小鼠全脑脊柱投射神经元的转录组分类学

　　所有实验程序均根据波士顿儿童医院的机构动物护理和使用委员会批准的动物方案进行（协议号20-05-4165 R）。为小鼠提供食物和水的随意，安装在12小时的光线/黑暗时间表（上午7点至下午7点），每个笼子中的性别不超过五只小鼠，并且在到达后可以适应1周。C57BL/6J野生型小鼠（Jackson Labs，NO 000664应变）用于所有SNRNA-SEQ和电生理实验，并生成野生型逆行标记的组织学数据集。转基因驱动线（补充表14）用于组织学CRE依赖性逆行标记数据集（即，通过表达Cre依赖性GFP的AAVS生成的逆行标记生成的逆向标记数据集）。SSV4（补充表1）从15只成年小鼠（8位雌性和7名雄性）中产生了核悬浮液（8例雌性和7名男性），而15只小鼠（6雌性和9名男性）。相等数量的雄性和雌性小鼠用于组织学和电生理研究。 　　为了逆行标记SPN，注射了AAV2/Retro-Syn-H2B-GFP和AAV2/Retro-syn-H2b-Mscarlet（由波士顿儿童医院病毒核心产生）。将成年小鼠（p42）用腹膜内注射（KX，100-120 mg kg-1氯胺酮，10 mg kg-1 xylazine）麻醉，并放在立体框架上。对于宫颈水平（C4-6）注射，沿颈椎水平的椎骨进行了背切口。剖析上覆的肌肉以暴露颈椎柱，并在C4–6进行椎板切除术以暴露脊髓。然后，将2.4 µl的AAV2/retro-syn-H2b-GFP（每毫升5×1012基因组拷贝（GC ML-1））以0.40 mm的横向至中线和0.60 mm和0.60 mm和0.60 mm和1.00 mm的depth注射，使用玻璃微孔（在直径为25 µm时）。缝合背肌层，并用无菌伤口夹闭合皮肤。对于腰部水平（L2-4）注射，在0.35 mm横向到中线和0.60 mm和1.00 mm深度的情况下，使用AAV2/RETRO-SYN-H2B-MSCARLET（5×1012 GC ML-1）病毒重复此过程。使用相同的病毒滴度，体积和坐标来评估注射位点病毒的扩散，对没有逆行标记能力的AAV2/2-H2B注射。 　　在p56时，用KX逆行标记的小鼠用磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行了安乐死，然后在PBS中用磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行了安乐死。解剖头骨和脊柱，并在PBS中的4％PFA中固定24小时。然后将大脑和脊髓组织微解析并在30％蔗糖中冷冻保护，嵌入并冷冻在最佳切割温度培养基中，并使用低温恒温器（大脑：50 µM冠状冠状切片，通过尾部MED，四个系列；脊髓； 40 µM脊髓； 40 µM冠状或冠状动脉或脊髓）。将切片用PBS洗涤，然后在室温下用阻塞溶液（5％正常驴血清，0.5％Triton-X）处理1小时。Floating sections were incubated in primary antibodies (AVES chicken-anti-GFP, Rockland rabbit-anti-red fluorescent protein (RFP); 1:500 dilution in blocking solution) at 4 °C overnight, washed three times for 10 min with PBS, and subsequently incubated with secondary antibodies (Alexa Fluor 488 donkey-anti-chicken, Alexa Fluor 594在室温下，驴抗兔子1：500稀释2小时。最后，将切片用PBS洗涤，并用DAPI Fluoromount-G安装介质安装，并用透明的指甲油密封，并在4°C下储存直至成像。对于GABA染色，使用30 µm的冠状切片，并与室温下的兔-Anti-Gaba（Sigma A2052，1：1000）一起孵育20小时。在Olympus VS120虚拟幻灯片显微镜上以×10放大倍数成像整个部分。在Zeiss LSM 900共聚焦激光扫描显微镜（ZEN 3.3软件）上以×20或×63的目标获取较高的放大图像。 　　使用精密蒸发剂（Vetequip）将三只9周龄的UCN-CRE小鼠（两名男性和一名雌性）用100％O2的5％异氟烷麻醉，并放置在立体定位框架上。在整个手术过程中，在100％O2中，在100％O2中保持了麻醉的手术平面。进行了1.5厘米的横向切口以露出头骨，并用无菌棉签缩回皮肤和下面的组织。使用一个×40的中心范围（KOPF仪器）横向和rostro -caudal轴上的头骨平整，以使Lambda和Bregma处于同一平面。为了揭示大脑的表面，使用碳钢毛刺（精细的科学工具，0.5 mm的尖端直径）钻入2毫米直径的孔，该碳连接到高速旋转微型运动试剂盒（Foredom），并以3.5 mm的尾部为中心（前尾）（前骨前杆菌（前） - posterior（ap）-3.5 mmmmmmmmmmmmmm，medial-selal（MERMAL），MM，MM，MM，ML（MMM）。使用三轴电动操纵器（Scientifica，IVM Triple）将斜角（30°）连接到注射泵上的硼硅酸盐玻璃移液器（世界精密仪器，Nanoliter 2000）。