人类癌细胞系的转移图

　　没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的。在实验和结果评估中，研究人员并未对分配视而不见。 　　在CCLE（https://portals.broadinstitute.org/ccle）的建议条件下培养乳腺细胞系。通过SNP指纹和RNA-seq证实了细胞系的身份，并与CCLE结果进行了比较。所有细胞系均对支原体呈阴性。使用FUW慢病毒载体骨架（来自D. Baltimore的礼物； Addgene PlasmidNo。14882）设计了荧光 - 荧光酶 - 巴尔科代码（FLB）构建体。使用barcode_generator.py（v.2.8; http://comailab.genomecenter.ucdavis.edu/index.php/）设计条形26核苷酸的长度核苷酸，并使用Gi​​bson Asspedland Blaysblysblysblysblysblysblys（新的gibland Biolabs）（新的codos of copsss coces）（慢病毒的制剂和细胞感染是根据已发布的方案进行的，该方案在http://www.broadinstitute.org/rnai上提供。使用Sony SH4800分道机，通过用固定栅极的GFP或MCHERRY的FACS分析感染的细胞。 　　动物工作是根据由广泛研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议进行的。使用5-6周龄时的NSG雌性小鼠（杰克逊实验室）。将癌细胞悬浮在PBS中，0.4％BSA和100​​μl细胞悬浮液注入了止血小鼠的左心室（氯胺酮100 mg kg -1;甲苯嗪10 mg kg -1）。每周使用IVIS Spectrumct成像系统（Perkinelmer）通过实时BLI监测体内转移进程。用吸入异氟烷对小鼠进行麻醉，并用D-荧光蛋白（150 mg kg-1）注入腹膜内，并以易于俯卧和仰卧位的自动暴露设置成像。在终点，通过将切除的器官浸入含DMEM/F12培养基（Thermo Fisher Scientific）中的DMEM/F12培养基（Thermo Fisher Scientific）中，将D-Luciferin持续10分钟，并在自动暴露设置中成像。使用Living Image软件（V.4.5，Perkinelmer）进行BLI分析。在乳腺癌队列研究的情况下（图1中的PILOT，第1组和第2组，图1的扩展数据），在动物注射前立即以相等比例的比例混合细胞系，并注​​入每个条形码线的细胞系库。在单个乳腺细胞系验证（扩展数据图1N）的情况下，将细胞系以2×104细胞的密度单独注射，与合并实验相当。在MetMAP125的情况下（图2，扩展数据图2），使用了25个细胞系的棱镜库，每只小鼠注入2.5×105个总细胞，对应于每个条形码线的1×104个细胞。将五个棱镜池分别注入了5-6周大的NSG小鼠的队列中。在MetMap500的情况下，将20个棱镜池组成的25个细胞系组合在一起，形成了498个细胞系的大池。将大池注入了8-10周龄的NSG小鼠的队列中，每只小鼠有2.5×105个细胞 相当于每系500个单元的密度。分别以与其心脏内测定的匹配密度进行乳腺脂肪垫和皮下注射（康宁）支持（扩展数据图3）。对于所有合并的细胞系实验，注射后5周对小鼠进行安乐死，除非它们表现出严重的麻痹或身体状况较差，在这种情况下，它们较早地被安乐死。在公布的方案42之后，在每只小鼠的1×105细胞的密度下进行了JIMT1的后注射，类似于心脏内注射（图5E）。如前所述43进行颅内注射，每只动物的密度为1×103个细胞（图5a – c，扩展数据图10C，d）。 　　使用加热器（Miltenyi biotec）的Gentlemacs Octo分离剂将包括大脑，肺，肝脏，肾脏在内的器官分解。在补充表9中列出了优化的解离溶液和程序（Miltenyi Biotec）。将骨骼（来自两个后肢）切成细碎片，并在解离缓冲液中孵化并剧烈摇动。使用100μm滤波器过滤解离的细胞悬浮液，并用DMEM/F12洗涤两次。