来自三重疫苗的记忆B细胞曲目针对不同的SARS-COV-2变体

　　与SARS-COV-2实时病毒相关的所有程序均由动物实验委员会实验室动物中心，北京微生物学和流行病学研究所批准，并获得了批准的IACUC-EME-IME-2021-022，并在BioSafety Level 3（BSL-3）实验室中进行了对指导和指导的建议，并在BioSafety Level 3（BSL-3）中进行。有关人类参与者的程序得到了首都医科大学北京Youan医院的伦理委员会（SEAL）的批准，并批准了LL-2021-042-K。所有参与者均获得书面知情同意书。 　　SARS-COV-2 WT菌株CN01最初是在中国Covid-19的早期阶段从患者中分离出来的。SARS-COV-2的关注β菌株GDPCC在来自南非的患者中分离出来，并从香港的患者中分离出Omicron菌株，现在保存在Sinovac Biotech Ltd中。所有病毒菌株首先通过先前描述的标准斑块分析纯化，如先前描述的14，然后在CCC CCL CCL-81 GRAL中被接种，然后将其接种到CCL CCL-81 GRIM（fter）中。补充了Dulbecco的最小必需培养基（DMEM），以进行扩增。此外，使用了293T细胞（ATCC CRL-3216）和HUH-7细胞（JCRB 0403）进行伪病毒中和测定。HEK293F细胞（Thermo Fisher Scientific 11625019）用于蛋白质表达。HEK293细胞（ECACC 85120602）用于抗体表达。所有细胞都被确认对支原体污染均为阴性。 　　血清样品是从没有COVID史的健康志愿者那里获得的，并通过PCR和血清学测定进行了验证，并接受了两种剂量或三剂Coronavac（Sinovac）灭活的病毒疫苗针对SARS-COV-2。整个研究是根据中国良好临床实践的要求进行的。 　　首先将血清样品在56°C下孵育30分钟，以使其失活。热处理的样品或单克隆抗体在1：4或50μgml-1与DMEM的1：4或50μgml-1处于两个步骤中，并与在36.°C下含有100 TCID50的病毒悬浮液混合2 h，然后将其添加到36.5％的孔中，并将其添加到36.5天的孔中。孵化器。之后，在三个不同个体的显微镜下观察到了每个孔的细胞质效应，并记录了相关的稀释液和浓度，并用于通过Reed-Muench14方法测试的样品滴定。 　　如前所述，产生了带有S蛋白的假病毒，等分并恢复。简而言之，首先用带有WT或变体的S基因的质粒（Alpha，Beta，Gamma，Delta，Lambda和Omicron）SARS-COV-2转染了293T细胞。转染的293T细胞被VSV G Pseudotyped病毒（G*ΔG-VSV）感染，在多种感染（MOI）中为4。孵育5小时后，将细胞用PBS洗涤，然后添加完整的培养基。再过24小时后，产生并收集了SARS-COV-2假病毒。对于体外伪型病毒中和测定，将血浆样品或抗体从1:10或10μgml -1开始稀释，并在6个另外的三个三倍的连续稀释液中稀释，每种抗体与收集的伪病毒混合，并在37°C下孵育1小时。之后，将混合物添加到HuH-7细胞中，并放回孵育24小时。然后，用发光微孔板读取器测量每个孔的荧光素酶发光（RLU）。中和百分比的计算如下：抑制（％）=（1 - （样品rlu - blank rlu）/（阳性对照rlu - blank rlu））。抗体中和滴度以最大抑制浓度为50％（IC50）。 　　VOC OMICRON全长S蛋白（残基1-1208），RBD（残基319-541）和NTD（残基1-304）的序列是从编码s，rbd和ntd的质粒中修饰的，wt sars-cov-2（genbank：genbank：mn9089947）在我们的实验室中通过pcr propperppcrpcr。