微观软离子电源调节神经元网络活动

　　所有材料均购自Sigma-Aldrich（Merck KGAA）。对于所有液滴功率来源，低纤维温度（LGT）琼脂糖均用于建造水凝胶支架。该材料具有足够的凝胶强度，可在室温大约进行制造。将其他材料溶解在30分钟的超声处理（Branson 2800）中，然后与LGT琼脂糖粉末混合，形成各种前体溶液（前凝胶）。最终前凝胶具有2％w/v LGT琼脂糖和以下成分 - 高盐水水凝胶：2 M CaCl2；低盐水凝胶：0.01 M CaCl2，10％V/V聚乙二醇（乙二醇）（数字平均分子量400）。如有必要，NaCl和KCl可以替换CACL2（补充图5）。但是，为了获得最佳输出电压，除了指出，在电气测量过程中使用了CaCL2。阳离子选择水凝胶含有20％W/V聚凝胶（4-苯甲酸钠）（平均分子量70,000），而阴离子选择性水凝胶含有20％w/v聚（平均分子量50,000）。首先将凝胶前溶液加热至90°C以溶解琼脂糖，然后在液滴沉积之前和期间保持熔融。食物染料仅用于摄影，在电记录和生物学实验中不存在。 　　琼脂糖前凝胶液滴沉积在含脂质的油中，并获得了脂质涂层，随后将液滴接触时，随后在界面（DIB）形成脂质双层。脂质是从粉末形式的Avanti Polar脂质购买的，并存储在-80°C下。使用前，在真空下通过0.22-μm过滤器（康宁）过滤了未探测和硅油AR20（Sigma-Aldrich）。通过将琥珀色达到室温并将脂质溶解在25 mg ml-1的无水氯仿（Sigma-Aldrich）中来制备脂质膜，以提供脂质储备溶液。使用玻璃注射器（汉密尔顿），1,2-二羟烷酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱（DPHPC，90μL）和1-甲米酰基-2-烯酰基-SN-甘油酸-SN-甘油-3-甘油-3-磷酸胆碱（POPC，40μL）的脂质溶液（DPHPC，90μL）被转移到Tefl玻璃棒上（tefl）玻璃vial（popc，40μl）异丙醇。氯仿在缓慢的氮流下蒸发，而小瓶则用手旋转以产生均匀的脂质膜。将薄膜在真空下干燥24小时，并在氮下储存在-80°C下直至使用。如果需要进行液滴制造，则将膜在室温下持续30分钟，然后将2 ml的未固定和硅油和硅油（35:65）的预混合溶液加入膜中，然后将其超声（Branson 2800）持续1小时。脂质的总浓度为2 mM，DPHPC/POPC的摩尔比为2：1。将脂质膜保持最多2个月。 　　用三维打印机（FormLabs，Solid Print3D）生产的定制透明树脂模具中形成了液滴。根据模具的形状，形成了各种自组装模式。通常，霉菌填充200μl含脂质的油。在每个模具中，将凝胶溶液的液滴用可编程的微型注射器（femtojet，eppendorf）沉积，从负载的玻璃喷嘴（formtotips，eppendorf）中弹出液滴，其体积从女性化剂到微质量。通过将液滴彼此接触并允许双层在几秒钟内发生的界面形成，从而获得了单滴动力单位。较大的液滴网络自组装成模板中的预先设计的形状，例如六边形的“花样”模式（图3）。形成后，将液滴网络以及周围的油通过毛细管作用将截短的移液器尖端吸引到截短的移液器尖端中，然后可以重新排列。例如，通过使用微型安装模板将其堆叠在三个维度中。红外辐射加热器（Beurer，150 W）用于将喷嘴的温度和树脂模具保持在大约37°C下。制造后，液滴功率源可以在37°C的潮湿孵化器中储存超过2天，以防止水蒸发（图1F），而不会因绝缘DIB而无需耗散能量。 　　为了使用电源，通过将电源转移到油中而无需脂质并在低温下触发全凝胶来除去脂质绝缘材料。为此，将沉积的液滴电源在环境温度（约22°C左右）下进行5分钟，以部分凝胶琼脂糖，并让液滴达到其平衡接触角。接下来，通过从模具中除去脂质 - 油溶液，然后加入500μl新鲜的有机硅油，将液滴电源用硅油洗涤，不含脂质。转移到无脂质油后，将液滴电源移至冰箱（4°C）1分钟，以使绝缘DIB的完全破坏，并形成连续的水凝胶结构。