CGA-sting驱动与炎症相关的炎症和神经退行性的驱动

　　野生型C57BL/6J小鼠和STING1 - / - （Sting缺陷）（025805）小鼠（19-20个月大）是从杰克逊实验室购买的。小鼠是单室，以防止侵略性相关的伤害并喂养标准的食物饮食。如图1所述，在200 µL PBS 5％Tween-80中用媒介物或750 nmol H-151处理老年小鼠。简短地，年龄的小鼠在腹膜内注射750 nmol H-151，每周5天5天，持续8周。治疗休息8周后，将小鼠再处理8周，然后使用物理或认知功能测试进行分析。将小鼠安乐死并收集组织以进行进一步分析。药代动力学和组织分布实验由Pharmaron进行。sting1 - / - 小鼠和野生型垃圾在研究所内繁殖并老化。 　　CGASR241E小鼠是使用CRISPR – CAS9介导的基因编辑生成的，使用C57BL/6J合子中的长单链寡醇。长的单链寡核能在反向方向和R241E点突变中包含外显子2。该外显子的两侧是相反方向和同源臂的LOX71和LOX66重组位点。将长的单链与CAS9蛋白（集成DNA技术）和两个设计的GRNA（5'-TTTTATAGGCACCCTATGTACAGG-3''一起注入小鼠。B6; 129GT（ROSA）26SORTM1（CRE/ERT）NAT/J（杰克逊实验室，004847）和C57BL/6-TMEM119EM1（CRE/ERT2）gfng/j（Jackson Laboratory，031820），以生成ROSA26-CRET2-CERET2-CGAS2-CGAS/R24111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111U e2411EEM MECTETMEM119-CREERT2-CGASWT/R241E（MG-CGASR241E）小鼠。 　　为了诱导CGASR241E在MG-CGASR241E）小鼠中的小胶质细胞表达，腹膜内腹膜内的他莫昔芬（每公斤体重75 mg）每24小时连续5天注射到8-10周龄的小鼠中。一些小鼠每天还接受750 nmol H-151，从他莫昔芬（4-OHT，Sigma-Aldrich，T5648）注射。在最后一次莫昔芬给药后的1周内，使用认知测试分析了一些小鼠并进行安乐死进行组织分析。 　　为了测试H-151的体内特异性，小鼠（8-10周）每公斤15毫克的刺激性激动剂（DMXAA； Invivogen）腹膜内。在注射刺痛激动剂前30分钟对H-151（750 nmol）进行给予一组，3小时后，将小鼠安乐死以进行组织。 　　将笼子保持在40–60％的湿度下的18–24°C环境温度。从06:00到18:00，将小鼠保持在12 h – 12 h的光线周期。随意提供食物和水。通过注射过量的戊巴比妥钠（每公斤150毫克），通过解剖学化对小鼠进行了安乐死。动物实验已获得VAUD的服务的服务，并由IFM Therapeutics获得，并根据各自的法律法规进行。 　　进行了该测试以评估海马依赖性的空间长期记忆和学习。莫里斯水迷宫由一个圆形水箱组成，里面装有含有无毒彩色油漆的水，与小鼠毛皮形成鲜明对比，并保持在室温下（23±1°C）。为了逃避水，老鼠必须找到一个平台。这个逃生平台被淹没了，对于动物而言不可见。在所有实验中，将坦克放在带有恒定的迷宫外视觉提示和环境光的房间中。在最多5天的时间内对小鼠进行了训练，以使用视觉提示作为空间参考点找到逃生平台。每天，每只鼠标最多进行6次试验。每个试验的最大持续时间为120 s。在每次试验结束时，将鼠标放回暖气灯下的家用笼子，以恢复和休息时间。 　　在实验的每一天，动物被移至实验室，在他们的家笼中不受干扰30分钟。第一天，将小鼠放入调节室中，并提出音调，然后进行脚部冲击。在训练期间，音调 - 脚击配对最多重复了四次。在第二天，小鼠被重新暴露在没有音调的情况下，并监测了冷冻响应。小鼠仅在实验的第一天就受到了脚部冲击，脚冲击最大2 s，最大强度为0.5 mA。 　　使用市售的自动握力表进行了对老年小鼠的肢体强度的评估。该测试是基于小鼠悬挂尾巴并轻轻向后拉动的鼠标自然趋势。将小鼠从网格上丢失的抓地力后的峰电阻力被从设备上拉开时。 　　对于运动测试，将小鼠放在跑步机上。有机玻璃墙限制了跑步机，在跑步车道旁边，当老鼠触摸它以迫使它们奔跑时，电网会消除小冲击。在测试前，将小鼠习惯于跑步机5分钟。小鼠开始以非常中等的速度（15厘米S -1）跑步。每12分钟，速度在3厘米S -1时逐渐增加。该设备会自动监视运行距离和接收到的冲击数量或空气刺激的时间。当鼠标连续两分钟内收到五次以上的冲击时，被认为鼠标疲惫不堪，将鼠标放回其家笼中，并完全获得食物和水。冲击（0.1 mA）的强度非常低，足以引起令人不快的感觉（例如刺痛），以保持它们的运行，而远离造成其完整性的损害。 　　我们进行了整体免疫染色，然后进行了共聚焦显微镜检查，以检查脂肪组织中F4/80+巨噬细胞的浸润。在收集腹股沟白脂肪组织之前，将小鼠灌注PBS。将组织库细分为0.5-0.75 cm3尺寸的碎片，在室温下固定在1％多聚甲醛（PFA）中30分钟，并在柔和的摇动中固定，在柔和的摇动下在PBS中洗涤3次10分钟。