UFM1 E3连接酶识别并释放从ER转运的60S核糖体

　　补充表1提供了本研究中使用的抗体和重组蛋白的细节。 　　在补充了10％（v/v）胎牛血清（FBS），50 mg ml-1青霉素 - 抑制霉素和2 mm- glutamine的高葡萄糖DMEM中培养FLP-IN T-REX HEK293细胞（Invitrogen，R78007）。在孵化器中，将细胞保持在37°C下在5％CO2下，并在潮湿的环境中定期检查分枝杆菌。使用CRISPR – CAS9生成CDK5RAP3-KO细胞。CRISPR Sense和反义指南分别将其克隆到PX335（DU64982）中，并分别将PBAB的PURO U6（DU64977）质粒克隆到PX335中。在单独的策略中，将单个指南RNA克隆到PX459矢量中（Addgene，48139）。简而言之，在无抗生素的Dulbecco修饰的Eagle培养基（DMEM）中，将约200万个细胞播种到10 cm盘中，并根据制造商的指导，使用脂三感胺2000（Invitrogen，1168019）用1μg质粒DNA转染1μg质粒DNA。然后，转染后24小时，在2μgml -1紫霉素中选择细胞24小时，然后在预处理培养基中进行24小时的恢复期。通过测序和免疫印迹分析确认细胞进行单细胞分类，扩展和敲除。 　　为了使核糖体失速的化学诱导，在收集前用200 nm雄霉素处理4小时细胞。在冰冷的PBS中洗涤后，将母细胞系（FLP-IN T-REX HEK293细胞）和KOs洗涤，并在冰冷的PBS中收集，并在800G下以离心为颗粒。将细胞颗粒（约2×106个细胞）重悬于125μL的0.02％（w/v）digitonin，50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl，2 mM CACL2和1×完整的蛋白酶抑制剂Cocktail EDTA（ROCHE）。将细胞在冰上孵育10分钟，并在4°C下以17,000克离心10分钟。将上清液转移到新的管（细胞质提取物）中。将其余的颗粒用1×PBS洗涤，并在4°C下以7,000克离心5分钟。将沉淀重悬于125μL1％Triton X-100、50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl和1×无EDTA的无蛋白酶抑制剂鸡尾酒鸡尾酒片中。将其进一步在冰上孵育10分钟，并在4°C下以17,000克离心10分钟。将上清液转移到新的Eppendorf管（膜提取物）中。通过SDS -PAGE解析相等的胞质和膜级分，并使用免疫印迹分析。 　　如前所述3，UBA5，UFC1，UFM1，UFL1 – UFBP1和CDK5RAP3表示并纯化3。将GST – 3C – UFBP1（178–204）应用于谷胱甘肽Sepharose 4B珠（Cytiva），然后在珠子上进行3C-蛋白酶切割，并在HiloAd 26/600 SuperDex 75 PG上纯化，并在25 mm Hepes pH 7.5和200 mm nac中进行预取。将E3MUU构建体应用于Histrap柱上，并用50 mM Tris pH 7.5，200 mm NaCl，20 mM咪唑（pH 8.0）进行了整齐，并用含有300 mm咪唑的相同缓冲液洗脱。Constructs with a cleavable His-tag were incubated with 1:50 TEV protease and dialysed against 25 mM Tris pH 7.5, 200 mM NaCl at 4 °C overnight and further purified on the HiLoad 26/600 Superdex 75 pg column, pre-equilibrated with 25 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl and 1 mM DTT.对于E3MUU（ΔUFIM）–UFC1复合物的结晶，6×His-TEV-UFL1（1-179）与UFC1-UFBP1 204-C融合构建体共表达。在这里，His标签没有被裂。 　　如前所述，进行了单转赖氨酸放电测定，以分析UFC1和UFL1 – UFBP1的活性3。简而言之，通过在含有50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl，0.5 mm DTT，10 mm DTT，10 mm ATP ATP和10 mm MGCL2的反应缓冲液中孵育UFC1，并在含有50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl，0.5 mm NaCl，0.5 mm NaCl，0.5 mm NaCl，0.5 mm MGCl2中孵育0.5μmUBA5、10μMUFM1和10μMUFM1。通过将50 mM EDTA（pH 8.0）添加到反应混合物，然后在室温下孵育10分钟，从而淬灭反应。在50毫米赖氨酸（pH 8.0）的情况下进行排放。该反应在指定的时间点上停止，并在非还原条件下在4–12％SDS-PAGE凝胶上进行分析，然后进行Coomassie染色。 　　在五个15 cm菜肴中生长的HEK293细胞（约80％汇合）用冰冷的PBS短暂洗涤，并在15 mL猎鹰管中收集。