然后用染色缓冲液（PBS，2 mM EDTA，0.5％BSA）洗涤细胞悬液，并根据指令（Miltenyi Biotec）与小鼠细胞耗尽珠一起孵育。使用Automacs Pro分离剂（Miltenyi Biotec）对细胞悬浮液进行负选择，以耗尽小鼠基质。使用髓磷脂去除珠II（Miltenyi Biotec），对大脑进行了额外的髓磷脂填充步骤。然后，使用Sony SH4800分选仪和GFP或MCHERRY的固定栅极通过FACS分析所得的细胞悬浮液。DAPI染色用于排除死细胞。对于散装RNA-Seq，将细胞分选为PBS中的单个管，0.4％BSA和RNASIN加RNase抑制剂（Promega），以1,500 rpm离心10分钟，然后在-80°C下将细胞颗粒冷冻，以供下游使用。对于单细胞RNA-seq，将单细胞分选为含有冷TCL缓冲液（QIAGEN）的96孔板中，其中含有1％β-羟基乙醇，将冷冻在干冰上，然后在-80°C下储存。每个板上分类90个单元，将板上的其余井用于阴性和阳性对照。 　　通过RNA-Seq分析了单个细胞系，注射前的细胞系和从转移酶分离的细胞。根据制造商的说明（Zymo Research），使用Quick-RNA MicroPREP进行RNA提取。使用2100生物分析仪（Agilent）上的RNA 6000 PICO套件对RNA进行定量。未测量来自细胞数低于500的细胞数的RNA样品，但将所有样品用作库制备的输入。根据制造商的说明（Clontech），使用Clontech SmartSeq V.4最高2 ng RNA输入的试剂合成cDNA。将全长cDNA与Covaris M220超声量碎片为150 bp，并根据制造商的方案，使用Rubicon Genomics DNASEQ试剂从2 ng的剪切cDNA制备Illumina库。使用KAPA Biosystems Librarys-Quantification套件来定量完成的双链DNA（DSDNA）库，通过量子荧光计，Agilent Tapestation 2200和RT-QPCR定量。独特的索引库以等摩尔比的汇总，并在Illumina NextSeq500上进行测序，并在Dana-Farber Cancer Institute Molecular Biolocal Biology核心设施上使用配对的75 bp读取。使用Maxima First Strand cDNA合成试剂盒，Taqman快速高级主混合物，自定义合成的Taqman Probes和QuantStudio 6 PCR系统（Thermofisher Scientific），对条形码进行了RT – QPCR定量。如前所述44进行单细胞RNA-Seq。 　　由于RNA-Seq库制备将cDNA随机剪切成小块，因此使用Bowtie 2 Local Mode45映射了反复的RNA-Seq读数，以映射到条形码参考文献中，以进行条形码检测和量化。用读取的标准（5'或3'）过滤映射的读数必须覆盖两端的50％的条形码，并使用Samtool进行计数。计算了与单细胞系，预注射细胞混合物和体内转移样品相对应的条形码百分比。 　　对于乳房队列研究，将细胞系J靶向器官I，MI，J的转移潜力计算为：，其中Ci是从器官I分离的癌细胞总数，PJ是条形码定量估计的细胞列J的分数比例，而N是小鼠重复的数量。为了识别与脑转移电位相关的特征，使用了两级比较方法46。对突变，拷贝数，表达，代谢产物和CRISPR-GENE依赖性进行了分析（可在https://depmap.org/portal/上获得）。拷贝数数据使用≤ -1（损耗）和≥1（增益）的截止数量进行了二进制。 　　使用BBSPlit（https://sourceforge.net/projects/bbmap/），通过竞争性映射到人/小鼠混合基因组来消除潜在的小鼠污染读数。然后将其独特地映射到人类基因组的读物被用作用RSEM软件包47进行映射和基因级计数的输入。使用EDGER48中的TMM方法对基因计数估计进行了归一化。对于差分分析，为了正确地说明每个体内样品中癌细胞组成的差异，首先产生了模型的体外混合物的硅中。