将组织在PBS中的5％BSA中阻塞30分钟，然后与原代抗F4/80抗体（Thermo Fisher Scientific，A3-1，MA1-91124）孵育1：100在4°C的阻塞中稀释1：100。将样品用PBS洗涤，然后与继发性抗RAT-Alexa 488抗体（Thermo Fisher Scientific，A-21208）在室温下在室温下稀释1小时，并轻轻摇动，在阻塞缓冲液中稀释1：350。用PBS洗涤3次后，将样品在脂质和核染色的鸡尾酒中孵育20分钟，由1 µg Ml-1 DAPI（Sigma-Aldrich，d9542）和0.25 µg ml-1 Bodipy（Thero Fisher Scientific，d3922）和PBS PR PR PR PBS（PBS）。这些图像是在倒置的扫描共聚焦显微镜上拍摄的（Zeiss LSM 700倒置），并通过拍摄Z-stack图像来完成3D重建的组装。 　　对于小鼠组织实验，将福尔马林固定的石蜡包裹的小鼠组织块切成3μM切片进行免疫组织化学染色，并切成6μm的切片，进行免疫荧光染色，并将其置于幻灯片上。首先将切片脱蜡并再合化，然后进行热诱导的表位检索，并用PBS 1％（v/v）Triton X-100将切片透化。The samples were stained with primary antibodies (IBA1, Abcam, ab178846, rabbit, 1:10,000; IBA1, Abcam, ab5076, goat, 1:300; Mac3, Becton Dickinson, 553322, 1:150; GFAP, Agilent, Z033429-2(AGI), 1:100; NeuN, Merck, MAB377,1：100; Synaptophins，36406，1：500;For immunofluorescence analysis, the sections were then stained with fluorescently labelled secondary antibodies (anti-rabbit-AF488 (A-21206, 1:300), anti-rabbit-AF568 (A-10042, 1:250), anti-goat-AF488 (A-11055, 1:200), all from Thermo Fisher Scientific) for 90 min at room temperature.为了进行免疫组织化学分析，将切片用HRP偶联的二级抗体染色（抗Rabbit-HRP，711035152，1：300; and Anti-Mouse-HRP，715035150，1：300;均来自Jackson Immunoresearch均来自Jackson Immunoresearch）。使用Zeiss Axioscan 7幻灯片扫描仪或Olympus VS120全滑动扫描仪获得免疫组织化学染色的图像，并使用Olympus Olyvia软件收集。数据是实质IBA1+小胶质细胞，MAC3+细胞和Neun+细胞的手动计数。将细胞计数标准化为海马区域。使用宽场荧光显微镜（Zeiss Axioplan）分析免疫荧光染色的图像，并使用ImageJ进行处理。 　　使用白光激光器使用Leica SP8共聚焦显微镜对年轻小鼠和老年小鼠分离的小胶质细胞进行成像。将切片或小胶质细胞用63倍的油浸泡物镜（NA = 1.45，leica）成像，跨样品的标准设置以相同的方式标记。随后使用Huygens Deonvolution软件（科学体积成像）对Z-stacks进行了反浏览，并使用Imaris（Bitplane）呈现3D视图。以下参数用于Imaris中表面的生成，以可视化PSTING和IBA1。扩展数据中的老鼠的海马切片图6B，PSTING：手动阈值：90，平滑：0.141μm。扩展数据中的老鼠的海马切片图6B，IBA1：手动阈值：25.7，平滑：0.5μm。扩展数据中的年轻小鼠大脑和老年小鼠大脑的分离小胶质细胞图6C，PSTING：手动阈值：110，平滑：0.120μm。 　　为了定量分析PSTING+和IBA1+细胞的比例，使用S.D.最大强度投影。使用ImageJ渲染投影类型。列出了PSTING+细胞和IBA1+细胞的截止强度阈值32，并列举了视野中的细胞总数。 　　对于小胶质细胞的Imaris图像，如前所述进行了小胶质细胞的形态图分析58。简而言之，将动物灌注冰冷的PBS。大脑固定在4％的PFA中过夜。然后将组织在30％的蔗糖中脱水，并嵌入组织Tek（Sakura）中。在PBS中的5％BSA中，将低温恒温器切片（厚度为50 µm）封闭，并补充了0.5％（v/v）Triton X-100。然后将部分与抗IBA1初级抗体（ABCAM，AB178846，1：1,000）一起孵育三晚。驴抗兔Alexa粉568抗体（Thermo Fisher Scientific，A10042，1：500）用作二级抗体，并使用一晚。使用DAPI可视化细胞核。