溶酶体MTORC1 – TFEB – rag -ragulator megacomplex的结构

　　合成了具有S211A和R245-247A突变的全长密码子优化的人TFEB，具有S75N突变的人RAGC和具有Q66L突变的人RAGA（扭曲生物科学），并将其克隆到PCAG载体中。TFEB（S211A，R245-247A）构建体包括C端的TEV可辨别GFP-HIS10标签。RAGC（S75N）构建体包括N末端的烟草蚀刻病毒（TEV）可分配的GST标签，而Raga（Q66L）无标记。为了表达和纯化TFEB-rag GTPases复合物，将HEK293F GNTI-细胞用总计1 mg的质粒DNA转染（333μgTFEB，400μgTFEB，400μgRaga和267μgRAGC）和4 mg聚乙基（Sigma-Aldrich）的1.1 d.55-ML。48小时后收集细胞，并在洗涤缓冲液（50 mM HEPES，150 mM NaCl，2.5 mM MGCL2、1 mM TCEP，pH 7.4）中通过温和的脂肪裂解，并补充了0.4％的CHAPS和蛋白酶抑制剂（Roche）1 h。通过35,000克离心35分钟来清除裂解液。将上清液与谷胱甘肽Sepharose 4B（GE Healthcare）树脂一起孵育2小时。然后首先将树脂用200 mM NaCl和0.3％的CHAPS在改良的洗涤缓冲液中洗涤，然后在洗涤缓冲液中洗涤。将复合物从树脂中从树脂中洗脱，洗涤缓冲液降低了谷胱甘肽，然后与TEV蛋白酶孵育过夜。将洗脱的配合物浓缩，并使用在洗涤缓冲液中平衡的Superose 6 10/300 GL（GE Healthcare）柱进一步纯化。所有纯化步骤均在4°C下进行。将蛋白质闪烁在液氮中，并储存在-80°C中。如上所述，对野生型TFEB-GFP与活性抹布GTPase进行了尝试的共表达和纯化，但是，野生型TFEB-GFP并未与抹布共同穿时（补充图2）。 　　人套管复合物（GST-TEV – LAMTOR1，HIS6-TEV-LAMTOR2）通过杆状病毒感染在Spodoptera frugiperda（SF9）细胞中表达，如前所述47。简而言之，在72小时的杆状病毒感染后，将SF9细胞颗粒，并用1％Triton X-100和蛋白酶抑制剂在洗涤缓冲液中裂解。离心后清除的上清液应用于氮硝基三环酸重力柱（Thermo Scientific），用含有200 mM NaCl的洗涤缓冲液洗涤，并用带有250 mm咪唑的洗涤缓冲液洗脱。然后将洗脱液应用于用洗涤缓冲液洗涤的谷胱甘肽Sepharose 4B（GE Healthcare）重力柱。然后，该综合体被列在圆柱上的裂解过夜，而无需营养。通过使用SuperDex 200 10/300 GL色谱柱（GE Healthcare）色谱柱进行尺寸排斥色谱法完成进一步纯化。 　　人类MTORC1复合物（MTOR，RAPTOR，MLST8）的三个亚基被密切优化并合成（Genscript）。将MTOR基因克隆到没有标签的PCAG矢量中，将猛禽基因克隆到n末端的PCAG载体中，并将​​MLST8基因在N末端的PCAG载体中，并将​​MLST8基因与PCAG载体一起置于无可辨认的tandem 2×prep propep tark preptep tandem n flak tagep tage tage flak tage tage tagruls n terminus，并将mLST8基因置于PCAG载体中。MTORC1复合物以与TFEB -rag GTPases复合物相似的方式产生，但DNA的总量增加到1.35 mg（900μgMTOR，250μg250μg猛禽和200μgmLST8），每升细胞。MTORC1复合物的纯化过程与先前描述的24相似。另一方面，将链球菌 - - - tactin树脂（IBA LifeSciences）用于亲和力纯化，并用含有10 mm- desthiobiotin的洗涤缓冲液（50 mM HEPES，150 mM NaCl，1 mm TCEP，pH 7.4）洗脱络合物。将洗脱液稀释到等体积的无盐缓冲液（50 mM HEPES，1 mM TCEP，pH 7.4）中，并应用于5 mL HITRAP Q柱（GE Healthcare）。MTORC1复合物和游离猛禽通过100 mL盐梯度和无盐缓冲液和高盐缓冲液（50 mM HEPES，1 M NaCl，1 mM TCEP，1 mM TCEP，pH 7.4）分离。