除报道的突变（A67V，Δ69-70，T95I，G142D，Δ143–145，Δ211，Δ211，l212i，ins214epe，g339d，s371l，s371l，s371l，s373p，s373p，s375f，s375f，s375f，s375f，k417n，k417n，k4440k，g4446s，s4446s，s4446，E484A，Q493R，G496S，Q498R，N501Y，Y505H，T547K，D614G，D614G，H655Y，N679K，p681H，p681H，n764k，d796y，d796y，n856k，n856k，q954h，q954h，q954h，q954H，n9669k and ominic and ominic at o ominic at o ominic at on omicrine at ominic and omicron at ominicrone of omicrone n96881f）892、899、942、986和987，S1/S2呋喃裂解位点上的“ GSA”取代（残基682-685）和C端T4 Foldon修剪结构域也引入了Omicrons构建中，以稳定S蛋白的构造构造。对于蛋白质表达，将这些蛋白质的质粒瞬时转染到HEK 293F细胞中，在悬浮液中在37°C下生长的HEK 293F细胞，在提供8％CO2的孵化器中，以130 rpm旋转。收集细胞上清液并在转染后三天收集并浓缩，并使用与链霉亲和链霉素蛋白附着的树脂和尺寸 - 分类色谱法（SEC）通过亲和色谱进一步纯化，使用Superose 6 10/300柱（GE Healthcare Life Sciences）与20 mm Tris-Hcl，pH 8.0和200 mm nac anc均衡的缓冲液平衡。 　　使用Histopaque（Sigma）梯度离心从四个志愿者获得的全血样品中分离PBMC。用汉克的平衡盐溶液（HBSS）（Solarbio）洗涤3次后，在FBS和DMSO的存在下将细胞等分并储存在液氮中。对于单个内存B细胞分类，将储存的PBMC解冻并与CD19 Microbeads（Miltenyi Biotec）孵育，以筛选出CD19+ B淋巴细胞，然后将其与人FC块（BD Biosciences）孵育，然后将其与抗CD20-PECY7（抗CD20-PECY7（BD1113 Biosciences）孵育使用FACSARIA II（BD Biosciences）将单个内存B细胞（CD20-1114 PECY7+ S-ECD-PE+ S-ECD-APC+）进一步分为96孔板，然后如前所述进行测序和克隆。 　　如先前所述，所选的323抗对基因密码子优化和构造进行了基因密码子优化和构造。然后将克隆瞬时转染到哺乳动物HEK 293F细胞中，并在37°C下的5％二氧化碳旋转培养箱中孵育5天，用于抗体表达，使用蛋白A进一步纯化，并透析透析透析磷酸盐缓冲液（PBS）。然后处理纯化的单克隆抗体XGV265，XGV282，XGV289和XGV347，如先前所述，使用Pierce Fab制剂套件（Thermo Scientific）使用Pierce Fab制剂盒（Thermo Scientific）获得其Fab片段36。简而言之，首先将样品应用于淡化柱以去除盐，并收集流通液并与木瓜蛋白木蛋白木蛋白酶在37°C的整个抗体中连接到从整个抗体的裂解Fab片段上孵育5小时。之后，将混合物转移到蛋白A柱中，即流通液（即，收集Fab片段）并将透析透析为PBS（Thermofisher，Catalog（Cat。）No。10010023）。 　　BLI实验是在八位字红384仪器（Fortebio）上进行的。为了测量单克隆抗体的结合相关性，将单克隆抗体固定在蛋白A A生物传感器（FORTEBIO）和WT RBD的三倍系列稀释液中，Alpha RBD，Alpha RBD（Acrobiosystems，Acrobiosystems，Cat。NO.SPD-C52HN），Beta RBD（beta rbdsp）（Acrobiossssssp5 nocamems cat。RBD（Acrobiosystems，Cat。No。SPD-C52HR），Delta RBD（AcrobioSystems，Cat。No。Spd-C52HH）和Omicron RBD（Acrobiosystems，Cat。No。SPD-C522E）在PBS中使用。然后，使用软件八位字体BLI分析12.2（Fortebio）使用1：1拟合模型分析数据。对于BLI的竞争分析，将其（Acrobiosystems，Cat。No。Spd-C52H3）标记为SARS-COV-2 WT RBD，在NTA生物传感器上加载了，在缓冲液中预先校准了至少1分钟。将加载的生物传感器与第一种单克隆抗体浸入300 s，然后再添加第二种单克隆抗体再添加300 s。还通过Octet Bli Analsis 12.2分析了获得的数据。 　　