对于硅硅转移模型中的每个模型，基因I的估计表达tem the the In Comped cy的平均平均值是相应的体内样品中存在的细胞系的加权平均值：其中GI是基因I在细胞系J和PJ中基因I的基线表达是j和pJ中的基因I的基线表达是bar Code in variv in variv in Veriv in v iniv in Veriv in Veriv in Veriv in Veriv in v iniv in Veriv in v iniv in Veriv。然后，使用VOOM-LIMMA46中每个器官的配对设计比较体内和计算机中的体内和硅。使用摄像头或GSEA-preranked方法在FGSEA46,49中实现了GSEA。使用GSVA软件包50进行单个样本GSEA签名投影。基因签名数据集来自MSIGDB（https://www.gsea-msigdb.org/）。 　　Prism细胞系（https://depmap.org/portal/的每种源）适应了苯酚 - 雷德 - 弗洛普Mi1640培养基（Thermofisher Scientific）中相同的培养条件，并如前所述进行了条形码。在条形码之前和之后，进行了SNP指纹身份验证。检查了支原体污染（支原体，Genlantis），仅使用负线进行实验。其中包括八个雌激素阳性乳腺癌细胞系。尽管缺乏苯酚红（弱雌激素），但这些乳腺细胞系仍保持了其活性下游标记的ESR1阳性和表达。这可能是通过胎牛血清（FBS）中剩余的雌激素来解释的。棱镜细胞系基于其体外加倍的垃圾箱，数量相等，每池25行的形式，并冷冻保存直至使用。在体内注射之前，将细胞解冻并回收48小时。为了形成498个细胞系的大池，在注射前立即将20个棱镜池以相等的总数混合。 　　体内实验后，对器官进行组织分离，小鼠基质消耗，并在-80°C下冻结分离的细胞颗粒，如上所述。将颗粒（≤50毫克干重）用蛋白酶K新鲜制备的裂解缓冲液裂解，在60°C下消化热，并在95°C变性10分钟。每100μlPCR体积（每个样品多个技术重复）使用二十微升裂解物进行条形码扩增。使用以下条件进行PCR：95°C持续3分钟；98°C 20 s，57°C 15 s，72°C持续10 s（30个周期）；72°C持续5分钟；4°C停止。合并PCR文库，使用精选大小的DNA清洁和浓缩器试剂盒（Zymo Research）进行纯化，并使用Qubit DSDNA HS Assay试剂盒（Thermofisher Scientific）和2100 Bioanalyzer（Agilent）进行定量。在800 k mm-2的簇密度下，在Illumina Miseq或Hiseq上对具有20％尖峰的Phix DNA的纯化2 nm库进行了测序。 　　将反复的测序读数映射到条形码参考，以生成每个样本/条件的细胞系条形码计数表。测序深入的归一化读数用于计算相对转移电位。细胞系J靶向器官I，RMI，J的相对转移潜力定义为：，在其中CI，J是器官I的细胞系J的读数，PJ是来自预注射群体的细胞系J的读数，N是小鼠的复制样本的数量，M是预注射群体的重复数量。使用自举重采样计算置信区间。 　　CRISPR – CAS9版本的细胞系是通过感染Cas9-blast慢病毒的透明细胞并在5μgml-1 blasticidin中选择的10天，直到杀死未感染的对照。对于合并的体内筛选，在6孔板中的阵列时尚中，用CRISPR指南库（补充表10）感染JIMT1 – CAS9细胞，并在2μgml-1紫霉素中选择4天。此时，未感染的对照被杀死，并且在扰动细胞系中未观察到生长缺陷。抗生素选择后，将细胞合并，并在1μlPBS中以每只小鼠的6×104细胞进行颅内注射。这相当于平均每只小鼠平均每个指南1×103个单元。允许颅内生长进展4周，并处理脑组织在体内测定中采用棱镜的工作流程，但使用针对引导载体的引物进行了放大指导。将列出的测序读数映射到指南参考，以生成每个样本的每个指南的条形码表。使用上四分之一的方法对测序深度进行标准化，并使用LIMMA46中的线性模型对相对耗竭进行了量化。对于单个基因验证（图5C，扩展数据图10C，D），用相应的指南感染了不同细胞系的CAS9表达细胞，在2μgml-1 puromycin中选择4天，并在1μlPBS中以每只小鼠的1×103细胞在1×103的细胞中接受颅内注射。测试了每个基因的两个独立指南，每指导一只小鼠。注射后通过BLI监测颅内生长。 　　