使用SP8共聚焦显微镜（Leica）和63倍物镜（步长，0.4 µm）进行成像。将细胞在3D中可视化，并使用Imaris（V.9.6，Bitplane）重建。 　　对于神经元培养染色，将细胞培养物覆盖在4％PFA中固定10分钟，用PBS洗涤两次，然后在2％皂苷中透化，在室温下在PBS中固定0.1％（v/v）Triton X-100，在室温下以PBS盖住1％BSA，在室温下用1％的BSA盖住1％。将盖玻片与针对MAP2（Sigma-Aldrich，M4403，1：250）和IBA1（ABCAM AB178846，1：250）的一抗（Sigma-Aldrich，M4403，1：250）一起在4°C下孵育过夜。将样品用PBS洗涤，并用二抗（抗兔-AF568（A-10042），抗小鼠-AF488（A-111001）孵育90分钟，在室温下孵育90分钟。通过与5 µg ML -1 DAPI孵育10分钟，将细胞核染色，并用荧光安装培养基（Agilent，S302380）安装盖玻片。使用宽场荧光显微镜（Zeiss Axioplan）获取图像。在同一实验中，将相同的设置应用于所有图像。所有分析均使用ImageJ进行。补充表2中提供了所有使用的抗体的列表。 　　本研究中使用的所有材料均从洛桑（Lausanne）的肥胖患者队列获得，并获得了Vaud Canton委员会（CER-VD Project PB_2018-00119）的道德认可的许可。根据签署的知情同意书收集编码样本，符合2000年赫尔辛基宣言的准则。肥胖参与者的胃搭桥手术期间切除了人脂肪组织。其中三名参与者是男性，其中八位参与者是女性。参与者的平均年龄为48.7岁；S.D.，9.7;范围30-60。众所周知，没有参与者患有恶性肿瘤。从每个参与者那里获得了更大的脂肪组织。将脂肪组织切成小块，用PBS洗涤3次，并在含有1 mM丙酮酸钠（生物对照），2 mM谷氨酰胺（生命技术），MEM维生素（生命技术），MEM非义务氨基酸（Thermo Fisher Scientific）和抗生素的培养基中培养。用H-151（每日，1-2 µm），DMSO或20 µm槲皮素和1 µM Dasatinib（Chemie Brunschwig）处理外植体。孵育6天后，在SA-β-半乳糖苷酶染色（有或没有组织清除率）之前固定了一部分脂肪组织，并且剩余的（如果足够的话）是用于RNA分离的。收集条件培养基（每位患者的三到五个重复中）进行IL-6，IL-8和MCP-1的ELISA分析。 　　将患者的脂肪组织浸入4％的福尔马林（Sigma-Aldrich）中，在4°C的旋转振荡器上浸入2天，然后在4°C的PBS的旋转振荡器上洗涤4天。将组织在室温下在轨道振动筛上的PBS中洗涤3次30分钟，然后用振动片切成500 µm切片。将样品在2％PBS-T中透化（在含有0.05％叠氮化钠的PBS溶液中2％Triton X-100）在室温下在轨道振动器上进行2天，然后在Rapiclear中清除（Rapiclear 1.52，Sunjin Lab，RC152001，RC152001）在室温下过夜。将清除的组织安装在新鲜的Rapiclear试剂中，并使用共聚焦显微镜（Zeiss LSM 700倒置）成像。 　　将细胞和组织外植体用PBS洗涤两次，然后用2％的甲醛（Sigma-Aldrich）和0.2％的甲醛（Sigma-Aldrich）在室温下用PBS洗涤，然后在PBS洗涤，然后在PBS洗涤，然后在37°C下在37°C下孵育40米酸盐，然后在室温下洗涤，然后在37°C下孵育5毫米，5 mm磷酸盐，C。K3FE（CN）6（Fluka Analytical，34272），150 mM NaCl，2 mM MGCl2和1 mg Ml-1 X-Gal（Roche，R0404）在水中。在通过显微镜成像之前，将样品用PBS洗涤两次（Zeiss Axio Vert.A1）。 　　人和小鼠组织在液氮中被捕集，并在-80°C下储存直至加工。使用Trizol-氯仿（Thermo Fisher Scientific，15596018）方法和组织均质器（Thermo Fisher Scientific）分离RNA。对于细胞，根据制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen，74004）（细胞系）或Rneasy微型试剂盒（Qiagen，74104）（原代小胶质细胞）分离RNA。 　　从对照中分离RNA，并使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，74004）从第10天到第20天从第10天到第20天进行辐照的WI-38细胞分离，每天或不处理RNA。RNA进一步处理了EPFL基因表达核心设施GECF的测序。使用truseq mRNA滞留的LT（Illumina套件）制备mRNA-Seq库。使用具有1×75循环（单读），高输出模式（预期至少4亿读）的NextSeq 500系统测序对样品进行测序，化学V2。使用来自EPFL的生物信息学和生物统计学核心设施的HTSSTATION在线软件处理测序数据。