_ISL_75070555555）HCOV-19/USA/NY-MSHSPSP-PV4476/2021（GISAID：EPI_ISL_7908052），HCOV-19/USA/NY-MSHSPSP-PV44488/2021（GISAID）（GISAIDEPI_ISL_7171744）是从鼻拭子中获得的，并在Vero-TMPRSS2细胞上转移，如前所述3,35,51。补充表2中描述了B.1.1.529分离株之间的序列差异。包括：SARS-COV-2/UT-HP095-1N/HUMAN/2020/TOKYO（HP-095; D614G），HCOV-19/hcov-19/he use/ca_cdc_5574/2020（Alpha，alpha，b.1.1.1.1.1.iiii;HCOV-19/USA/MD-HP01542/2021（Beta，B.1.351），20H/501Y.V2（Beta，B.1.351），HCOV-19/USA/phc658/202（delta（delta）B.1.617.2;如先前所述，所有病毒均经过下一代测序55，以确认取代的稳定性，并避免引入不定的改变所有病毒实验均在认可的BioSafety 3级设施中进行。 　　根据《国家卫生研究院的实验动物的护理和使用指南》中的建议进行了动物研究。The protocols were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee at the Washington University School of Medicine (assurance number A3381–01), University of Wisconsin, Madison (V006426), St Jude Children’s Research Hospital (assurance number D16-00043), Emory University, University of Iowa (assurance number A3021-01), Icahn School of Medicine at Mount Sinai（Proto202100007），Bioqual，Inc。和东京大学医学研究所的动物实验委员会（批准数字PA19-72和PA19-75）。病毒接种是在麻醉下进行的，该麻醉是用氯化氯化氯化物和二甲苯诱导和维持的，并竭尽全力使动物痛苦最小化。体内研究并未盲目，动物被随机分配到感染组。未进行样品大小的计算以为每项研究供电。取而代之的是，根据先前的体内病毒挑战实验确定样本量。 　　杂合子K18-HACE2 C57BL/6J小鼠（应变2B6.CG-TG（K18-ACE2）2PRLMN/J），129只小鼠（菌株129S2/SVPASCRL或129S1/SVIMJ）和C57BL/6（CLAN）（CLAIN）consson and carritories and car consson and kackson Laintories。BALB/C小鼠购自日本SLC Inc.动物分组饲养并喂养标准的Chow饮食。感染实验如下。在第一组实验中，用103、104或105 FFU的SARS-COV-2对5个月大的雌性K18-HACE2小鼠进行了鼻内接种。在第二组实验中，使用了10至20周龄之间的129例雄性和雌性小鼠。用异氟烷麻醉小鼠，并用病毒（50μL，每只小鼠106 PFU）鼻内接种。在第三组实验中，将6周龄的雌性BALB/c小鼠静脉内接种了HCOV-19/日本/日本/NC928-2N/2021或HCOV-19/USA/USA/MD-HP01542/2021的105 PFU。在第四组实验中，已退休的育种雌性C57BL/6小鼠（10至14个月大）用氯胺酮 - 氯嗪麻醉，并在总体积为50μLDMEM的鼻内接种，并在内部接种。每天监测动物体重和健康。在第五组实验中，在轻度氯胺酮 - 氧基嗪镇静剂下，在HCOV-19/USA/USA/NY-MSHSPSP-PV4444444444476/20221或104 PFU下，在光内接种了6-8周龄的女性129S1小鼠和6个月大的雌性K18-HACE2小鼠。HCOV-19/USA/NY-MSHSPSP-PV44488/2021总体积为50μl。 　　