移液管以每秒的10 µm下降，并在两个深度（在两个深度，背偏（DV）-3.5 mm和-3.5 mm和-3.1 mm上注入100 nL的AAV2/9-CAG-FLEX-CHR2-CHR2-TDTOMATO（5×10-12 GC ML-1）。注射后，移液器在每个DV深度保持5分钟，然后缩回。 　　如上所述，在4-6周大的SPP1-CRE小鼠接受了AAV2/Retro-Flex-FLPO的宫颈和腰椎注射（AddgeneNo。387306，由波士顿儿童医院病毒核心生产的病毒，5×1012 GC ML-1）。一周后，这些小鼠被头部固定在立体定向框架上，以进行脑注射。进行颅骨切开术以暴露于AP -3.8 mM，ML -0.8毫米的脑表面。然后，将100 µL的AAV2/8-SYN-FLPX-RC [Chrimsonr-Tdomato]（AddgeneNP。128589，由波士顿儿童医院病毒核心产生的病毒，5×1012 GC ML-1）缓慢地注入DV-4.0 mm以下Dura下方。 　　局部注射四周后，将小鼠麻醉，通过用PBS和4％PFA的心脏灌注对安乐死进行了安乐死，并准备好脑和脊髓组织进行冷冻切除，如上所述（脑：50 µM冠状切片；脊髓；脊髓； 40 µm冠状切片，四个系列）。如上所述进行IHC，使用Rabbit-anti-RFP（ABCAM AB34771; 1：1,000）和山羊anti-Chat（Millipore ap144p; 1：100）主抗体，以及相应的二级抗体（Alexa Fluor 594 donkey-anti-anti-rabbit，Alexa fluor 647 donkey-ankey）。在Zeiss LSM 900共聚焦激光扫描显微镜上以×20物镜为×20物镜作为Z堆放。为了创建轮廓图以描绘轴突密度，首先将代表性的脊髓轴突投影图像转换为8位黑白TIF格式，然后加载到MATLAB中。在使用“ strel”函数的背景减法之后，将图像用120个任意单元的阈值进行了二进制，并且仅保留具有超过两个连接像素的信号。将图像分为20 x 20箱，并计算每个网格中阈值像素的数量。然后用100 x 100箱将计数像素密度平滑。从平滑的结果中产生轮廓图，然后在倒置的脊髓图像上覆盖。 　　使用QuPath（v.0.4.1）（V.0.4.1），在八个主要大脑区域（RFA，M1M2S1，S2，HY，MB，PON和MED）中量化了SPN。总而言之，将VS120幻灯片扫描仪图像（四个）IHC加工冠状系列的图像加载到Qupath中。多边形工具用于手动注释ROI。然后使用“阳性细胞检测”（对于GFP和MSCARLET核）和“复合分类器”（对于GFP+/MSCARLET+ NOCLEI）创建分类器。每个ROI节省了“注释结果”，每回合量的核数量乘以四个（仅量化四个冠状系列之一）以获取总脑数量。n = 5逆行标记的大脑被量化，以在八个ROI中的每一个中获得总SPN计数（n = 3用GFP标记为颈绳和RFP，将带有GFP的n = 2纳入腰椎和腰椎索）。 　　Qupath用于测量在5层中与逆行标记的组织（没有IHC维持未散布荧光水平的IHC）相对于非层5的GFP和MSCARLET标记为核的荧光强度。如上所述，多边形工具用于手动注释皮层第5层，上CTX（层1-4）和下部CTX（第6层），以及“阳性细胞检测”和“复合分类器”，以检测GFP+，MSCARLET+和GFP+/MSCARLET+/MSCARLET+核。从ROI节省“检测结果”，并从“ nucleus.gfp.mean”和“ nucleus.mscarlet.mean”结果中提取荧光强度。通过Wilcoxon检验（GGPUBR）评估统计显着性。 　　使用Tissuecyte STPT平台对整个逆行标记的大脑进行了成像。在p56时，用KX麻醉逆行标记的小鼠，并通过PBS和4％PFA/PBS对跨心动灌注进行安乐死。解剖头骨和脊柱，并在PBS中的4％PFA中固定24小时。然后对大脑进行微解剖，用PBS冲洗并嵌入共价琼脂糖中。通过用磷酸盐缓冲液轻轻搅拌琼脂糖和Naio4在10 mM Naio4中的4.5％琼脂糖溶液（PB; 0.42 g L -1磷酸钠，0.92 g l -1二硫代磷酸磷酸钠）在带有0.2 µm滤光片的室温下在室温下在室温下2-3 h制造了2-3小时。然后使用微波炉将琼脂糖煮沸，然后冷却至60–65°C以嵌入大脑。使用快速键粘合剂将琼脂糖包裹的大脑安装在组织中。在获取图像期间，样品浸入了PB中。用10 µm堆栈和50 µm颤动的平面以每像素为1.38 µm的XY分辨率捕获图像。图像用Tissuevision的专有缝合算法“缝合器”缝制。 　　使用NeuroInfo（MBF Bioscience，V.2023-1-1）对标记的核进行了分割并重建。首先将缝合图像用微框+堆叠。然后将堆叠的图像注册到具有NeuroInfo中的体积注册函数的Allen Mouse Common Coartior框架（Allen CFF）。在红色（MSCARLET）或绿色（GFP）通道的H2B信号分别标记。根据其注册区域对检测到的核用不同的颜色手动注释。三维（3D）重建的视频和水平，冠状或矢状投影通过NeuroInfo的3D可视化窗口输出。 　　通过调整AIBS的协议来制备大脑。