使用Cluster 3.0从归一化表达数据中产生热图，以进行计算和JTREEVIEW以进行可视化。 　　从小鼠大脑中分离出的RNA如下：在挂接4200（安捷伦）上控制RNA质量，确认所有质量都很好（得分> 8.1）。根据制造商的说明，使用滞留的mRNA连接方法（Illumina）从800 ng RNA开始制备用于mRNA-Seq的库。随后将所有带有独特双重指标的库库加载到Novaseq 6000流动池（Illumina）上，并根据制造商的说明进行了测序，每样品均至少屈服至少4000万对60核苷酸长的读数。使用BCL转换（v.3.9.3; Illumina）修剪了适配器的读数，并使用FastQC（V.0.11.9）进行了质量控制。 　　对于成纤维细胞，将RNA映射到使用Star Aligner（v.2.7）（v.2.7）的人类基因组组装HG38（Gencode V36，Ensembl 102），并用HTSEQ计数生成计数。总共保留了13,006个蛋白质编码基因（至少2个样品中的CPM> 1）进行分析。使用VOOM-LIMMA（V.3.28）在R（V.4.0）中进行差异基因表达分析。 　　对于散装海马，使用Star Anigner（V.2.7.10b）将RNA映射到小鼠基因组组件GRCM39（发行109），并使用farteurecounts（v.2.0.1）生成计数。使用R（V.4.2.2）软件包DESEQ2（V.1.38.2）进行DEG分析。 　　通过使用douncer在核EZ裂解缓冲液（Millipore Sigma）中匀浆小鼠脑组织中提取小鼠脑中的核。将核用DAPI（10 µg mL-1，Sigma-Aldrich）标记，并分类用于测序。为了富集小胶质细胞，除了DAPI染色外，还将核染色为抗RBFOX3/NEUN-647（Novus Biologicals）和抗Olig2-488（Merck），以及DAPI+Neun-Olig2-细胞进行分类。在补充图2中描述了用于小胶质细胞核排序的门控策略。将小鼠脑细胞细胞核洗涤，并恢复在1％BSA中，并补充了0.2 u µg -1 µg -1 rnase抑制剂，检查了与Chrom单细胞的无明显的双胞胎和载荷相对（10x contress）的检查（10x）。转录主混合试剂和油以产生含单细胞的液滴。然后根据制造商的说明（协议CG000315 REV C），使用铬单细胞3'库和凝胶珠v3.1（PN-1000268）制备单细胞基因表达文库。根据制造商的说明，使用Tapestation 4200（Agilent）和量子dsDNA高灵敏度测定法（Thermo Fisher Scientific）进行质量控制。将测序文库加载到Illumina Novaseq流动池上，并使用28个核苷酸的读取长度进行read1和90个核苷酸的读取长度，用于Read2，每个细胞的深度约为80,000个。Illumina BCL转换用于解除读取读数，此后使用10倍基因组细胞游舱单细胞软件套件（V.7.0.0）进行条形码处理和3'基因计数，并使用小鼠基因组组装MM10的10倍基因组学自定义注释。 　　对于小胶质细胞和海马数据集，每个细胞的中位测序深度分别为107,267和100,912次读取，91.5％和94.6％的读数自信地映射到基因组和9,748和21,585核，分别捕获了核。使用R软件包SEURAT59（V.4.1.1.9003）进行样品处理和分析。对于每个数据集，我们根据每个细胞的基因，UMI计数和线粒体基因表达（如使用Seurat百分比Feature函数确定）的小提琴图分布过滤了低质量和潜在的双重细胞。作为测序运行和细胞类型，以每个体验设置过滤器会显着影响过滤截止。对于单核小胶质细胞和整个河马数据集，仅包括至少三个细胞中检测到的基因，并且包括至少200个基因的细胞。对于单一小胶质细胞，排除了线粒体基因表达≥5％的细胞，排除了≥4,500个基因和≥10,000umis的细胞，在单个海马中，排除了≥5％的线粒体基因表达的细胞，≥8,000基因和≥45,000umis的细胞被排除在外。过滤后，我们保留了5,360（1,001、514、924、1,468和1,453，每样本，1：2 CGASWT/R241E，3：5 CGASWT/WT）和21,500（2,076，2,655 2,383，2,383，2,383，3,550，3,550，3,550，3,5550，3,5550，3,5550，3,5550,3,5,555每个样品，1：4 CGASWT/R241E，分别为5：8 cgaswt/wt）每个数据集的核。合并后，评估样品的潜在批处理效应。正如我们观察到基于平均表达差异的单个基于单个样品的细胞类型簇的偏移，我们对细胞簇的sctransform（V2）归一化（负二项式模型）进行了Seurat Integration60进行预处理工作流程，用于小胶质细胞和海马数据集。基于3,000个锚基因进行集成， 并根据前30个主要组件进行了维度的降低。小胶质细胞和海马群分别以1和0.8的分辨率进行无监督的聚类。 　　簇身份是基于已知的细胞类型标记基因确定的，并与人蛋白质图集单细胞参考数据（https://www.proteinatlas.org/）交叉引用（补充表6）。