通过ATP的结合和SAM的抗病毒III型CRISPR信号传导

　　补充表1显示了本研究中使用的合成基因，DNA和RNA寡核苷酸序列。 　　编码B. fragilis cas6，Cora，NRN和C.肉毒杆菌的合成基因以G-Blocks（IDT）的价格购买了密码子（IDT），以通过Vector Pehisv5tev在大肠杆菌C43（de3）中表达，以表达八个caniodines，a v5 epepepepco Etsepepco ETCCO ETCCO ETCCO ETCCO ETCCO ETCO） 　　基于PACE的CMR表达质粒PBFRCMR1-6旨在包含六个密码子优化基因CMR1-6（Twist Biosciences），并在CMR3的N末端具有多组氨酸标签。然后，我们将PBFRCMR1-6分为具有相似长度的五个重叠段（指定为BFRCMR A，B，C，D和E）。使用PRCR使用引物BFRCMRSG-F和BFRCMRSG-R（补充表1）扩增这些片段，然后使用Nebuilder HIFI DNA组装主套件组装到PBFRCMR1-6中。通过限制消化和测序验证了获得的质粒PBFRCMR1-6。 　　为了构建CRRNA过表达载体，将密码子优化的CAS6基因合成为G-Block（IDT），并插入Vector PCDFDUET的MCS-2中的NDEI和XHOI限制位点。在含有Cas6的PCDFDUET的MCS-1中，将CRISPR前阵列的合成基因与两个重复序列之间的两个CRISPR重复序列和两个不同的BPII位点克隆到5'NCOI和3'SALI位点中。将靶向四环素抗性基因TER或LACZ的垫片连接到CRISPR前阵列的BPII位点，以获取称为PCRISPR_TET或PCRISPR_PUC的质粒。一个CRISPR阵列，由一个靶向噬菌体P1的晚期启动子激活蛋白（LPA）的间隔物组成，两侧是两个B. fragilis crispr重复序列，通过退火引物BFR-REP-REP-5P-5P-T，BFR-REP-5P-T，BFR-REP-5P-C-C，BFR-REP-REP-REP-REP-REP-REP-3P-3P-CAGE，BFR-3P，BFR-3P，BFR-3P，BFR-3P，BFR-3P，BFR-3P，BFR-3P，BFR-3P，BFR-3P，BFR-REP，BFR-3P，BFR-REP-CREP，BFR-REP-CREP，BFR-REP-CRESBFR-SP-PHAGEIPA-C（补充表1）。然后将阵列连接到MCS-2中包含Cas6的PCDFDUET的MCS-1中，以给出PCRISPR_LPA。 　　为了构建Prat-Duet衍生的质粒，对于单效应子表达，编码CORA，NRN或其变体的合成基因在PBAD启动子控制下插入了MCS-1中的NCOI和ECORI位点。将NRN基因克隆到MCS-1中含有CORA的MCS-2中的NDEI和XHOI位点进行效应子共表达。 　　对于诱变，所有变体均通过PCR使用渗入酶（Thermo Scientific）和野生型构建体作为模板，在两个包含靶突变的重叠引物。通过测序确认正确的变体。 　　B. fragilis nRN，Cas6和C.肉毒杆菌SAM裂解酶使用前面描述的标准程序表达并纯化，并通过TEV蛋白酶去除N端HIS-TAG43。使用相同的程序纯化了与PACE-BFRCMR和PCRISPR_LPA共同转换的细胞表达的CRRNA的CMR复合物。遵循膜蛋白BFRCORA的纯化。简而言之，在用0.2 mM IPTG诱导CORA表达后，将细胞收集并裂解在裂解缓冲液中（50 mM HEPES pH 7.5，250 mM NaCl，5％甘油，10 mM咪唑）。通过在40,000 rpm的4°C下通过超中心分离膜级分2小时，然后重悬于裂解缓冲液补充剂中，并用1％N-二二烷基-β-麦尔替酰胺糖苷（GlyCon生化）并在4°C下孵育1 h。通过镍亲和色谱和尺寸排斥色谱法纯化了溶解的Cora，其中缓冲液含有0.03％的N-二二烷基-β-maltopyranoside。随后，按照与野生型相同的步骤构建和纯化了一系列变体。 　　将PBFRCMR1–6和PCRISPR_TET（或PCRISPR_PUC）共转化为大肠杆菌BL21星细胞。将单个菌落挑选为有能力的细胞制备，以将L泡（100 µg ML-1氨苄西林和50 µg ML-1舒张霉素）摄入，并在37°C下培养过夜。将隔夜培养物稀释为20 mL选择性LB培养基，并在37°C下生长，在220 rpm的摇动下生长，直到OD600达到0.4-0.5。收集细胞颗粒，然后重悬于相等的预冷且竞争的细胞溶液中（60 mM CaCl2，25 mm MES，pH 5.8，5 mm MGCL2，5 mM MM MNCL2）。将细胞在冰上孵育1小时，离心，并将收集的沉淀重悬于0.1卷的同一缓冲液中，其中含有10％的甘油。