在p56时，用异氟烷和心脏灌注25毫升冰冷的含氧加含氧人工脑脊液（ACSF-O2; 0.5毫米氯化钙二水合物，25毫米 - 氯酸盐酸盐，10毫米硫酸盐，10毫米硫酸盐，硫酸含量25毫米，硫酸含量为10毫米，硫酸盐含量为1.5 mm，硫酸盐含量为1.5毫米，硫酸盐含量为1.5毫米，phosphate monobasic monohydrate, 2.5 mM potassium chloride, 3 mM sodium pyruvate, 5 mM sodium -ascorbate, 25 mM sodium bicarbonate, 2 mM thiourea, 96 mM HCl, 96 mM N-methyl--glucamine, 3 mM myo-inositol, 12 mM N-acetyl--cysteine,0.01毫米牛磺酸）。然后将大脑迅速解剖，并将其放在ACSF-O2浴中的丙烯酸脑基质中。对于10倍样品，将大脑切成1 mm冠状基质，直到-3 mm（相对于Bregma）捕获前脑ROI。然后将大脑转移到MB和HB的1 mM矢状基质中，以允许对这些ROI进行全面的解剖。对于SSV4，使用1 mM的冠状基质将整个大脑分开，以使ROI的更精细的解剖。然后将切片转移到含有0.0132 M海藻糖的冰冷ACSF-O2的Sylgard涂层的解剖碟中。拍摄了完整的组织的明亮菲尔德和荧光图像，以记录Zeiss立体发现的ROI，并发现显微镜，然后用针刀片微动物显微解剖。ROI解剖是通过可视化目镜中荧光标记区域的可视化来指导的。获取了解剖的ROI进行验证的Brightfield和荧光图像。对于10倍，目标ROI为RFA，M1M2S1，S2，HY（冠状切片），MB，CB，PONS和MED（矢状切片）。组织在收集和核分离之间冷冻，以使从多个动物汇集ROI，以为10倍平台收集足够数量的核。将ROI放在剃须刀上，并使用Whatman滤纸吸收多余的CSF。然后将剃须刀放在液氮蒸气中，直到组织冻结。将冷冻的组织转移到微量离心管中，并带有冻结的水分储水库的最佳切割温度培养基，以防止霜损伤并储存在-80°C下，直至使用。对于SSV4，靶向解剖是由皮质第5层，红色核，蓬蒂恩网状核和GRN制成的。解剖区域未冷冻，而是将其转移到微量离心管中的ACSF-三链甲糖中，并将其储存在冰上，直到完成解剖后的核分离。 　　通过调整AIBS的协议（https://doi.org/10.17504/protocols.io.bq7emzje）来分离单核。将微分解的区域转移到均质缓冲液中（10 mM Tris pH 8.0、250 mM蔗糖，25 mM KCl，5 mM MGCL2、0.1％Triton-X 100、0.5％rnasin plus，1 x蛋白酶抑制剂和0.1 mm DTT），并将其放入1 ml dtt中。对于10倍样品，每次重复的ROI汇总了来自多个动物的冷冻组织（扩展数据图3B）。对于SSV4样品，将每种动物和ROI作为单独的样品保持。将组织用15-20杆的松散的杵匀浆，然后用15-20杆紧紧的杵中风。皮层下区域具有更多白质区域需要大量的笔触才能使组织均匀，尽管发动机后仍未实现白质的碎片。将另外1 mL的均质缓冲液添加到悬浮液中，并使用1 mL均质化缓冲液润湿30 µM的细胞滤网。一半的核悬浮液通过细胞过滤器进入15 mL圆锥管以去除大碎片。将另外1 mL的均质缓冲液添加到悬浮中，然后将所有核悬浮液通过细胞过滤器进入15 mL圆锥管。将最后2 mL的均质缓冲液添加到悬浮液中，以将任何剩余的核冲洗到悬浮液中，然后通过过滤器，总共6毫升均质化缓冲液 - 核核悬浮液。在4°C的摆桶离心机中以900克旋转10分钟。离心后，除去上清液而不会干扰锥管底部的可见颗粒，并将沉淀重悬于0.5-1.0 mL的排序缓冲液中（PBS为0.8％BSA和0.5％RNASIN PLUS）。最后，将4'-6-Diamidino-2-苯基吲哚（DAPI）以0.1 µg ml-1的最终浓度添加到核悬浮液中，并在冰上孵育直至风扇。 　　使用风扇从细胞核悬浮液中富集了SPN。对于10倍，使用BD FACSARIA II对单个SPN核进行分类，该核II具有70 µm自定义压力喷嘴（50 psi）。通过在“四向纯度模式”上排序单核，并在DAPI阳性上进行门控，同时排除碎屑和聚集体，然后在GFP和/或Mscarlet信号上进行门控（扩展数据图3D）。使用双向分类（与Mscarlet阳性和双重阳性分开的GFP阳性分类（PCR）反应（PCR）管（PROCOCO）（用5％BSA过夜），对核进行分类（最大数量为16,000个核）。分类后，将PCR管短暂离心，然后放在冰上直至使用10倍平台进行。对于SSV4，使用Sony SH800细胞分选仪或MA900多应用细胞分选仪对单个核进行分类，并使用100 µM芯片分类。单核在“单细胞”模式下排序，并通过在单线DAPI阳性上进行门控捕获，然后在GFP和/或MSCARLET信号上门控以特异性分类宫颈和/或Lumbar Project SPNS。基于索引的基于板的分选用于将GFP阳性，MSCARLET阳性和双阳性核对含有11.5 µL的智能seq V4裂解缓冲液进行分类。然后将裂解的风扇分类的核短暂离心，冷冻在干冰上，并存放在-80°C下，直到使用SSV4平台进行。 　　使用Chromium Next Gem单细胞3'KIT v3.1（1000268，10X基因组学）进行10倍数据集的处理。为了优化产量，将排序的核悬浮液直接加载到10倍铬控制器中，而没有后粉后旋转并重新悬浮。根据制造商的协议进行了逆转录，cDNA扩增和图书馆构造。在Illumina Novaseq 6000上对文库进行了测序，该库的测序深度为每个核的120,000个读取。