细胞同一性基因表达得分根据给定基因列表的总体表达分配给单个细胞，使用AddModulesCore函数（基于Seurat62的函数）（扩展数据图9a，f），并使用ryplot_sccustom函数从R package sccustomize中进行可视化（V.0.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7..7少突胶质细胞）（补充表5）。在小胶质数据集中，根据小胶质细胞评分过滤污染的非膜细胞，然后将其余的细胞进一步取代并重新聚集，如上所述（扩展数据图9A）。特别注意去除MRC1+巨噬细胞，该巨噬细胞通常显示出与小胶质细胞相似的表达曲线，并且可能是不必要的变异来源。对于子集数据集的分辨率为0.8，无监督的聚类进行。转租后，在小胶质细胞和海马数据集中，每个核分别在每个核中发现了平均1,571和3,026个基因，2,762和9,112 UMIS和0.069％和0.069％和0.028％的线粒体基因含量。对于小胶质细胞的身份亚型，我们使用了与上述相同的方法，使用Seurat AddModulesCore函数用于与IFN，DAM，DAM，神经退行性和H-MG相关的基因列表（补充表6- gene gen-gene集，摘自参考文献。38,39，图38,39，图4E和扩展数据。图9B）。在两个数据集的群集细胞类型识别之后，使用Seurat的Findmarkers功能（V.1.22.0）63进行了差异基因表达分析，该功能实现了带有Bonferroni校正的两部分模型。使用标准化（log Normalize）对数据进行标准化 在差异基因分析之前，在seurat中的功能。用用作参考的H-MG计算了大坝，IFN和神经退行性相关的小胶质细胞的小胶质细胞簇身份DEG。 　　为了与年龄13和疾病相关的小胶质细胞40进行比较，从基因表达综合（GEO：GSM4505405和GSE127892）中获取了RAW数据集和元数据。使用R和Seurat软件包处理数据。对于老年数据集，仅针对24个月大的小胶质细胞提取原始计数，并与相关的元数据合并，包括先前已鉴定出的Louvain簇。在与疾病相关的小胶质数据集的情况下，没有容易获得群集注释。因此，使用已发表文章的材料和方法从原始计数中重新创建了分析。我们确定了上一篇文章中的所有相关群集，以及一个额外的武器，这些群体显示了MHC I类基因的高表达（H2-AA，H2-AB1，H2-EB1），代表了激活的小胶质细胞状态，我们将其标记为F_MHC-MARM。我们使用Seurat的标准集成工作流程将这些数据集与我们的最终注释的小胶质细胞数据集进行了单独集成，分别具有2,000个可变功能，11个用于聚类的PCA尺寸以及分别为老年和疾病数据集的群集分辨率为0.5和0.3。集成后，我们按照上述使用了AddModulesCore函数来分配IFN，DAM和神经退行性分数，并比较了数据集之间先前注释的单元格类型的聚类。 　　对于小鼠器官组织，细胞和人类患者组织，使用REVERTAID首次链cDNA合成试剂（Thermo Fisher Scientific）对RNA进行了反转录，并使用Maxima Sybr Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific）在Quantstudio 6/7 Qpcr乐器上使用Maxima Sybr Green Master Mix（Thermo Fisher Sciention）进行重复或一式三份进行RT-QPCR。补充表1中提供了使用的引物序列的列表。 　　Cell pellets were lysed in a lysis buffer containing 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 1% (v/v) Triton X-100, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 140 mM NaCl, protease and phosphatase inhibitors (protease inhibitor cocktail I, animal-free, CALBIOCHEM).使用BCA Pierce蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测量蛋白质浓度，并将其标准化为最低浓度。将初级抗体在4°C的PBS-T中在PBS-T中孵育2.5％或BSA。在室温下将二次抗小鼠或抗兔HRP偶联的抗体孵育1小时。用增强的化学发光底物ECL（Pierce，Thermo Fisher Scientific）可视化蛋白质，并使用Chemidoc XRS Biorad成像仪和图像实验室软件进行成像。成像是在两个通道中进行的：化学发光和比色法。补充图1中提供了未编写的图像。补充表2中提供了所有使用的抗体的列表。 　　脾细胞：为了分离小鼠脾细胞，使用注射器的柱塞末端将脾脏通过70 µM细胞过滤器捣碎，将细胞重悬于培养基中，并在800g下离心3分钟。