将等分试样（100 µL）通过液氮冷冻，然后在-80°C下储存。将携带靶基因的100 ng PRAT或PRAT衍生的质粒添加到统一的细胞中，在冰上孵育30分钟，并通过热休克转化。添加0.5 mL lb培养基后，将转化混合物在37°C下孵育2.5 h。未诱导的条件将3 µl的10倍连续稀释液应用于LB琼脂板（补充100 µg ml-1氨苄青霉素和50 µg ml-1 spectinomycin）。在含有100 µg mL -1氨苄青霉素，50 µg mL -1镜头霉素和12.5 µg mL -1四环素的LB琼脂上选择转化体。添加0.2％（w/v）乳糖和0.2％（w/v） - 阿拉伯糖来充分诱导。将板在37°C下孵育过夜。该实验作为两个独立实验，具有两个生物学重复和至少两个技术重复。 　　对于体外合成，将2 µM野生型CMR与ATP和SAM，SAH或Sinefungin孵育（Radiolagelled产品的0.1 mm或0.5 mm的HPLC分析）中的反应缓冲液（20 mm Tris-HCl，pH 7.5，10 mm Nacl，1％Nacl，1％Glycerol和5mmmncl2）中孵育。通过添加5 µM靶RNA-LPA（使用非目标RNA-PUC作为阴性对照）来开始反应，并在37°C下进行1小时或指示的时间。如果需要进行TLC分析或电泳迁移率转移测定法（EMSA），则在每个反应中添加4nmα32P-ATP作为示踪剂，以产生放射性标记的产物。 　　对于体内产生，将质粒PBFRCMR1-6，PCRISPR_TET（或PCRISPR_PUC）和PRAT-DUET转化为E. coli BL21恒星细胞的单个菌落和抗生素（50 µg ML-1 ampicillin，50 µg ML-GML-1 procectiN 5），将PBFRCMR1-6和PRAT-DUET转化。ML -1四环素），在37°C下生长过夜，以180 rpm摇动。将20倍的过夜培养物稀释为20 ml新鲜的L植物，并在37°C下孵育。在达到0.4至0.6之间的OD600后，用0.2％（w/v） - 乳糖和0.2％（w/v） - 阿拉伯糖完全诱导培养物。在25°C下过夜诱导后，将细胞培养与4体积的冷PBS混合，然后在4°C下以4,000 rpm离心10分钟。将细胞颗粒重悬于2 ml冷的萃取溶剂（乙腈：甲醇：水，2：2：1），涡旋持续30 s，并在-20°C下储存直至需要。通过在4°C下以13,200 rpm离心10分钟，然后蒸发直至样品完全干燥，然后重悬于水中并通过HPLC或LC -MS分析，从而获得上清液。收集HPLC数据并使用Chromeleon 6.8色谱数据系统软件（Thermo Fisher）分析。 　　对于核酸酶处理，将100μM化合物与0.02单位P1核酸酶（新英格兰Biolabs）在37°C下的P1反应缓冲液（50 mM乙酸钠pH 5.5）中孵育1小时。用自旋滤波器（PallNanosep®，MWCO 3 kDa）脱发每个反应溶液，然后进行HPLC分析。 　　在最终的3000 UHPLC系统（Thermo Fisher Scientific）上分析了酶促反应，并在260 nm处进行吸光度监测。将样品注入40°C下的C18柱（Kinetex EVO 2.1×50 mm，粒径2.6 µm）。用溶剂A（碳酸氢铵铵）和溶剂B（乙腈加0.1％TFA）以0.3 ml min -1的流量进行梯度洗脱，如下：0-0.5分钟，0％，0％B；0.5-3.5分钟，20％b;3.5–5分钟，50％b;5–7分钟，100％B。 　　LC – MS和LC – MS/MS分析是在微型流速下的陷阱洗脱配置中与SCIEX 6600 QTOF质谱仪耦合的400 LC耦合的。将样品加载到99.95％水中0.5×5.0 mm的YMC Triart C18陷阱弹药筒上，在10 µL min -1时0.05％TFA。3分钟清洗盐分浪费后，将陷阱与分析柱进行在线切换：YMC Triart 150×0.075 mm。用溶剂A（99.9％的水，0.1％甲酸）和溶剂B（20％水80％乙腈0.1％甲酸）进行梯度洗脱，流量为5 µl min -1，如下：0 min 3％B；0–6分钟95％b;6-8分钟95％b;8–9分钟3％b;9–13分钟重新校准了3％B。直接喷洒到质谱仪的ESI TurboSpray孔口的圆柱流量。从120-1,000 m/z以正电离模式收集数据。选择感兴趣的离子在25-45 V的碰撞电压下选择CID碎片，并从50-1,000 m/z收集的片段化光谱。在使用Sciex Tuning解决方案4457953分析之前对质谱仪进行外部校准。 　　无线电标记的SAM-AMP及其类似物通过TLC分离。在35°C下，在20×20 cm硅胶TLC铝板（Sigma-Aldrich）上分析了1 µL放射性标记的产物（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich），在35°C下分析。