含有MTORC1复合物和游离猛禽的馏分分别浓缩至1.3和0.5 mg ml -1。纯化的蛋白质在液氮中闪烁，并在-80°C下储存。 　　通过孵育0.48μm猛禽，0.59μmTFEB– rag GTPase，1.42μmragulator，9.5μMGTP和9.5μmGDP，在冰上进行5小时，制备了Raptor – TFEB -rag -ragulator络合物复合物。通过运行Superose 6 10/300 GL色谱柱实现了复合物的进一步纯化。对于冷冻EM样品制备，含有完全组装的猛禽 - rag-rag-ragulator络合物的分数浓缩到0.8 mg ml-1。 　　MTORC1 – TFEB – rag -ragulator Megacomplex通过两个步骤重构。首先，通过在2.5μmTFEB -rag GTPase，7.4μmragulator，25μMGTP和25μMGDP中在冰上在冰上的洗涤缓冲液中孵育2.5μMTFEB -RAG GTPase，形成TFEB – rag -ragulator络合物。它通过Superose 6 10/300 GL色谱柱进一步纯化，并浓缩至1.2 mg ML -1。然后将0.36μMMTORC1复合物，1.8μMTFEB -rag -ragulator络合物，18μMGTP，18μMGDP，18μMGDP和36μMAmpPNP孵育在100μL含有5 mM TCEP的洗涤缓冲液中，冰上5 mm TCEP。组装的MTORC1 – TFEB - rag-ragulator megacomplex进一步浓缩至大约1 mg ml-1，以进行冷冻EM样品制备。 　　通过将3 µL新鲜重构复合物涂在发光释放（Pelco Easiglow，45 s的空气中为15 mA和0.37 mbar）的空气和0.37 MBAR孔网（C-Flat，2/1-3c-T）的空气中，制备冷冻EM标本，并使用Fei Vitrobot fei vitrobot fornman foreman ferting ferting ferting soctific plotification softerificational soctific of thero fishman soctific plotificatient y hoter fishman soctific of therman soctific sak595个样品侧的纸张，一张Whatman 595纸在6°C的背面，相对湿度为100％。 　　猛禽 - TFEB – rag-ragulator复合物和MTORC1 – TFEB – rag-ragulator megacomplex的冷冻EM图像记录在泰坦krios G3显微镜（Thermo Fisher Scientific）下，配备了GATAN量子量过滤器（SLIT量子宽度20 ev），并在300 kV处操作。使用SeriaLEM48在K3峰顶直接检测摄像头（GATAN）上实现自动数据采集，以超分辨率相关的双双采样模式，像素大小为0.525Å，降落范围为-0.8至-2.2μm。光束移位得以涵盖每个孔的四个暴露和每个阶段换档的九个孔。对于50架视频堆栈，总暴露时间为7.6 s，将梁强度调节至每帧每帧每帧的剂量速率约为1 e-。分别记录了Raptor -Tfeb -rag -ragulator络合物和MTORC1 – TFEB -TFEB -rag -rag -ragulator megacomplex的10,080和17,028个视频堆栈。 　　在200 kV下运行的TAROS ARCTICA显微镜（Thermo Fisher Scientific）下，记录了TFEB - rag-ragulator络合物的冷冻EM图像。使用SeriaLEM48在K3峰顶直接检测摄像头（GATAN）上实现自动数据采集，以超分辨率相关的双双采样模式，像素大小为0.5575Å，散布范围为-0.8至-2.2μm。光束移位允许每个阶段换档包含9次暴露。对于50框架视频堆栈，总曝光时间为8.6 s，将梁强度调节至每帧每帧每帧的剂量速率约为1 e-。总共记录了TFEB -rag -ragulator综合体的3,438个视频堆栈。 　　使用MotionCor2（参考文献49），通过傅立叶裁剪进行了运动校正的超分辨率视频堆栈2×。在CryoSparc v.3（参考文献50）中的工作流程后，主要处理了由运动校正的显微照片。 　　