Male 5–6-week-old Syrian golden hamsters were obtained from Charles River Laboratories, Envigo or Japan SLC Inc. The K18-hACE2 transgenic hamster line was developed with a piggyBac-mediated transgenic approach, in which the K18-hACE2 cassette from the pK18-hACE2 plasmid14 was transferred into a piggyBac vector, pmhyGENIE-3 (ref. 56), for前注射。HACE2转基因仓鼠将在其他地方详细描述39。使用了雌性12个月大的转基因动物。感染实验如下。在第一组实验中，用103 PFU的WA1/2020 D614G或B.1.1.529在100 µL中进行了鼻内挑战。在第二组实验中，在异氟烷麻醉下，野生型叙利亚仓鼠在30 µL中用103 PFU的SARS-COV-2菌株在内部接种了鼻仓鼠。每天监控体重。对于病毒学和病理检查，每组四个仓鼠在3和6 dpi中被安乐死，并收集了鼻涡轮和肺。鼻涡轮和肺中的病毒滴度是通过Vero-TMPRSS2细胞上的斑块测定确定的。人ACE2转基因仓鼠在50 µL中经庭接种了103 PFU的HP-095 D614G或B.1.1.529（HCOV-19/USA/WI-WSLH-221686/2021）。每天监测体重和存活率，并在3和5 DPI下收集鼻涡轮和肺，以进行病毒学分析。在第三组实验中，六周大的男性叙利亚金仓鼠被随机分为4至6组，并通过在两个鼻孔之间平均分裂的PBS中的100 µL适当稀释的病毒通过递送SARS-COV-2进行接种。每天收集体重变化和临床观察结果。在第四组实验中，在异氟烷麻醉下，在鼻内进行了8-10周大的仓鼠，用104 PFU为WA1/2020或B.1.1.529在100 µL体积中接种。每天监测体重和生存。在4 DPI下进行鼻洗涤，进行病毒学分析。 　　在1,000μLDMEM培养基中，在含有2％热灭活的FBS的1,000μLDMEM培养基中称重组织并用锆石珠（Roche Life Science）中的锆珠（Roche Life Science）匀浆。通过在10,000 r.p.m.持续5分钟，并在-80°C下储存。使用Magmax mirvana总RNA隔离试剂盒（Thermo Fisher Scientific）提取RNA，翠鸟弹性提取机器人（Thermo Fisher Scientific）提取RNA。使用Taqman RNA至CT 1步套件（Thermo Fisher Scientific）对病毒RNA（N基因）进行反转录并放大，并按照先前所述进行分析和标准化数据57。通过先前发表的24，通过对Vero-HACE2-TMPRSS2细胞上的斑块测定确定传染性病毒滴度。如先前发表的51，通过对Vero-TMPRSS2细胞的斑块测定确定鼻涡轮和肺中的病毒滴度。在感染后指定的一日时，用异氟烷过量对小鼠安乐死，并在装有TRI试剂的Omni珠子破裂管中收集一个肺组织（Zymo，数字R2050-1-200）。使用Omni珠状破裂物24（5.15 ms，15 s）匀浆组织，然后离心以去除碎屑。使用Direct-Zol RNA MiniPrep试剂盒（Zymo，Number R2051）提取RNA，然后使用高容量逆转录酶cDNA试剂盒（Thermo，Number 4368813）转换为cDNA。如前所述29,58，测量了SARS-COV-2 RNA依赖性RNA聚合酶和亚基因组RNA。通过定量PCR和逆转录在鼻涡轮和肺中对亚基因组SARS-COV-2 RNA水平进行了逆转录，如先前发表的29,55。如前所述59，通过在VERO-TMPRSS2细胞上通过斑块测定确定鼻涡轮和肺中的传染性病毒滴度。 　　收集肺4 DPI并在1.0 mL DMEM中匀浆，通过离心（1,000 g持续5分钟）阐明，并储存在-80°C下。通过离心（2,000 g 10分钟）阐明鼻洗涤，并将上清液储存在-80°C。为了定量肺组织匀浆和鼻腔洗涤的病毒载量，使用E.Z.N.A.从100 µL样品中提取RNA。总RNA套件I（欧米茄），并用50 µL水洗脱。