将TLC板留在TLC腔室中，直到溶剂前部距TLC板的顶部约5厘米，最后使用台风FLA 7000 Imager（GE Healthcare）进行磷化。 　　总共将40 nm 32p-radiolabell的SAM-AMP，SAH-AMP或CA3与不同量的纯化的B. fragilis cora（0.1、0.2、0.4、0.8、0.8、1.6和3.3 µm）在结合缓冲液中（12.5 mm Tris-HCl，pH 8.0，10％（V/V/V/V/V/v）glycerol，0.5 mM，cy cy cora（0.1、0.2、0.4、0.8、0.8、1.6和3.3 µm）孵育。将反应与Ficoll载荷缓冲液混合，然后在天然聚丙烯酰胺凝胶上进行分析（8％（W/V）19：1丙烯酰胺：BIS-丙烯酰胺）。使用1×TBE缓冲液作为运行缓冲液在室温下在200 V下进行电泳2小时，然后进行磷光影像（Typhoon FLA 7000成像仪（GE Healthcare），Photomultiplier管设置= 700–900）。 　　通过孵育1 µM野生型B. fragilis nRN或C.肉毒杆菌SAM裂解酶及其无效变体，并具有100 µM纯化的Sam-Amp，其类似物或标准品，如SAM，PPPAPA，PPPAPA，PAPA或COA混合物（Ca2，Ca3，Ca4和Ca4和Ca4），将SAM-AMP降解测定法进行SAM-AMP降解测定法进行了SAM-AMP降解测定。NaCl，1％甘油和0.5 mM MNCL2）在37°C下1小时或在指示的时间点进行时间课程分析。通过与2卷预磨碎的甲醇混合并涡旋30 s，在4°C下离心20分钟以去除变性蛋白，从而停止反应。将上清液干燥，然后重悬于水中，然后进行HPLC或LC -MS/MS分析。 　　为了检测B. fragilis cora野生型和变异表达，蛋白质是从大肠杆菌C43中的PEV5组织v质粒表达的（DE3）。将细胞在5 mL lb中生长，在37°C下含有50 µg mL -1卡纳霉素，直到OD600达到0.6-0.8，然后是0.2 mM IPTG诱导。在16°C下生长16小时后，通过以4,000 rpm离心10分钟收集沉淀，然后重悬于1 ml裂解缓冲液中（50 mM HEPES，pH 7.5，250 mm NaCl，NaCl，5％甘油，5％甘油，10 mm咪唑）。将十微粒的20次二稀释裂解液加载到预制的Nupage Bis-Tris凝胶（Thermo Fisher Scientific）中，以分离，并使用IBROT 2 DRY印迹系统（Invitrogen）转移到硝酸纤维素膜中。在TBST（20毫米Tris，150毫米NaCl，pH 7.6，0.1％Tween-20）中，将膜在0.03％的牛奶中摇动至少1小时，然后与鼠标抗V5抗体（Invitrogen，cat。No。R960-25，Clone sv5-pk1）延伸0.03％cly in 0.03％cly n.03％clibe no. r960-25 never-neight 1：103％奶牛颤抖。将膜在TBST中用0.03％的牛奶洗涤3次，然后用抗小鼠IgG抗体（Li-Cor Biosciences）在1：20,000稀释液中孵育，在室温下，在TBST中用0.03％的牛奶在室温下以0.03％的牛奶在室温下均匀。在Odyssey Imager System（Li-Cor Biosciences）成像之前，将膜在TBST中再次用0.03％的牛奶洗涤。 　　Nuclease activity of Cas6 was assayed by incubating 1.2 µM B. fragilis Cas6 with 300 nM 5′ end FAM-labelled B. fragilis CRISPR repeat RNA (Table S1, purchased from Integrated DNA Technologies (IDT)) in reaction buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl and 1 mM EDTA), at 37 °C for 5 min.通过在95°C加热5分钟来停止反应，然后通过20％丙烯酰胺，7 m尿素，1×tbe的凝胶进行分析，该凝胶在30 W，45°C下运行2 h。通过将RNA在5 mM Nahco3中孵育，在95°C下pH 9.5产生碱性水解梯，持续5分钟。最终，使用台风FLA 7000成像仪（GE Healthcare）以532 nm（PMT = 600–700）进行成像。 　　将包含两个CRISPR重复序列和一个指南序列（补充表1）的内部放射性标记的转录物RNA与上述相同条件的2 µM Cas6孵育，并在不同时间点上检查了20％丙烯酰胺变性凝胶的反应产物。