扩展数据中显示了Raptor – Tfeb – rag -rag -ragulagator复合物和MTORC1 – TFEB -rag -ragulator megacomplex的数据处理方案。分别为2和8。由于数据集的大小，按照相同的协议进行了划分并处理显微照片，然后合并以进行均匀细化。使用CryoSparc v.3中的Patch CTF完成对比传递函数。Blob拾取器和模板拾取器均用于最大化最初采摘的颗粒的数量。二维（2D）分类仅用于去除明显的“垃圾”颗粒（例如，冰和伴侣蛋白污染物）。从头开始重建后，使用异质的细化来选择良好的颗粒，保留具有罕见视图的潜在颗粒，这些粒子在2D分类中无法识别。在使用2D分类和异质细化的大量清洁后，将颗粒合并，并以100-Å截止距离去除重复项。然后为完整数据集执行均匀的细化。通过使用Relion3（Ref。51）（参考文献51）或CryoSparc v.3中的“ SKIP_ALIGN”选项，通过三维（3D）分类来进一步清洁完整数据集。使用加利福尼亚大学旧金山大学（UCSF）PYEM52进行了CryoSparc v.3和Relion3之间数据文件的转换。局部细化用于生成用于模型建设的最终冷冻EM地图。对于MTORC1 – TFEB-rag-ragulator megacomplex，对称性扩展，然后使用局部细化来生成不对称单元的冷冻EM图。 　　总而言之，从169,720个颗粒中获得了3.6Å分辨率图，用于TFEB -rag -ragulator络合物。解决了猛禽 - TFEB – rag-ragulator络合物的三个局部改进图，包括猛禽（377,569个颗粒），规范的RAG-隔室（377,569个粒子）和非官方rag-rag-ragulator（273,453粒子）（273,453个粒子）（273,453粒子）到2.8，2.8，和2.8，2.9和2.9和2.9，和2.9，和2.9，和2.9，和2.9。对于MTORC1 – TFEB – rag-ragulator megacomplex，两个主要种群包含一个（103,274个颗粒）或两个副本（96,166个颗粒）TFEB和非人道rag-rag-ragulator均用C1符号与C1符号分辨为C1的分辨率与3.8Å的分辨率分辨出来。对称人口的对称性扩展和局部改进，两份TFEB和非规范抹布 - 剥离剂的副本产生了3.2Å的分辨率图。 　　所有这些重建图的总体分辨率使用傅立叶壳相关性的金标准标准为0.143截止值54。局部分辨率估计55和局部过滤是在CryoSparc v.3中进行的。 　　为了构建用于猛禽– tfeb – rag-ragulator络合物的原子模型，我们首先拟合了先前的猛禽 - rag-rag-ragulator（蛋白质数据库（PDB）6U62）在我们的冷冻em映射中使用UCSF CHIMERAX46作为刚体的刚体中的结构。TFEB模型的片段最初是从Alfafold2预测56中获得的，并将停靠到我们的低温EM图中。使用phenix57组装了结合三个集中式翻新图的复合图。针对复合图的模型改进是通过Phenix58中的真实空间细化进行的。手动模型建设是使用COOT59和ISOLDE60完成的，以检查和改善本地配件。进行了改进的迭代过程和手动建筑物是为了实现最佳模型。对于MTORC1 – TFEB-rag-ragulator megacomplex，精制的猛禽– Tfeb – rag-ragulator和先前的MTORC1（PDB 6BCX）结构在我们的冷冻em图中停靠。生成了使用集中式不对称单元的对称复合物的复合图。如上所述执行了相同的模型构建程序。所有数字和视频都是使用UCSF Chimerax制作的。 　　Reagents used in this study were obtained from the following sources: antibodies to mTOR (catalogue no. 2983, 1:100 immunofluorescence), Phospho-p70 S6 Kinase (Thr389) (1A5) (catalogue no. 9206, 1:1,000 western blot), p70 S6 Kinase (catalogue no. 9202, 1:1,000 western blot),4E-BP1（目录号9644，1：1,000 Western blot），Phosso-4E-BP1（Ser65）（Ser65）（目录号9456，1：1,000 Western blot），TFEB（目录No.4240，1：1：1：1,000 Western blot）和phoscho-tfeb s211（patho-tfeb s211 no.37681，37681; 37681;GAPDH（6C5）（目录No。