为了评估给定的单克隆抗体是否可以阻止人ACE2（HACE2）和RBD之间的相互作用，ACE2竞争ELISA是通过使用SARS-COV-2（B.1.1.529）抑制剂筛选试剂盒（Acrobiosystems，Acrobiosystems，CAT。EP-115）进行的。简而言之，将10个稀释的单克隆抗体（25μgml-1的起始稀释度）和0.8μgml-1的HRP偶联的SARS-COV-2 RBD添加到ELISA板孔中，这些均由HACE2蛋白预先涂料。在37°C孵育1小时后，用PBST（0.1％Tween）将板洗涤3次，并通过添加3,3'，5,3'，5,5'-四甲基苯胺TMB（Thermo Fisher）开发比色信号。通过添加50μL1 M H2SO4停止反应。用ELISA微板读取器在450 nm处测量吸光度。对于每种单克隆抗体，添加了无单克隆抗体的空白对照以进行抑制计算。使用Prism V8.0（GraphPad）确定每个单克隆抗体的曲线（AUC）下的面积。为了使竞争性ELISA识别给定单克隆抗体的结构域，首先将96孔板涂有RBD（2μgml-1），然后在PBS中用2％BSA封闭。与参考单克隆抗体孵育后，阻断抗体（15μgml -1），然后直接添加第二种生物素化抗体（0.25μgml -1）。然后添加链霉亲和素HRP（BD生物科学）以进行检测。没有第一抗体的样品用作归一化的阴性对照。 　　The purified S protein was mixed with each of the Fab fragments of XGv265, XGv282, XGv289 or XGv347 with a molar ratio of 1: 1.2 for 10 s ice incubation, and then dropped onto the pre-glow-discharged holey carbon-coated gold grid (C-flat, 300-mesh, 1.2/1.3, Protochips In.), blotted for 7 s with no100％相对湿度中的强力，并立即使用Vitrobot（FEI）浸入液态乙烷中。通过FEI Titan Krios显微镜（FEI）在300 kV下收集这些配合物的冷冻EM数据集。电影（32帧，每个0.2 s，总剂量为60 e -Å2）使用K3 summit直接检测器记录，散焦范围在1.5-2.7μm之间。自动单粒子数据采集是通过Serialem进行的，校准放大倍数为22,500，最终像素大小为1.07Å。 　　总共有3,752、2,631、3,955和5,014个显微照片S – XGV265复合物，S – XGV282复合物，S – XGV289复合物和S – XGV347复合物，分别记录并使用横梁诱导的运动校正，使用Motion Corcection Collection CorlyCortor in MotionCorrior in MotionCortor in MotilCorr in Motion corlion in relion inion 3.0 packagion 3.0 packagion 3.0 package toccounction 3.0。每个图像的散焦值由GCTF计算。然后，1,302,103、756,508、2,332,045和2,320,416个S – XGGV265复合物的颗粒，S – xgv282复合物，S – XGV289复合物和S – xgv347复合物，分别为42 dd aLign388388，分别为s – xgv347复合物。选择了190,154、837,832和614,852个颗粒，并对S – XGGV265复合物，S – XGV282复合物，S – XGV289复合物和S – xgvv347复合物对3D分类进行3D分类。之后，选择每个配合物的候选模型，并通过CryoSparc中的非均匀自动填充和后处理来处理，以生成S – XGV265复合物，S – XGV282复合物，S – xgvv289复合物和S – XGV347复合物的最终冷冻EM密度。为了改善RBD和单克隆抗体之间界面的分辨率，进行了基于块的重建，以获取焦点接口的最终分辨率，该接口包含RBD接口和此处研究的单克隆抗体的接口，如前所述39。根据金标准的傅立叶壳相关（阈值= 0.143）确定每个结构的分辨率，并通过RESMAP评估。