对于原位测量，在DIB和低温凝胶破裂期间的电输出，毛皮冷却器（14 W，62×62 mm，RS Pro）和散热器（85×85×85×6 mm，RS Pro）集成到液滴测量系统的底部（扩展数据图2）。这种集成使液滴沉积，电源激活和电气测量在多合一设置中。 　　通过将SEB（分子量约118,000，Sigma-Aldrich）与重量F68薄片（Pluronic，Sigma-Aldrich）和Undecane-Hexadecane油（按体积为50:50）混合1％，以1％的浓度将基于聚合物的有机凝胶与1％的分子量（分子量，Sigma-Aldrich）和1％组成。然后将混合物在95°C的封闭小瓶中搅拌。一旦形成清晰的液体，使用前将其冷却至37-40°C。通过在最后一个油转移步骤中用熔融聚合物 - 油混合物代替有机硅油来进行有机凝胶封装。无脂质有机凝胶（1 mL）用于洗涤和覆盖液滴电源。转移到有机凝胶后，封装的液滴电源被移至有机凝胶固化的冰箱（4°C）。最终构造是从模具中轻轻提取的，形成了独立的液滴电源。电极可以穿过固化有机凝胶以测量功率输出。 　　我们使用AG/AGCL电极（直径100μm，Sigma-Aldrich）接触液滴电源的第一个和最后一个隔室，它们都是高盐液滴。液滴中的离子通量转换为外部电路中的电子流（补充注释1）。我们使用Keithley 617可编程的万用表录制了VOC和ISC，该设置为电压测量模式，具有高输入阻抗（约2tΩ）或电流测量模式作为反馈型PICOAMMAMETER。通过监视电压和电阻范围为0.01至0.5MΩ的电流来评估液滴电源的有效输出功率。 　　根据补充图3所示的实验设置，在各种设置下的液滴电源的输出电压和电流进行了模拟。我们使用了Comsol Multiphysics 5.6和耦合的Nernst Planck Poisson方程。假定两个离子选择性液滴充当离子交换膜，相反的固定电荷为1,000 c m-3。模型的离子为K+和Cl-，在高盐和低盐液滴中定义的初始浓度分别为2 m和0.01 m。界面的建模条件是第三级电流分布和Nernst Planck界面的组合，以及泊松型电荷保护。使用时间变化（瞬态）分析计算结果，其时间范围为0至1,800 s。 　　为了点亮发光二极管（LED；图3H），将四种类型的液滴沉积在螺旋模具中（图3F），以串联连接到红色LED（Broadcom HLMP-K150）的20个功率单元。电容器（0.47μF，RS Pro）可以串联连接，以存储从液滴电源中释放的能量，然后点亮红色LED（补充图7a）。基于555-Timer芯片（TLC555IP，RS Pro）的脉冲发生器电路也由液滴电源提供动力（补充图7C）。 　　神经祖细胞（NPC）来自人类诱导的多能干细胞（IPSC），由S. Cowley博士（James Martin干细胞设施，牛津）提供。根据已发布的程序进行了IPSC和NPC培养的神经分化28,48。在神经维持培养基中，NPC将NPC保持为Geltrex涂层（Life Technologies，A141133-02）培养板上的二维依从性培养物，该培养基由N-2培养基和B-27培养基组成（1：1 V/V）。N-2培养基包含DMEM/F12培养基（Life Technologies; 21331020），1×N-2（Gibco，17502048）和1毫米谷氨酸（Gibco，35050-038）。B-27培养基含有神经质培养基（Gibco，21103-049S），1×B-27（Gibco，17504044）和1 mm谷歌（Gibco，35050-038）。通过与Accutase（Life Technologies，A11105-01）在37°C下孵育5分钟，并通过轻柔的感受器将NPC（由于神经诱导）（由于神经诱导）收集NPC 5分钟。然后将细胞离心（200G时为5分钟），然后去除上清液。将预透射的母质（Corning）添加到细胞颗粒中，并混合以制造每毫升2×107个细胞的生物墨水。 　　用红色荧光蛋白（RFP）标记的NPC衍生自RFP -IPSCS28,48。