使用CellRanger（v.6.1.2）将测序读数与鼠标参考转录组（MM10，2020-A）对齐。 　　SSV4处理是根据先前建立的过程进行的55在protasts.io（https://doi.org/10.17504/protocols.io.8epv517xdl1b/v2）上可用。用于测序的SSV4超低输入RNA试剂盒（634894，takara）用于反向转录poly（a）RNA并放大全长cDNA。将样品在八孔条中放大16-21个周期。然后，根据制造商的说明，使用Nextera XT DNA XT DNA库制剂（FC-131-1096，Illumina）进行定制索引集（集成DNA技术），并根据制造商的说明进行了修改，以减少所有试剂和cDNA输入的数量，以减少原始协议的0.2××。在Illumina NovaseQSP-XP或Illumina NextSeq2000上对库进行了测序，其目标是每个核的500,000个读数。使用Star（V.2.7.1a）将样品与小鼠参考MM10/Genecode.vm23对齐。 　　使用Cellbender56（v.0.2.1，“ remove-background”，默认参数）从每个样品中删除环境RNA污染。然后，我们使用seurat v.4.3.0进行下游分析57。首先，使用Seurat的“ Merge”功能（Merge.Data = true）合并了从相同的Roi添加解剖中复制，然后计算源自每个核的线粒体RNA的计数百分比。对细胞核进行过滤，以保留小于5％的线粒体计数且检测到2,000多个基因的核。进行了每个样品的标准处理，其中包括特征表达式的归一化（标准配置），鉴定具有FindVariableFeatures（selection.method ='vst'，nfeatures = 2,000）的最大基因和缩放表达值（ScalEdata）。然后，我们用30个组件（Findneighbors）进行了主成分分析（RUNPCA），并使用Louvain算法聚集了核，分辨率设置为0.5、1、2和3，以获得一大批​​粗糙至细簇（Findclusters）。最后，执行UMAP嵌入（RunuMAP）。 　　然后评估核对每个ROI的二阶标记。通过MKREF函数从CellRanger（V.5.0.1，在UCLA的服务器上）添加了GFP或MSCARLET序列。将带有GFP或MSCARLET序列的参考基因组上传到10倍云分析服务器，并通过CellRanger（V.6.1.2）检测到包括GFP或MSCARLET在内的转录组计数。由于GFP和MSCARLET序列相似93.60％，以提高检测灵敏度和特异性，因此我们使用具有GFP序列的参考基因组来检测在GFP信号上排序的样品，并使用MSCARLET序列使用参考基因​​组来检测在McScarlet信号上排序的样品。从原始计数矩阵中至少具有一个GFP或MSCARLET计数的核被认为是XFP+核，并且在每个群集中计算了XFP+核的百分比。通常，使用10％的阈值来评估一阶和二阶标签。PON和MED被汇总为“后脑”进行此分析，因为它们聚集在下游分析中。 　　SPN类型是通过10倍数据的多回合迭代定义的。除去少于10％表达XFP的核的簇后，每个seurat对象由相同的ROI富集解剖复制组成的每个seurat对象进行了标准Seurat v.4工作流程（归一化，可变特征识别，主成分分析，LOUVAIN CLUSTER，LOUVAIN CLUSTER，LOUVAIN CLUSTER和UMAP EMPEDDING，如上所述）。同样，将核与设置为0.5、1、2和3的分辨率聚集，以获得一组粗到细簇的光谱。使用Seurat的Findallmarkers函数（调整后的P <0.05），通过基于模型的单细胞转录组（MAST）58进行差异表达分析。在这些各种分辨率下，我们通过识别表达与多种细胞类型一致的基因的簇来删除了推定的双线（例如，簇共表达神经元标记，或第5层和非层5标记；估计的每个10x样品的估计多重速率。我们审查了所得群集及其标记，并分配了类型的身份。在皮质第5层的解剖中，我们根据规范标记基因的共享表达（例如Fezf2，Bcl11b，Crym）合并了几个簇，并鉴定出和去除并去除并去除了与顶级差异表达的基因，这些基因是线粒体和长的非编码RNA。然后，我们合并了来自边界区域（即HY和MB； MB和PONS; PONS; PONS和MED）的对象，并重新运行Seurat v.4工作流程，以识别和合并在Roi-Enriching dissections中存在的人。此时，RFA，M1M2S1，S2，HY，MB和CB中的簇已经通过标记基因进行了良好的分辨，但是脑海中和富含药物的几个簇的定义不明确。为了定义SPN分类法中的最终PON和MED类型（图1C），我们重新运行了Seurat v.4核的工作流程，从PON和MED共同运行 （扩展数据图15）。基于对各种分辨率的这些簇的差分表达分析，我们确定了跨PON和MED核的Lim Homeobox基因表达的模式。我们再次在这五个LIM定义组中的每一个（即LMX1B，LHX2/9，LHX3/4，LHX1/5和LHX1/5+LHX3/4（扩展数据图15d-F））上再次子集并重新运行Seurat v.4工作流程（即LMX1B，LHX2/9，LHX3/4，LHX3/4，LHX3/4））。 　　该迭代注释过程确定了所有SPN的76种类型。