SC-32233，1：15,000 Western blot）和LAMP-1（H4A3）（目录SC-20011，1：500 Immunofluorecence）的抗体来自圣克鲁斯；HA.11表位标签的抗体（目录号为901513）是从Biolegend和HRP偶联的小鼠的二抗（目录号401215，1：5,000稀释）和兔子（目录号401315，1：5,000稀释）IGGS来自CalbiioChem。 　　所使用的化学物质是来自Tocris，蛋白酶抑制剂鸡尾酒（CatalogNo。P8340）和呼毒素（目录编号P9620）的Torin1（第4247号目录），来自Sigma-Aldrich和Phosstop磷酸酶抑制剂鸡尾酒桌上（Catalog No。04990683737001）。 　　所使用的质粒是编码全长TFEB-GFP的质粒，此前在参考文献中进行了描述。9。PRK5-HA-GST RAGC野生型（第19304号）和Prk5-HA-GST-RAGA野生型（第19298号）质粒，这是D. sabatini（addgene质粒）的一种礼物。这些细胞测定中使用的所有突变体都是通过使用Quikchange II-E位置定向诱变试剂盒生成的（200555，Agilent Technologies）。 　　HeLa cells were cultured in MEM (catalogue no. ECB2071L, Euroclone) supplemented with 10% inactivated fetal bovine serum (FBS) (catalogue no. ECS0180L, Euroclone), 2 mM glu​​tamine (catalogue no. ECB3000D, Euroclone), penicillin (100 IU ml−1) and streptomycin（100μgml -1）（目录号ECB3001D，Euroclone），并保持在37°C和5％CO2。先前在参考文献中生成并描述了RAGC KO HELA细胞和Raga KO Hela细胞。7. Flp-In 293 T-REx cells (catalogue no. R78007 Thermo Fisher) were grown in DMEM (catalogue no. D6429 Sigma-Aldrich), supplemented with 10% (vol/vol) FBS (catalogue no. 10270 Thermo Fisher), 100 U ml−1 penicillin and 100 µg ml−1 streptomycin (catalogue no.P0781 Sigma-Aldrich），100 µg ML-1 Zeocin（目录No。Ant-Zn-5b Invivogen，Toulouse，France，France）和15 µg ML-1 blasticidin（ANT-BL-5B Invivogen）。通过形态分析验证细胞系，并常规测试缺乏支原体。 　　对于涉及氨基酸饥饿的实验，将细胞用PBS冲洗两次，并在无氨基酸的Roswell Park Memorial Institute培养基中孵育60分钟（除非另有说明）（除非另有说明）（目录No。R9010-01，USBIological，Usbiological）补充了10％的透析FBS。通过3500个分子量截至透析管的1×PBS透析血清，以确保缺乏污染的氨基酸。对于氨基酸的补充，将细胞用1倍的水溶解混合物（目录编号11130036，Thermo Fisher Scientific）和非必需的（目录号11140035，Thermo Fisher Scientific）氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸的氨基酸纪念料中的氨基酸固定在10％的氨基酸公园中，并补充10％的氨基酸。在据报道的情况下，将细胞与氨基酸重新启动过程中的250 nm torin1孵育。 　　