在室温下将红细胞细胞裂解在2 ml ACK裂解缓冲液（Life Technologies，A1049201）中5分钟，被20 ml完全培养基灭活，在800G下离心3分钟，并再次用PBS洗涤。将沉淀保持在-80°C，直到进一步分析。 　　尾尖成纤维细胞：切割小鼠尾巴的2厘米部分，在乙醇70％中孵育5分钟，并干燥。将组织用剪刀切碎，并与含有2.5 mg ML-1胶原酶D（Sigma-Aldrich，11088866001）的消化缓冲液和1.25 mg ml-1 pronase（Millipore，53702）在37°C下的完整培养基中，在200°C下在200°C下，在200分钟内，在90分钟内，在200°C中，在200分钟内孵化。通过通过70 µm细胞滤网过滤来分离单个细胞，在58​​0g下离心7分钟，重悬于10 mL培养基中，并将其镀入10 cm的盘子。 　　小胶质细胞：将成年小鼠的整个大脑移除并切成小块。根据制造商的说明，使用成人脑解离试剂盒（Miltenyi Biotec，130-092-628）进一步分离了脑部。通过100 µM细胞过滤器过滤解离的细胞。使用碎屑清除试剂盒（Miltenyi Biotec，130-109-398）通过梯度离心去除碎屑。将细胞用抗CD11b珠（Miltenyi Biotec，130-093-634）标记，并通过磁排序阳性选择。 　　在Dulbecco修饰的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies）中，在37°C下在5％CO2和5％O2下培养人成纤维细胞（BJ，WI-38），其中含有10％（v/v）FCS，1％（V/V）Penicillin（V/V）Penicillin（100 IU ML-1） - 100 iu ml-l-1） - 斯特霉素（100 IU mL-Streptoptospycin（100°1）。小鼠尾尖成纤维细胞在37°C下培养5％CO2和20％O2。使用L929细胞条件培养基作为粒细胞/巨噬细胞刺激因子的来源，生成小鼠骨髓来源的巨噬细胞。小鼠细胞（BV2）在37°C下以5％CO2和20％O2培养，最低限度培养基（MEM）谷氨酸补充剂（Gibco，41090036），其中含有10％（v/v）FCS，1％（v/v）青霉素（100 iu ml -1） - 2米霉素（100 iu mL -1） - 链霉霉素（100μg -mL -mL -mL- mL- mL- mL- mL-1）。使用特定的引物反复测试细胞分枝藻。细胞系购自ATCC（BJ，CRL-4001，WI-38，CCL-75）和AMSBIO（BV-2，AMS.CL-0493-1）。 　　在含有10％（v/v）Fcs的DMEM（生命技术）中培养孤立的小胶质细胞，1％（v/v）青霉素（100 IU ML-1） - 链霉素（100μgml-1）（100μgml-1），glutamax，glutamax（Thermo Fisher Scientific，31331028），31331028），GM-CSF（GM-CSF）（50 ng mun 3），50 ng mun3 and 33 and 33 Immun 3 gun and 33 Immun 3 gun 33M-CSF（100 ng ml-1，免疫学，12343112）。在基因表达分析前4天，用H-151（每天0.5μm）或VBIT-4（每天10μm）处理细胞。根据制造商的说明，使用Celltiter-Blue细胞生存力测定法（Promega，g808a）评估接受H-151（1μM）治疗的原发性小胶质细胞的相对存活。 　　将SGRNA（5'-ATATTCTTGTGCTCAATCC-3'）克隆到PX458-GFP载体（Addgene，48138）中。用生成的载体转染BV2细胞。然后，转染后2天，将活的GFP阳性单细胞分类为96孔板。使用免疫印迹分析对生长的细胞进行了缺失。 　　Primary mouse cortical neuron cultures derived from wild-type mice were cultured on 35-mm-well plates (5 × 105 cells per well) coated with Cultrex poly-lysine (Trevigen) in medium consisting of Neurobasal (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), -glutamine (Invitrogen) and penicillin–streptomycin（Invitrogen）。对于年轻/年龄的小胶质细胞共培养实验，将年轻（8至12周龄）和年龄（24至27个月大的小鼠）分离出1：1的初级小胶质细胞在海马神经元中添加1：1，将它们播种后4小时，并在覆盖层上，并与抗tnf（bio x Cell，bio x Cell，bio x Cell，bio x Cell，bio x Cell，bio x Cell，bio x Cell，cell，cell，cell，cell，cell，cell，25n），ext3.11，be0058，be0058，art.11，be0058m，（Sigma-Aldrich，Mari-5a3，10μgml-1）中和抗体。