如前所述60，使用Taqman RNA-TO-CT 1-Step 1-step Kit（Thermo Fisher Scientific），使用四个微透明的RNA用于具有逆转录的实时定量PCR，以检测和量化SARS-COV-2的N基因。60。鼻涡轮和肺中的病毒滴度是通过对表达人TMRPSS2的Vero E6细胞上的斑块测定确定的，如先前发表的61。按照制造商的说明，使用Qiagen rneasy提取试剂盒（Qiagen）从澄清的鼻腔清洗中提取RNA。将样品纯化在随附的色谱柱上，并在50 µL无核酸酶的水中洗脱。使用4×TAQMAN快速病毒主混合物（Thermo Fisher）和N-Gene底漆/探针组进行PCR。 　　在24孔组织培养板中，将Vero-TMPRSS2或Vero-TMPRSS2-HACE2细胞以1×105细胞的密度接种。第二天，除去培养基，并用200μl材料代替，以滴定在补充2％FBS的DMEM中滴定稀释。一个小时后，加入了1毫升的甲基纤维素覆盖层。将板孵育72小时，然后在PBS中用4％多聚甲醛（最终浓度）固定20分钟。将板用0.05％（w/v）的晶体紫罗兰色在20％的甲醇中染色，并用蒸馏水，去离子水洗涤两次。 　　收集了来自K18-HACE2小鼠（模拟感染或3 dPI）的肺上场和中叶，均质化，然后在-80°C下储存。解冻后，将肺匀浆在4°C下以10,000克离心5分钟。在透明的U底96孔板（Falcon）中，用Ultraviolent Light将样品灭活。在澄清的肺上清液中，使用了小鼠26质子，基于珠的Luminex分析（目录编号EPXR260-26088-901）。该测定是根据制造商的说明进行的，所有孵化步骤均发生在300 R.P.M.的轨道振荡器上。简而言之，将50μl的澄清的肺匀浆上清液与衬盖的黑色96孔板中的珠子合并为套件的一部分，并在室温下孵育30分钟，然后在4°C下过夜。第二天，允许板平衡至室温30分钟，用每孔150μl的1倍洗涤缓冲液洗涤3次，然后在室温下加入30分钟的每孔25μl，每孔25μl。将板洗涤3次，然后在室温下加入30分钟的每孔50μl每孔的1×链霉亲和素溶液。洗涤3次后，加入每孔的读数缓冲液，并在室温下孵育5分钟。数据是在Luminex 100/200分析仪（Millipore）上使用XPONENT软件（版本4.3）获取的，并使用GraphPad Prism（版本8.0）和R（版本4.0.5）进行了分析。 　　用103 PFU（30μL）的B.1.529（NC928菌株），B.1.617.2（UW-5250）或PBS接种仓鼠。通过使用体内微CT扫描仪（Cosmoscan FX；​​ Rigaku Corporation）对感染动物的肺进行成像。在氯胺酮 - 二甲苯在麻醉下，将动物放在图像室中，并在90 kV，88μa，视野45毫米和像素大小90.0μm处扫描2分钟。扫描后，使用Themicro-CT（Rigaku Corporation）的Cosmoscan数据库软件重建了肺图像，并使用制造商提供的软件进行了分析。CT严重程度得分是根据人类评分系统进行的，用于对肺部异常的严重程度进行评分。62。分析每个肺叶的参与度，并根据严重程度从0到4分：0（无，0％），1（最小，1％–25％），2（轻度，26％–50％），3（中度，51％–75％）或4（严重，76％–100％）。总结了五个肺裂片的得分，以获得0-20的总严重程度得分，这反映了三个感染组的异常严重程度。图像是匿名和随机的；得分手对小组分配视而不见。 　　切除的动物组织固定在PBS中的4％多聚甲醛中，并加工以嵌入石蜡。将石蜡块切成3 µm厚的部分，并安装在硅烷涂层的载玻片上。使用RNA范围2.5 HD红色检测试剂盒（高级细胞诊断）处理切片以进行原位杂交，并具有针对SARS-COV-2的核素基因的反义探针（晚期细胞诊断）。根据以下评分系统，根据从每组中每一组收集的肺部截面的给定面积的肺泡炎症百分比对肺组织切片进行病理评分：0，没有病理变化；1，受影响区域（≤10％）；2，受影响区（<50%, >10％）;3，受影响区域（≥50％）；观察到肺水肿和/或肺泡出血时，增加了一个额外的点。 　　本文所述的所有试剂均可通过物料转移协议获得。 　　相关图的传说中指出了独立的实验和技术重复的数量。统计分析包括未配对的t检验，Mann-Whitney测试和具有多个校正后测试的ANOVA。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。