Seurat的Findallmarkers（桅杆测试）用于查找76种SPN类型的标记基因。我们仅测试了在核中至少25％（最小值= 0.25）中检测到的基因，并且在类型和所有其他核中的核之间显示至少显示了核之间至少0.25倍的log尺度差异（logfc.threshold = 0.25）。如果调整后的P值小于0.05，则将基因注释为“显着”（补充表2）。 　　然后在SSV4数据中确定了10倍数据集中确定的具有上述迭代注释过程的类型。使用SEURAT v.4工作流程处理SSV4数据，并进行了簇的差异表达。基于顶部差异表达的基因，将簇分配给76种SPN类型之一。随后，将所有10X和SSV4数据集成在一起。为此，使用Seurat的“ Merge”函数（Merge.Data = true）合并了来自Roi Eniching discections的所有10x Seurat对象，并且使用25个主组件使用SCTRANSFORM运行Seurat v.4工作流程。同时，类似地合并了来自Roi Eniching解剖的所有SSV4 Seurat对象，并使用30个主组件运行Seurat v.4与Sctransform的工作流程。然后使用Seurat的集成管道集成了10X和SSV4数据。使用Seurat的“ SelectIntegrationFeatures函数（Nfeatures = 3000）选择集成功能。然后运行基于SCT的集成（PrepSctintegration，Find Integrationanchors，IntegratedAta）。最后，Seurat v.4工作流程最终运行，如上（Runpca，Findneighbors，Findclusters，runumap），具有30个组件和0.5分辨率。 　　如Companion研究1所述，在scrattch.bigcat软件包中构建了10x和SSV4数据集中所有SPN的SPN型分类树。我们计算了“类型”级别的1,871个标记基因的平均表达，并使用此信息来构建树。为了全面了解细胞类型的景观和细胞类型之间的关系，我们考虑了分类树，UMAP和星座图。 　　所有SPN均基于细胞类型分类树（图1C），将所有SPN组织成具有三个级别（分区，子类和类型）的层次结构。根据分类树的第一层的拆分（并根据“调制”部门的神经递质身份进行微调）分配了划分，从而分为三个部门。基于随后的分类树水平的分裂确定了分区1和3的子类，导致第1师的三个子类和第3师的五个子类别。第2师中的两种类型是谷氨酸标能，并源自MB-Enriching dissections，因此分配给了“ MB Glut”子类。As clustering of the types within division 2 was based on the abovementioned LIM homeobox genes, subclasses for division 2 were similarly defined by LIM homeobox gene expression along with the major expressed neurotransmitter to yield five additional subclasses in division 2. Subclasses and types were named using a combination of representative region names, major neurotransmitters and, in some cases, marker genes.类型ID编号是根据类型的分类树顺序顺序分配的。 　　使用星座图来可视化SPN类型之间的全局相关性，其中每种转录组类型由节点（圆）表示，该节点（圆圈）的表面积反映了对数尺度中类型中的核数量。每个节点的位置对应于UMAP坐标中相应类型的质心位置。节点之间的关系显示为按如下计算的边缘。对于每个核，在减小的尺寸空间中确定了15个最近的邻居，并按类型进行了总结。对于每种类型，计算了分配给其他类型的最近邻居的分数。连接两个节点的边缘，其中至少一个节点在连接节点中具有超过5％的最近邻居的5％以上，而节点处的边缘宽度反映了分配给连接节点的最近邻居的分数，并将其缩放到节点大小。对于所有节点，确定“外部”邻居的最大分数并将其设置为边缘宽度=节点宽度的100％。这些图是使用scrattch.bigcat软件包中包含的plot_constellation函数创建的。 　　Seurat的“ AddModulesCore”功能用于计算多个基因模块的平均表达水平（即扩展数据中的副型Lim Homeobox基因图15）。 　　使用Seurat的Findallmarkers或Findmarkers函数对投影目标差异和SPP1+与SPP1-神经元的差异表达分析进行（调整后的P <0.05）。Enrichr59和go_biological_process_2021，go_cellular_component_2021和go_molecular_function_2021库用于识别丰富的生物学过程或分子功能。 　　为了评估从PON和MED-ENCHICHING脱发中的每个SPN簇中转录因子调节的活性，我们采用了Scenic60,61。首先，我们提取了合并后的seurat对象的原始计数矩阵，并将其用作输入来识别“ GRN”的共表达模块。