使用由Shimadzu Nexera X2 U-HPLC（Shimadzu）组成的液相色谱 - 质谱（LC-MS）系统对极性和非极性脂质（C8-POS）进行正离子模式分析。在LC-MS级异丙醇（Sigma-Aldrich）中，从6孔板培养物中收集细胞提取物，其中含有内标1,2-二二烷酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱（Avanti Polar Lipids）。将提取物在10,000g下离心10分钟，以去除残留的细胞碎片。离心后，将上清液直接注入100×2.1 mm，1.7-μm的生动beh C8柱（水）。该色谱柱在同位方面洗脱，流动阶段A（95：5：0.1 v/v/v 10 mm乙酸铵/甲醇/甲酸铵）持续1分钟，然后在2分钟内，在2分钟到100％移动阶段B. 99.9：0.1 v/v甲醇/甲酸）的线性梯度到80％流动相B（99.9：0.1 V/V甲醇/甲酸）。在正离子模式下使用电喷雾电离以70,000分辨率和3 Hz数据采集速率使用200至1,000 m/z的全面扫描分析进行。其他质谱设置如下：在源碰撞引起的解离5 eV，扫描气体5，喷雾电压3 kV，毛细管温度300°C，S-Lens RF 60，加热器温度300°C，显微镜1，自动增益控制目标106和最大离子时间100毫秒100毫秒。根据参考标准和参考等离子体提取物的比较确定脂质同一性，并用脂质酰基链中的碳总数和脂质酰基链中的双键总数（S）表示。 　　在RIPA裂解缓冲液（Thermofisher Scientific）中制备蛋白质裂解物，并具有完整的无小型EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）。使用湿罐印迹（Bio-Rad）和Odyssey检测系统（LI-COR）使用Nupage Gel（Thermofisher Scientific）进行蛋白质印迹。SREBF1 primary antibody (14088-1-AP, Proteintech), SCD (CD.E10) antibody (ab19862, Abcam), GAPDH (D16H11) XP rabbit monoclonal antibody (5174S, Cell Signaling), β-actin (8H10D10) mouse monoclonal antibody (3700S, Cell Signaling), and使用IRDYE 800CW山羊抗小鼠IgG（926-32210，LI-COR），IRDYE 680RD山羊抗兔IgG（926-68071，Li-Cor）二级抗体。对在不同培养基中培养的细胞进行蛋白质印迹。其中包括带有10％FBS的RPMI1640，具有10％的FBS，具有10％的人脑脊髓液（991-19-P-5，Lee Biosolutions），或1％SM1补充剂（05711，STEMCELL TECH）或脑部滑板调节介质。通过在RPMI1640（无血清）中浸入脑切片（150μm）48小时，制备了脑片条件培养基。如上所述，制备了删除的FBS。 　　从CBIOPORTAL52下载了代理，TCGA和MSK靶向乳腺癌数据集。EMC-MSK数据集（包括615个原发性肿瘤（GSE2035，GSE2603，GSE5327和GSE12276））和65-米特斯塔西岛样品数据集（GSE14020）被如前所述，如前所述处理，并如前所述处理。从参考文献中获得配对的原发性乳腺肿瘤和脑转移RNA-Seq。36.为了排除该数据集中脑基质污染的混杂作用，应用了由GSE52604产生的污染指标，并将污染效应归类，从而产生校正的基因基质。PI3K响应特征来自参考。25,26。如上所述进行了签名分析。使用GPLOTS软件包生成分层聚类和热图。使用GGPLOT2生成其他图。使用存活套件计算生存曲线差异的对数秩检验。使用COXPH函数构建了多元COX比例危害模型（扩展数据图6H）。重叠的意义是使用chisq..test或fisher.test函数计算的。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。