转录本是通过遵循Megascript®Kit（Invitrogen）的指令而产生的。使用引物二重奏和二重奏（IDT；补充表1）通过PCRISPR_LPA的PCR获得转录中使用的模板。PCR产物（120 ng）与ATP，GTP，UTP，CTP溶液和133nmα32P-ATP作为示踪剂混合，在37°C下在与T7酶混合物的1倍反应缓冲液中在37°C下孵育4 h。然后通过苯酚：氯仿提取和异丙醇沉淀纯化转录本。 　　如先前所述，生成了5'端标记为RNA -LPA的15。使用1 µM野生型CMR（或具有CMR4 D27A的变体）和5'-末端标记的RNA-LPA底物（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，pH 7.5，10 mm NaCl，1％Glycerol和5 mm MM MM MM MNCL2，0.1 ul-1 u（0.1 uncl），使用RNA切割测定法（或具有CMR4 D27A的变体）和5'-末端标记的RNA – LPA底物的RNA裂解测定法进行了37°C。通过添加EDTA（pH 8.0）并用苯酚 - 氯仿提取以去除蛋白质，以在指定的时间点停止反应。在添加等体积100％甲酰胺后，将样品加载到20％变性的聚丙烯酰胺测序凝胶上。凝胶电泳在90 W下进行3–4 h。如上所述，通过磷光想象实现可视化。将5'端标记的RNA-LPA进行碱性水解，该水解产生单个核苷酸分辨率梯子以进行RNA尺寸测定。 　　为了调查Cas10蛋白在III型CRISPR – CAS基因座的系统发育多样性及其与Cora的关联，50,924个细菌和来自NCBI的992个古细菌基因组，标记为“完整”，于2023年3月14日下载了“完整”，使用了Cas10的case4 case4 case4。HMM概况42。E-值小于10-20的命中量，最小蛋白质长度高于500 AA。从结果的2,209个基因组中的CAS10与CD-HIT聚集（相似性截止0.80和单词尺寸5），导致613个代表性CAS10序列。与CRISPRCASTYPER 1.8.042和III型基因座（或III型混合基因座作为组件）一起注释了相关的613个基因组中的所有CRISPR -CAS基因座，以超过30％的比例选择了超过30％的组件。选择该阈值以排除任何SOLO CAS10蛋白，但还包括可能包括效应蛋白（例如Cora）的小CRISPR -CAS基因座。从这一点开始，所有CRISPR – CAS基因座都被视为独立于其宿主，即允许单个宿主的多型III基因座，导致745个基因座。这些基因座中的蛋白质（和2 kb的2 kb上游和下游cctyper报告的基因座边界）使用HMMER 3.3.244搜索CORA，其HMM概况使用CCTYPER42衍生自E-Value临界值10-20。为了创建CAS10系统发育树，使用肌肉5.145将每个基因座的CAS10蛋白与用于大型数据集的SUPER5算法对齐。CAS10系统发育树是使用FastTree 2.1.1146与WAG+CA模型和基于GAMMA20的可能性的2.1.1146构建的。使用ggtree47和ggplot248，在R 4.1.1和Rstudio 2021.9.0.351（http://www.rstudio.com/）中可视化了这棵树。这些步骤包裹在Snakemake 7.22.049管道和R脚本中 （可在github：https：//github.com/vihoikka/cas10_prober上找到）。 　　使用ColabFold Server52实现的Alphafold250,51（AF2）预测了B. fragilis cas10 – cas5 heterodimer和B. fragilis cora单体的结构。使用AlphaFold2将Cora的C末端172氨基酸（包括跨膜结构域）的结构（包括跨膜结构域）的结构，该区域与Cora镁转运蛋白具有可检测到的区域，使用AlphaFold2建模为五烷。然后将五个单独的单体叠加在五聚体跨膜结构上，以产生全长的五聚体B. fragilis cora结构的模型。这种方法避免了该大型建模项目中ColabFold固有的内存和处理器约束。在扩展数据中显示了所有三个模型的局部距离不同测试（LDDT）得分。 　　图4a中的CORA结合测定重复为重复。显示了三个独立的实验和代表性的示例，对Cas6的核酸酶活性（扩展数据图2）和靶RNA裂解活性（扩展数据图3）进行了测定。重复了CORA的纯化（扩展数据图8a），并作为两个独立的实验（两个生物学重复）进行了Cora的蛋白质印迹（扩展数据图8E），并具有可比的结果。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。