接下来，我们使用“ ctx”进行了顺式调节基序分析，其nes_threshold为2.5，min_genes为10。然后，我们使用“ aucell”来计算每个单个细胞中的调节活性。为了可视化每个集群中的调节活性，我们通过群集对调节活性进行了平均并缩放。具体而言，我们使用“ pheatmap”在R中观察了LHX1，LHX2，LHX3，LHX4，LHX5，LHX5，LHX5，LHX9和LMX1B的调节活性。来自https://resources.aertslab.org/cistarget/。 　　为了产生SNRNA-SEQ数据集中的异质性度量（扩展数据图17b），我们为每个核计算了在降低的原理尺寸空间（维度= 100）中与K最近的邻居的平均距离（K = 15），并通过减去Z分数来通过减去均值并通过标准偏差为Z得分。与高度异源簇中的核相比，高度同质簇中的核与最近的邻居的距离短得多。该指标可用于测量每个核的局部异质性，而不论其细胞类型的身份如何。 　　To assess the correspondence between the SPN types identified in this study with those in the companion AIBS WB taxonomy1, we mapped 10x SPN nuclei data onto the mouse WB taxonomy using Hierarchical Approximate Nearest Neighbour mapping available in scrattch-mapping package and calculated the confusion matrix at cluster, supertype and subclass levels of WB taxonomy (cluster-level correspondence is shown in Extended Data Fig. 8).每种SPN细胞类型总结了对应关系，其成员的平均标记基因与映射的WB分类群的平均相关性（补充表3-5），这表明在本研究中，在MB和HB区域中鉴定了更多细粒类型。 　　为了将SPN类型映射到其解剖位置，我们利用了同伴AIBS WB分类法中可用的数据。我们使用scrattch.bigcat软件包的i_harmonize函数进行了使用WB 10X细胞，WB Merfish细胞和10X Nuclei SPN数据集的集成聚类。尽管集成的聚类显示出大多数细胞类型的细胞类型对应关系，但对于MB和HB的腹侧内侧区域中的细胞类型仍然模棱两可。与WB分类法相比，由于采样策略更有针对性的采样策略，其中一些类型的某些类型可能在SPN分类法中更好地代表。为了进一步阐明细胞类型的对应关系，我们确定了一个集成簇的子集，其中包含SPN分类法的至少五个核，映射了从这些群集的WB Merfish和WB 10X细胞绘制到SPN分类法到SPN分类法的，并将SPN分类法的10X核映射到这些由WB分类法覆盖的SPN分类学中的10X核，并被这些集成了被集成的cluseced clusters覆盖的clussers。从通信比较中，将SPN分类学中的簇中的簇中的簇中除去，反之亦然。我们比较了SPN分类法及其从WB分类法中映射的簇的核的身份，并在WB分类法的群集，超概述和子类水平上产生了混淆矩阵。SPN簇共享的综合簇中的Merfish细胞直接映射到SPN分类法。所有映射均通过将细胞/核分配给最近的群集质心进行相应的分类学群，该分类法使用所有成对簇之间的顶部差异表达的基因（除Merfish数据集除外），在这种情况下，使用了Merfish基因板上的所有基因。 　　在解码原始Merfish数据后，我们获得了一个包含每个检测到的mRNA分子（检测到的mRNA分子的位置）的文件（检测到每个部分）。将每个部分的数据旋转以使用RETRR RETRR软件包的旋转函数向上和腹侧向上和腹侧。使用GGPLOT2封装中的ggplot函数将mRNA分子的位置绘制为散点图，而Z-Planes崩溃了。感兴趣的基因以红色突出显示，而其余的分子则以灰色为颜色，以提供本节的解剖环境。文件被导出为.png，分辨率为1200 dpi（扩展数据图15H）。 　　为了验证表达某些标记基因的神经元的解剖位置，在各种重组酶驱动线中进行了逆行标记（补充表14）。AAV2/RETRO-CAG-FLEX-H2B-GFP（由波士顿儿童医院病毒核心产生，5×1012 GC ML-1）被注射在宫颈和腰椎脊髓中，如上所述，动物被注射后2周灌注，并在上面描述的是组织，如上所述，如上所述，如上所述，如上所述，如上所述，如上所述，如上所述，如上所述，将GFPPP PPPPPPPPP表达表达。根据聚类结果选择鼠标线。对于需要他莫昔芬诱导的线，他莫昔芬是通过口服烤（每25克每25克体重100 µL）连续7天的，从脊柱注射后7天开始。他莫昔芬给药后7天，将小鼠安乐死。他莫昔芬（VWR IC15673883）是通过溶解在玉米油中（20 mg mL -1）的，然后进行过夜旋转制备。对组织切片进行冷冻（50 µm，冠状）和四分之一的串行切片进行IHC处理（Aves Chicken-anti-GFP主1：500稀释，驴anti-Chicken 488二次二次稀释），并在VS120 Slide Slide-Scanner上成像，如上所述。使用NeuroInfo对标记的核进行了分割并重建。将包含单个部分的图像对准并用NeuroInfo注册到Allen CFF。