将细胞用PBS冲洗一次，并在补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷裂解缓冲液中裂解（250 mM NaCl，1％Triton，25mm HEPES pH 7.4）。总裂解物通过用注射器的25尺寸针通过了十次，在4°C下保持10分钟，然后在微量离心机中通过离心清除（在4°C下14,000 rpm持续10分钟）。通过布拉德福德测定法测量蛋白质浓度。通过在4–12％BIS-TRIS梯度凝胶（目录NP0323PK2 Nupage，Thermo Fisher Scientific）上通过SDS-PAGE解析细胞裂解物，并通过指示的原代抗体进行免疫印迹。 　　将细胞在八孔Lab-Tek II室载玻片上生长，如指示，并在室温下用4％多聚甲醛固定10分钟。在室温下用PBS+0.02％皂苷中的3％牛血清白蛋白进行阻塞。在阻断溶液中稀释初级抗体并在4°C下孵育，然后在室温下阻断溶液中孵育1小时，进行过夜孵育。再洗3次洗涤后，最终将盖玻片安装在Vectashield安装培养基中，并使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚并使用LSM 800或LSM 880+的飞机扫描系统（Carl Zeiss）进行分析，并使用PLAN-APOCHROMP×63/1.4 NA M27 NA M27油免疫物镜使用catalions Oil（CATALF）51 catalf catalff catsal roome。显微镜在ZEN 2013软件平台（Carl Zeiss）上运行。在计算了针对Airyscan的处理后，在ImageJ V.1.47中处理了图像。使用JACOP ImageJ插件计算Mander的共定位系数。 　　用野生型或突变体TFEB-GFP转染FLP-IN 293 T-Rex细胞。使用Fugene HD（Catalog Hd no。e2311），分别用不同的HA-GST-RAGC突变体和野生型Flag-Raga或HA-GST-RAGAH104D/D107R/E111R和FLAG-RAGC，使用Fugene HD（Catalog Hd no。e2311，Promega），分别用不同的HA-GST-RAGC突变体和HA-GST-RAGAH104D/D107R/E111R和FLAG-RAGC，使用HELA RAGC KO细胞或Raga KO细胞瞬时转染了不同的HA-GST-RAGC突变体和野生型Flag-Raga或HA-GST-RAGAH104D/D107R/E111R和FLAG-RAGC。作为对照，将细胞系用链球菌-HA-GFP转染（免疫沉淀印迹上的对照珠车道）。第二天，用330 nm Torin1（目录编号4247，Tocris）处理细胞1小时。随后，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并在室温下与1 mg ML-1二硫代（丙酰丙酰亚胺）交联10分钟一起孵育10分钟。通过将TRIS-HCL pH 8.5添加到100 mM的最终浓度中，将交联反应淬灭，并用冰冷的PBS再次冲洗细胞，并以25 mM HEPES pH 7.4、250 mm NaCl，250 mm NaCl，1％Triton蛋白酶补充蛋白酶和磷酸蛋白酶抑制剂。对于用TFEB作为诱饵进行的免疫沉淀，裂解缓冲液还包括0.1％SD和2 mM EDTA。裂解物通过用注射器的25口径针通过了五次，然后通过离心（4°C下14,000 rpm）清除。然后将裂解液与GFP TRAP磁性琼脂糖珠（NO，GTMA-20，ProteIntech Group，Inc）或Haemagglutinin珠（CatalogNo。A2095，Sigma，Sigma）在2 h下孵育2 h，用40倍lysis lassion Buffer和Eluted the Beads洗涤。通过在8％，10％或15％SDS -PAGE凝胶上通过SDS -PAGE解析裂解物和干燥物的等分试样，并通过使用指定的一级抗体进行免疫印迹分析。检测到Imitter耦合的逻辑信号并用融合FX边缘记录。通过使用ImageJ的光密度分析函数来计算蛋白质条带的强度来进行蛋白质印迹的定量。在每个实验中，将值归一化为各自的对照。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。