对于小胶质细胞CGASR241E共培养实验，将从Rosa26-Creert2-CGASWT/R241E小鼠中分离出的原发性小胶质细胞在皮质神经元中添加1：2，将它们播种后4小时，在覆盖层和4-oht（Sigma-Aldrich，T176，T176，600 m miiiip and sigma-aldies and tn coperslips of coperslips of cotortical神经元）中。X细胞，克隆XT3.11，BE0058，25μgml-1）或抗IFNAR中和抗体（Sigma-Aldrich，Mari-5a3，10μgml-1）被添加或不加入培养基，并将细胞共培养72小时。对于条件培养基实验，从Rosa26-Creert2-CGASWT/R241E小鼠中分离出巨噬细胞，并在存在或不存在4-OHT（600μm）的情况下进行区分。收集其条件培养基（从第5天到第8天），通过22μm的网状网格过滤，并在神经元培养物中添加（在神经质培养基中稀释1：2），除了或不在小鼠抗TNF（beio x Cell，Xt33.11，be0058，25μgMl-1）或抗i-ifnβ（ranti-ifnβ（rantififn）（rantififififn）（rantif）中，或不为note note tnf（beio x Cell，beio x Cell），或抗ifnβ（r＆ant-ififnβ（r＆Antifn）。中和抗体。为了分析共培养实验，每载幻灯片的计数是从4个到5个视野平均，从3只小鼠（ROSA26-CREERT2-CGASWT/R241E小胶质细胞）或每只小鼠平均（n = 3）获得，从3到4个磁场获得（view Microglia）。 　　Click-IT EDU反应是根据Click-It成像套件的说明（生命技术的分子探针）进行的。每个条件使用×40的放大射击目标获取四个图像。使用ImageJ确定EDU阳性细胞和DAPI阳性细胞的数量。 　　用12 Gy（RS-2000 X射线辐射剂）辐照人成纤维细胞（WI-38和BJ），并用1μMAbemaciclib（SelleckChem，S7158）或5μgml-1 Bleyomycin（Chemie Brunschwig，trcb595750）处理。每72小时更换一次培养基，并且10天后，每天用刺激抑制剂H-151治疗细胞10天（0.5 µm）。为了获得复制性衰老细胞，将WI-38细胞串行繁殖（在每个通道上，在达到80％汇合后，将细胞胰蛋白酶进行胰蛋白酶和稀释1：4），直到停止增殖（大约90天），然后每天通过刺痛抑制剂H-151（0.5 µm）每天处理1至3周。将小鼠BV2小胶质细胞用10 Gy（卢比X射线辐照器）辐照，每隔一天交换培养基，并每天从辐照后第4天到第6天，每天用DMSO或H-151（1 µM）处理细胞。 　　用2'，3'-二氧胞苷（DDC，Sigma-Aldrich，D5782）预处理BV2细胞6天（20 µm，每隔一天恢复一次），然后在照射（10 gy）（10 Gy），每隔一天口气和细胞在第6天进行分析，以验证第6天的分析。根据制造商的指示，使用Lipofectamine 2000试剂，Thermo Fisher Scientific，大肠杆菌血清型EH100（RA），ENZO，100 ng ML-1）或DSDNA 90-MER转染（每孔2μg每孔的6孔板，Thermo Fisher Scientific，根据制造商的指示）并收集了3小时。 　　为了进行全细胞mtDNA分析，根据制造商的说明，使用Dneasy血液和组织迷你试剂盒（Qiagen，69504）收集了第6天的对照和DDC处理的BV2细胞。为了分析BV2细胞中的胞质分数，根据制造商的说明，使用线粒体/细胞质分级试剂盒（Biovision，K256）从对照或辐照细胞（野生型和ρ0）中分离DNA（野生型和ρ0）。为了分析年轻小鼠原发性小胶质细胞，使用Digitonin隔离缓冲液（150 mM NaCl，50 mM HEPES，25μgml -1 digitonin）在冰上分离细胞，然后在冰上进行10分钟，然后在2,000g下以2,000g的速度离心5分钟，以分离细胞质和膜状提取物。根据制造商的说明，使用Dneasy血液和组织迷你试剂盒（Qiagen，69504）从所有分数中分离DNA。分离的DNA（稀释至20 ng mL -1）用作使用B2M作为核对控的线粒体DNA序列mito和COI表达的QPCR分析的模板。 　　超分辨率的发电机图像是在带有飞行器显微镜（Carl Zeiss）的Zeiss LSM 980上获取的。样品是在96个超纤维板（Perkinelmer）的细胞载体上制备的。Tomm20和DsDNA用针对Tomm20的单克隆兔抗体（ABCAM，AB232589，1：500）和抗DSDNA（Sigma-Aldrich，Mab1293，1：500）标记。然后将样品洗涤并与Alexa Fluor 568/488二级抗体一起孵育。