然后检测到H2b阳性核并映射到参考地图集。将CRE特异性检测合并到同一文件中，以进行比较和可视化目的。3D重建的水平，冠状或矢状投影是通过NeuroInfo的3D可视化窗口输出的。 　　为了验证宫颈和腰椎注射SPN之间的选择差异表达的基因，通过数字杂交链反应（分子仪器）（分子仪器）（分子仪器）进行单分子荧光ISH，并对排序的核进行了定量。如上所述（BD Facsaria，100 µm喷嘴），将GFP+和/或MSCARLET+ NUCLEI分组为粉丝，并进入包含100 µL排序缓冲液的PCR管中。将排序的核悬浮液转移到聚赖氨酸涂层玻璃盖玻片上，在4°C下孵育30分钟，用4％PFA固定15分钟，并在室温下用PBS冲洗3次。然后，通过在幻灯片上适应制造商的哺乳动物细胞方案来进行数字杂交链反应。在-20°C下将盖玻片在70％乙醇中孵育。此后，吸出乙醇，样品在室温下用2×SSC洗涤3次，然后在37°C下用探针杂交缓冲液预杂交30分钟。然后除去探针杂交缓冲液，并将新鲜制备的探针溶液（探针杂交缓冲液中的16 nm探针）添加到样品中，以在37°C下过夜孵育。12–16 h后，除去探针溶液，并在37°C下用探针洗涤缓冲液洗涤四次，然后在室温下用5×SSCT（SSC+Tween-20）洗涤两次。然后在室温下在放大缓冲液中预先放大样品30分钟。发夹通过加热至95°C的新鲜制备90秒，将冷却至室温持续30分钟， 然后以0.06 µm的浓度添加到扩增缓冲液中。将发夹溶液添加到样品中60分钟，以确保单分子点受到衍射。除去发夹溶液，并在室温下用5×SSCT洗涤样品五次。用DAPI以1 µg ml -1的最终浓度对核染色5分钟，并用PBS洗涤3次。将细胞核用延长玻璃安装，并用透明的指甲油密封。允许延长玻璃在室温下固化48-60小时，然后在4°C下储存直至成像。每个探针使用40个探针集，探针名和相关的登录号如下：PCDH11X（NM_001271809.1），FEZF2（NM_080433.3）。使用×63的油浸入物镜，具有×2变焦，共聚焦分辨率和最佳的Z-stacks在Zeiss LSM 900共焦点上成像。为了进行定量，将Z堆栈转换为最大强度正交投影，并根据每个核手动量化点状的数量。通过Wilcoxon检验（GGPUBR）评估统计显着性。 　　为了逆行标记用于细胞连接的切片记录的SPN，将AAV2/Retro-CAG-GFP（由波士顿儿童医院病毒核心产生）被注入腰部（L2-4）的p42小鼠的腰脊髓中。为了逆行标签全细胞切片记录的SPN，在第4天后第4天注入了AAV2/Retro-Cag-TDTOMATO（由波士顿儿童医院病毒核心生产）。在产后第4天的第4天幼崽被冰进行了麻醉，并将其放置在超声探针下（MS550，超声波VEVO VEVO VEVO 3100）。玻璃移液器被引导到L3-4增大，并在L3和L4段以双侧注射0.8 µL AAV2/RETRO-CAG-TDTOMATO。然后将幼崽放在加热垫上以恢复。 　　在出生后第60-70天准备急性冠状切片，以进行细胞附着的记录或第20-30天的全细胞记录。在用冰冷的切片溶液中，异氟烷麻醉和心脏灌注后，大脑迅速提取。在冰冷的切片溶液中，用Leica VT 1200振动组切割冠状脑切片（200 µm），然后在36°C下在ACSF溶液中孵育40分钟。然后将切片保持在室温下，直到转移到记录室。切片解决方案由（以毫米为单位）：蔗糖75，NACL 80，KCl 2.5，NAH2PO4 1.25，NAHCO3 26，CACL2 0.5，MGCL2 3.5，Na-ascorbate 1.3，Na-pyruvate 1.3，Na-Pyruvate 3。acsf 3。acsf ACSF。26，CaCl2 2，MGCL2 1，Na-抗坏血酸1.3，Na-pruvate 3。 　　在使用GFP或TDTOMATO荧光定位逆行标记的RUSN之后，在电压钳模式下以20-60MΩ的耐液移移移移移移移移移移感内，以0 mV固定电势以20-60MΩ的耐药性。全细胞记录以3-5MΩ电阻为电流夹模式进行。移液器溶液由（以毫米为单位）：K-葡萄糖酸130，KCl 5，HEPES 10，EGTA 0.5，MGATP 4，NAGTP 0.5，Bioocytin（〜0.2％，Tocris 3349）和Alexa 488或Alexa 594 floorescent ClooreCentCention（Alexa 594）280-300;用KOH调整为7.3-7.4）。在细胞连接记录的结束时，将膜破裂，以填充记录的细胞中的生物细胞和染料。在20 kHz中采样的信号通过Digidata 1440 A传递，并通过多灯700B放大器放大，并使用PCLAMP软件（v.11，Molecular Devices）记录。所有细胞连接和全细胞记录均在ACSF中在室温（分别为18-22°C和30–32°C）下完成。 　　对于细胞跟踪记录中的尖峰形状分析，从记录开始，在10分钟内检测到10 s的单个尖峰（峰值±5 ms）。将每个负峰标准化为0基线水平和-1幅度在峰值处。基线是根据痕量开始时的3.75 ms周期确定的。平均每个单元平均归一化尖峰，并用于确定半峰宽度。将尖峰宽度计算为线性插值后平均波形的相交与振幅-0.5处的水平线之间的时间差。 　　在整个细胞记录中，在全细胞配置后的10 s期间的点火速率中测量了0分钟时自发发射速率。目前，多灯处于“ i = 0”模式。