所有数据集处理均在扩展数据中显示，并在扩展数据表2中汇总。 　　复合物的原子模型是通过首先拟合本机apo sars-cov-2 s trimer（6vyb的PDB数）和Fabs（PDB的7LSS和7czw的XGV265、5MES和5MES的7czw）而生成的上面由嵌合体描述的最终S-fab复合物的冷冻EM密度，然后根据COOT中的蛋白质序列和密度进行手动调整和校正，以及使用phenix进行的实际空间细化。扩展数据表2总结了复合物的完善统计信息的详细信息。 　　SARS-COV-2 WT RBD的模型与XGV265，XGV282，XGV289和XGV347的复合模型通过WT RBD的叠加和Omicron RBD的冷冻EM结构在与四种抗体中的复合物中生成。在分子动力学之前，请通过Web接口（https://swift.cmbi.umcn.nl/servers/html/index.html）检查所有模型，该怎么办。之后，该结构由gromacs-2021模拟。简而言之，我们使用带有TIP3P水模型的OPLS力场来准备动态系统，并添加Na+和Clion，以使系统电气中和。然后，使用最陡峭的下降算法对系统进行最小化，直到达到1,000 kJ mol-1的最大力。NVT通过300 K处的鼻子 - 霍维方法和1 bar的NPT集合与Parinello-Rahman算法持续使用nvt-emb1e，分别用来使温度和压力平衡。最后，从随机初始速度和应用周期性边界条件开始，进行了100 ns的分子动力学生产。使用Verlet截止方案处理了非键相互作用，而使用粒子网埃瓦尔德方法处理远距离静电相互作用。用12Å的临界值计算出短距离静电和范德华相互作用。使用最后10个NS框架生成了四个复合物的平均结构，并在抗体和RBD之间通过InterfaCeanalyzer估算了抗体和RBD之间的ΔG。atomic_burial_cutoff，sasa_calculator_probe_radius和Interfaces_cutoff值分别设置为0.01、1.4和8.0。 　　通过使用基于SARS-COV-2β变异菌株28的新成立的小鼠模型来评估单抗体或抗体鸡尾酒的体内保护效果。简而言之，在感染后1小时后，用1×104 PFU的SARS-COV-2β变异菌株感染了一组8个月大的雌性BALB/C小鼠，用1×104 PFU的SARS-COV-2β变异菌株感染，然后在感染后1小时用单个剂量的不同抗体或抗体鸡尾酒（5 mg kg-1）对感染的小鼠进行感染。还通过使用10周龄的雌性K18-HACE2小鼠评估了XGV347的保护功效，每只XGV347均受到Omicron菌株1×102 TCID50的挑战。感染后两个2小时，将小鼠在30 mg kg -1或与对照的PBS相同的PBS腹膜内治疗。两组小鼠的肺组织在5 dpi上收集，以进行病毒RNA负载测定和病理检查。所有小鼠均在每组中随机分配。在实验和结果评估期间，研究人员对分配没有视而不见。 　　如先前所述，测量了小鼠肺中的病毒负担17。简而言之，通过离心阐明肺组织匀浆，并使用Qiaamp病毒RNA Mini Kit（Qiagen）提取病毒RNA。每个组织样品中的病毒SGRNA定量通过针对SARS-COV-2的S基因的定量逆转录PCR（RT-QPCR）进行。使用一步primeScript RT-PCR套件（Takara）进行RT-QPCR。 　　用小鼠的肺组织用灌注固定剂（甲醛）固定48小时，并根据标准的组织学测定法嵌入石蜡中。对于组织病理学，将肺组织用血久毒素和曙红染色。使用配备DP72摄像机的Olympus BX51显微镜捕获图像。对于RNA，根据制造商的说明，使用RNASCOPE 2.5（高级细胞诊断）进行测定。简而言之，在60°C下孵育60分钟，将5μM的福尔马林固定石蜡包裹的组织切片切片切片。内源性过氧化物酶在室温下用过氧化氢淬灭10分钟。然后将载玻片在rnascope靶检测试剂中煮沸15分钟，并在探针杂交之前在rnascope蛋白酶加上30分钟。靶向2019-NCOV RNA的探针是由高级细胞诊断设计和合成的（CAT。编号848561）。用吉尔的血久毒素对组织进行染色，并用标准的明亮场显微镜可视化。原始放大倍率为10×。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。