将细胞培养并以与未标记的NPC相同的方式进行培养，但在神经维持培养基中添加了2.5μgml-1紫霉素（Thermo Fisher Scientific）进行RFP选择。 　　小鼠脑组织是从M. Lei获得的。成年C57BL/6只小鼠在附表1程序后被杀死。通过手术去除大脑，并使用配备有HP35涂层的Microtome刀片（Thermo Fisher Scientific，3150743）的压缩型振动微型群（Precisionary，VF-300-0Z）制备300 µm的大脑切片。将脑切片收集在用碳原料（95％O2和5％CO2）气泡的冷伯爵平衡盐溶液中收集，并转移到六孔板中的30毫米细胞培养插入物（Millicell，PICM0RG50）上。将脑切片在37°C下孵育，含5％CO2，在带有SM1补充剂（Stemcell Technologies，05792），25％马血清（Gibco，16050130）和100 U Penicillycillin -Stroptheptycin（Gibco，Gibco，15140140122）的75％脑培养基中不超过3天的脑切片。 　　该程序涉及两个主要步骤。首先，我们使用自制的微流体系统来生成三维细胞微弥补49。然后，我们培养了微动物，并用使用神经元培养基制成的低盐琼脂糖水凝胶涂层，直接在使用之前形成具有连续的水凝胶结构，并带有附着的液滴电源（图4A）。 　　在构建神经微动物的第一步中，将收集的神经细胞（NPC）颗粒并重悬于Matrigel（康宁）中，并以每毫升2×107细胞的形式以8°C的形式加载到注射器中。然后将载有细胞的矩阵和油（四烷，Sigma-Aldrich）泵入三向聚二甲基硅氧烷（Sigma-Aldrich）连接器中，可通过可编程的Nemesys Insringe泵（Cetoni）泵送。在优化的流速下，在聚氟乙烯管（CoLe-Parmer）中形成了含有载体油的细胞的球形矩阵液滴。液滴直径由管的内径（例如570μm）确定。然后，将含有细胞的球形微作用的管子和油在37°C的培养室中放置2小时，以允许母质凝胶凝胶化，从而形成三维细胞的微动物。最后，从出口管中弹出微作用，转移到培养基中，并在使用前进行培养。形成神经微动物的一天被标记为第0天。在补充了50 U ML-1青霉素和链霉素的神经维持培养基中培养了三维神经微动物（Gibco，15140-122）。每3天每3天更换细胞培养基。 　　在将神经组织嵌入琼脂糖液滴中的第二步中，通过使用截短的移液尖（200μl）将培养的神​​经微动物转移到充满硅油的模具中。红外辐射加热器用于将周围温度保持在大约37°C的位置。在与7000系列汉密尔顿注射器添加低盐水凝胶溶液（0.5μL）之前，请仔细去除残留培养基，以覆盖每个神经微动物。低盐水凝胶含有2％琼脂糖，约1 mm Ca2+，距神经元培养基约4 mm K+和约140 mm Na+。由于周围的油，水凝胶溶液迅速覆盖了神经微动物。然后，将霉菌保持在20°C下10分钟，以固化水凝胶涂层。最终的凝胶涂层统一了不同神经构建体的尺寸变化，使其易于处理，限制了离子电流，并在嵌入的微动物上消散了可能的压缩力。然后将涂层的液滴返回到培养基中进行染色，并用于神经元调节的实验。离体小鼠脑切片也可以根据相同的第二步处理，以获得包含该组织的液滴。 　　为了对电源调节后神经元的活死分布形象，将含神经元的液滴与2.5μm钙调蛋白AM（C1430，Thermo Fisher Scientific）和5.0μm碘化丙基丙二醇（Sigma-Aldrich）一起孵育60分钟，在37°C进行Espifluorecemsiccemscope（Leica）之前（sigma-Aldrich）60分钟。根据制造商的说明，使用Prestoblue分析（Thermo Fisher Scientific）来确定活细胞数和生存能力。使用微板读取器（Clariostar Plus）来量化荧光，从而量化活细胞的数量。 　　对于免疫染色，首先将神经微动物固定在4％V/V甲醛（Sigma-Aldrich）中30分钟，然后在室温下固定，然后在50 mM甘氨酸（Sigma-Aldrich）中淬灭。