5分钟后5分钟，在“ I = C”模式下10 s时，在5分钟时自发发射速率。为了测量与动作电位相关的参数，将膜电位保持在-65至-60 mV之间，并且在全细胞配置后至少10分钟电流注入。动作电位引起的电流由10或50 PA步骤确定。在此值下以此值重复3次。第一个动作电位波形用于动作电位相关的可变计算。动作电位阈值（MV）是低于DV/DT阈值（12 V s -1或0.6 mV 50 µs -1）的第一个点。动作电位峰是高于阈值的最大膜电位。动作电位振幅是动作电位阈值和动作电位峰之间的差异。动作电位的半宽度（µs）是动作势幅度膜电位的一半时差，样品之间的线性插值。FAHP是在过去4 ms的动作电位峰内动作电位阈值和负峰之间的膜电位差。从线性回归拟合拟合的斜率（clampfit 10）估计输入电阻，膜电位变化在当前步骤从0到-50 pA的台阶上，使用-10 pa步骤或从0到-250 pa，使用-50 pa步骤从0到-250 pa。对于频率 - 电流关系，在当前步骤（50 pa，1 s）中计数动作势数，从0 pa增加到1,000 pa。 　　含有Alexa 488或Alexa 594和生物细胞填充的补丁细胞的急性切片在4％PFA中固定在4°C的4％PFA中。用PBS洗涤切片，然后在室温下用阻断溶液（5％正常驴血清，0.5％Triton-X）处理2小时。将浮动切片在原始抗体（Aves Chicken-Anti-GFP或Rockland Rabbit-Anti-RFP，R＆D Systems Goat-Anti-Osteopontin，Millipore小鼠Anti-Neun Clone A60;全部1：500稀释溶液中）孵育。After 12–16 h, slices were washed three times for 15 min with PBS at room temperature, and subsequently incubated with streptavidin (conjugated with Alexa Fluor 488 or 594; 1:500 dilution in PBS) and secondary antibodies (Alexa Fluor 488 donkey-anti-chicken or Alexa Fluor 594 donkey-anti-rabbit, Alexa Fluor 647驴anti-goat，Alexa Fluor 405驴 - 安蒂小鼠；最后，将切片用PBS洗涤3次，在室温下用延长的玻璃安装培养基安装，并用透明的指甲油密封。允许延长玻璃在室温下固化48-60小时，然后在4°C下储存直至成像。用×20物镜和最佳的Z-stack（LAS X Stellaris软件）在Leica TCS SP8激光扫描共焦点上成像修补细胞。SOMA区域是使用斐济的“徒手选择”工具手动测量的。SPP1状态是通过评估SPP1和链霉亲和素共定位来确定的。在确定为SPP1-的细胞中，确认了NEUN信号，以确保在电生理记录过程中刺穿细胞膜，但仍将抗原保留在细胞质中。 　　如补充表13所示，使用Mann-Whitney检验或混合效应模型进行统计分析。 　　为了逆行标记RUSNS，如上所述，将AAV2/RETRO-SYN-H2B-GFP注入p42小鼠的宫颈（C4-6）和腰椎（L2-4）脊髓中。如上所述，使用Aves Chicken-Anti-GFP和R＆D系统山羊 - 抗抗蛋白质蛋白蛋白抗体（1：500稀释溶液中的1：500稀释），以及Donkey-Anti-Chicken 488和Donkey-Anti-Goat 647二级抗体（1：1：1：1：1：1：1：1：1000稀释），制备了组织切片和免疫细胞化学化学。在Zeiss LSM 900共聚焦激光扫描显微镜上以×20物镜为目标，将图像作为Z堆放。n = 3逆行标记的大脑被染色以产生图6c，d的代表性结果。 　　为了测量整个小鼠大脑中SPN的SOMA大小和SPP1状态，如上所述，将AAV2/Retro-CAG-GFP注入P42小鼠的宫颈（C4-6）和Lumbar（L2-4）脊髓中。在p56处，灌注小鼠，组织切片和IHC如上所述，用Aves Chicken-Anti-GFP和R＆D Systems goat-anti-Opteopontin原代抗体（1：500稀释溶液中的1：500稀释），以及驴-Anti-Chicken 488和Donkey-Anti-Anti-anti-Goat 647二级抗体抗体（1：1,000 tim）（1：1,000，，000，000：1,000，，000年）。一个冠状系列中所有ROI的图像作为Z-stacks获得，在Zeiss LSM 900共聚焦激光扫描显微镜上具有×20物镜。使用CellPose62对手动注释的图像进行微调的神经网络模型进行了GFP+细胞的自动分割。使用Python实施了定制的量化，测量和分类管道。细胞大小的测量是从分割面罩获得的。通过像素重叠强度阈值的识别，双阳性GFP+/SPP1+细胞的识别是完成的，将SPP1+细胞计数为在两个通道中具有较高共恒流强度的掩模中至少有65％的像素的细胞，这是两个通道中的高cixer剂，这是细胞质义但不是SPP1的细胞质且非核染色模式的特征。手动纠正​​了错误的共定位阳性。通过Wilcoxon检验（GGPUBR）评估统计显着性。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。