将核用Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，B2261）染色。在Zeiss Zen软件的控制下，使用×63/1.4 NA目标在大多数实验中收集数据；使用了405、488和561 nm激光线。在收集Z堆栈的情况下，使用了软件推荐的最佳切片大小。使用ZEN软件中的标准模式使用Airyscan处理功能进行Airyscan图像处理。为了在整个论文中保持清晰度和统一性，图像是假性的。 　　获取的Z堆栈被导入Imaris（Bitplane）。对于线粒体外部线粒体内外的胞质DNA聚焦定量，使用TOMM20通道产生了表面，并从DSDNA通道产生了斑点。获得并分析了斑点与表面之间的最短距离，以区分线粒体外部线粒体内部或外部的dsDNA。排除了超过1μm的距离。带正值或负值的距离定义为线粒体外部线粒体外部或内部的距离。使用Imaris和ImageJ分析图像，包括3D视图模式的快照图像。 　　辐照人BJ成纤维细胞（12 gy），当完全衰老（第10天）时，使用脂肪切开胺2000试剂（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）将浸泡或SINC（每6孔20 ng RNA）转染时，根据制造商的指导，并根据72 heeaf进行了培养。消音器精选的预先设计的siRNA购自Life Technologies（HSSTING SIRNA 1，S50644； HSSTING SIRNA 2，S50646）。 　　收集人类外植体组织和成纤维细胞培养物的上清液，并在4°C下以1,000g离心，以去除细胞碎屑和死细胞。ELISA是根据BD Biosciences（分别为BD Opeteia，555220，555244，555179）的人类IL-6，IL-8和MCP-1 ELISA集的指示进行的。 　　将小鼠组织和细胞裂解在Pierce Ripa缓冲液中（对于组织，使用均匀剂（Thermo Fisher Scientific）获得破坏），并添加了蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma-Aldrich，11836170001），以防止蛋白质降解。使用Pierce BCA蛋白测定法（Thermo Fisher Scientific，23227）测量裂解物的蛋白浓度，以通过酶 - 连接的免疫吸附测定法测量的2'3'-CGAMP浓度正常化，根据制造商的指示（Cayman Chemicals，Cay-5011700-900-96）。 　　成年小鼠（老年）通过心脏灌注，在0.1 M磷酸盐缓冲液中，用50 mL的1％戊二醛的缓冲混合物和2％PFA灌注（pH 7.4）。灌注结束后，将动物静置2小时，然后将大脑从头骨小心剖析并放入PBS中。接下来，在矢状面上用振动型切割80 µm厚的切片，并收集包含海马的CA1区域的部分。然后将切片固定在甲酰钾（1.5％）和osmium（2％）中，然后用硫代苯二酰胺（1％）染色，然后是四氧化甲苯（2％）。在乙酸铀酰（1％）中对染色进行过夜，然后在50°C的蒸馏水中洗涤，另一种在相同温度下用铅天冬氨酸进行染色。将切片以增加浓度的乙醇脱水，然后嵌入Spurr的树脂中，并在载玻片之间在65°C硬化24小时。 　　为了收集海马CA1区域中小胶质细胞的串行电子显微镜图像，使用剃须刀叶片将小部分的小（约0.5 mm平方）块从整个部分中修剪，并使用导电胶粘合到铝制固件上。用玻璃刀修剪产生一个小的（约300×300 µm）的块，然后将其安装在扫描电子显微镜（Zeiss Merlin，Zeiss NTS）中，固定块面切割微型底部（3view，Gatan）。从块表面切割树脂层，厚50 nm，并在去除每一层后收集靶向小胶质细胞的顺序图像。使用的加速度电压为1.7 kV，像素大小为7 nm，停留时间为1 µs。收集了一系列几乎对齐的图像，并使用ImageJ进行了最终对齐。线粒体的数量是通过图像系列进行的，每个图像均根据其形态进行评分。与看起来正常的膜相比，出现严重破坏的膜和扭曲的形态的人数被计数。 　　数据表示为平均值±S.E.M.除非另有说明。样本数（n）表示图中指定的患者，小鼠，ROI或细胞实验重复的数量。我们使用双面学生的t检验比较了配对或独立的样本，单向方差分析（ANOVA），然后是Tukey的或两边的ANOVA，然后是Sidak的多种比较测试，如所示，并将调整后的P <0.05设置为剪切。假定数据分布是正常的，但没有正式测试。实验者并未对实验条件视而不见，也没有进行随机分组。统计分析的详细信息在相应的图中提供。Excel V.16.72用于组合来自多个实验或数据集的数据。Prism v.9.0用于使用适当的统计测试来生成图形并根据数据进行计算统计，包括双面配对和未配对的t检验以及单向或双向ANOVA。使用适当的校正方法（例如Tukey，Sidak和Geisser -Greenhouse）评估了调整后的P值。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。