将样品与阻塞溶液一起孵育，在含0.1％V/V Triton X-100（Thermo Fisher Scientific）的Triton磷酸盐缓冲盐水中5％驴血清孵育1小时。在阻断溶液中添加了TUJ1（突触系统）和caspase 3（Thermo Fisher Scientific）的一抗，并将样品在4°C下孵育过夜。第二天，将样品在磷酸盐缓冲盐水中洗涤3次（每个10分钟），然后在室温下与二级抗体一起孵育2小时。然后将样品在磷酸盐缓冲盐水中洗涤另外3次（每个10分钟），然后在特里顿磷酸盐缓冲盐水中与4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（5μgml-1）一起孵育15分钟，并进行最终洗涤。使用荧光共聚焦显微镜（Leica SP5）获取所有免疫染色神经微动物的Z-stack图像。 　　由三个高盐和两个离子选择性液滴组成的液滴设备沉积在一个集成在成像盘上的圆形容器中（µ-dish，ibidi）。用无脂油转移油后，液滴形成连续的水凝胶结构。然后将液滴装置连接到包含神经微动物或脑组织的三个低盐水凝胶液滴上，从而完成环结构（补充图11）。然后，液滴设备可以产生流动在闭环中的神经元或组织上的离子电流。将含有神经元或脑组织的液滴与液滴设备结合10分钟，然后将其放回培养基中20分钟，作为一个调节 - 递延周期。每个周期后，神经元恢复到初始活性状态（扩展数据图5）。为了研究与液滴装置的网络相互作用，将含神经元的液滴用GABA（Sigma-Aldrich）以30μM的浓度处理，以前已确定为抑制性但无毒浓度40。 　　对于钙成像，根据制造商的说明，使用了Fluo-4直接钙测定试剂盒（Invitrogen，F10471），以测量钙活性。简而言之，将含有神经元或脑组织的液滴转移到48孔板上，并与神经维持培养基和Fluo-4钙成像试剂（1：1 V/V）一起在37°C下孵育1小时。在Invitrogen建议的光学设置下，通过使用EX/EM 488/525 nm的荧光共聚焦显微镜（Leica SP5）提出的光学设置，以每帧1.28 s获取延时（XYZTime）荧光图像。z堆栈图像是在神经微动物的底部到上面约50μm之间的，每个图像的步骤为5μm。然后进行最大Z投影以生成最终的延时图像。用立体显微镜（Leica EZ4 W）和宽场光显微镜（Leica DMI8）记录了明亮场图像。使用Leica Application Suite X和Fiji（ImageJ）处理图像。 　　对于膜电位成像，根据制造商的说明使用了Fluovolt膜电位试剂盒（Thermo Fisher Scientific），以测量神经元膜电位。在制造商使用荧光共聚焦显微镜（Leica SP5）建议的光学设置下，以每帧0.37 s的形式获取延时荧光图像。使用Leica Application Suite X和Fiji（ImageJ）处理图像。 　　使用斐济徒手工具和轮廓图功能获得神经元的荧光强度。为了在选定的线图上获得Ca2+和Cl-的相对离子浓度分布（补充图9B），将相对浓度（C）定义为 　　Fluo（t）是时间t的荧光强度。F0是形成连续水凝胶网络之前的初始荧光强度。由于不同的荧光响应，ffinal是Ca2+ 20分钟后的三个液滴的最大荧光强度（荧光响应），而Cl-的最小值（淬灭响应）。 　　为了计算Ca2+波在神经元网络中的移动速度（图4D，E），我们需要首先计算神经元网络的荧光中心。我们选择了加权均值的方法来表示荧光中心的位置，该位置定义为 　　∑强度是所选线图上每个荧光值的总和。∑（强度×距离）是每个荧光值的总和，乘以所选线图的距离距离距离距离（细胞或脑组织的边界）的距离。知道荧光中心的位置，我们可以计算荧光的相对位移（图4F），该位置定义为 　　∆（加权均值距离）是液滴设备附着之前和之后加权均值的变化。总长度是所选线图的长度。 　　使用原点进行统计分析，并通过未配对的单向方差分析确定P值。每个实验使用至少三个独立的液滴功率来源。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。