将细胞裂解在含有20 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl，5 mM MGCL2、1 mM DTT的缓冲液中裂解，100 µg ML-1环己酰亚胺，1％Triton X-100，1×Complete蛋白酶抑制剂鸡尾酒，EDTA-Free（ROCHE）和10分钟的INSCHASIN，in MIGE in MIGAINCHASIN和10分钟。收集澄清的上清液并分层到10–50％的蔗糖梯度上，其中含有20 mm Tris pH 7.5、150 mM NaCl，5 mM mgCl2、1 mM DTT，100 µg ML-1环酰胺，1％Triton X-100，然后在36,000 RPM下进行3 H型RPM，然后使用1％Triton X-100。收集含有80S核糖体和多聚体的馏分，并在70型Ti转子中以40,000 rpm离心12小时，并在50％的蔗糖垫上分层。然后将核糖体颗粒重悬于含有20 mM HEPES pH 7.6、100 mM KCl，5 mm mg（OAC）2、10 mM NH4CL和1 mM DTT的缓冲液中，并在-80°C下储存，直到进一步使用。 　　如前所述39,40，纯化60S核糖体，并发生了较小的变化。HEK293细胞在15厘米的15厘米菜肴中与含有高葡萄糖DMEM的培养基中的融合度约为80％，这些培养基补充了10％（v/v）FBS，50 mg ml -1青霉素 - 链霉素和2 mM-卢丁胺。为了收集细胞，首先通过抽吸去除培养基，用冰冷的PBS洗涤，然后通过抽吸去除PBS。将细胞在残留的PBS中取消，并转移到15 mL猎鹰。通过以1,000克离心3分钟将细胞固定，并丢弃上清液。接下来，将细胞颗粒重悬于裂解缓冲液中（含15 mm Tris pH 7.6，1,500 mm NaCl，10 mm MgCl2，1％Triton X-100，2 mm DTT，RNASIN（60 U），1×完整的Mini蛋白酶抑制剂（ROCHE），并在冰上及时融合10分钟。然后将细胞裂解物以17,000克离心10分钟，并收集上清液。将收集的上清液直接分层到含有20 mm Tris pH 7.5，500 mm KCl，30％（v/v）蔗糖，10 mM MGCL2，0.1 mm EDTA pH 8.0和2 mm dtt的高盐蔗糖垫上。使用70型Ti转子（Beckman Coulter）以63,000克（24,800 rpm）的离心（24,800 rpm）以63,000克（24,800 rpm）的速度沉淀总核糖体。然后将沉积的核糖体重悬于含有20 mM Tris pH 7.5、500 mM KCl，7.5％（v/v）蔗糖，2 mM MGCL2、75 mM NH4CL，2 mM NH4CL，2 mM puromycin和2 mM DTT的缓冲液中。将含有核糖体的分辨率颗粒在4°C下孵育1小时，然后在37°C下孵育1.5 h。为了隔离40s和60s核糖体亚基，将溶液直接层分成10–30％的蔗糖梯度，其中含有20 mM Tris pH 7.5、500 mM KCl，6 mM MGCL2和2 mM DTT。使用SW41 TI转子（Beckman Coulter）在49,123G（16,800 rpm）下以49,123G（16,800 rpm）的离心（16,800 rpm）离心9 H 42分钟，将60s和40s分开。。使用BioComp分级系统将梯度分馏为0.5 mL分数。收集含有60S核糖体亚基的馏分并将其交换为含有20 mM HEPES pH 7.2，100 mM KCl，5 mM MGCl2，2 mM DTT的缓冲液，并存储在-80°C下。 　　将0.2 µm的预尿液加入0.2 µm的60s核糖体（1×）和0.5 µm的80S核糖体（2.5×）的混合物中，并在23°C下孵育15分钟。孵育后，将混合物分层到10–50％的蔗糖梯度上，其中含有20 mM HEPES pH 7.5、50 mm KCl，5 mM MGCL2，并在4°C下以36,000 rpm离心6 h。然后将样品手动分级分为22个馏分（每个100 µL），并通过使用指定的抗体进行免疫印迹分析共同迁移。 　　在含有20 mM HEPES pH 7.2，50 mM KCl，5 mm MGCL2和0.25 mm TCEP的缓冲液中，将约10 µm的尿素复合物与1 µM纯化的60S核糖体一起孵育，其中含有20 mMMM HEPES pH 7.2、50 mM KCl，在4°C下为2 h h.25 mm tcep。孵育后，将样品与0.05％戊二醛在23°C混合30 s，然后用100 mM Tris pH 8.0（最终浓度）淬灭。然后将交联样品分层到10–30％的蔗糖梯度上，其中含有20 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl，5 mM MGCL2和0.25 mM TCEP，并在4°C下以24,000 rpm在24,000 rpm处使用TLS55转子离心6 h。然后将2.2 mL体积的蔗糖梯度手动分级分为100 µl级分，并通过免疫印迹分析尿素成分，60S核糖体和UFC1 – UFM1的共迁移。然后将含有Urel – 60S核糖体– UFC1 – UFM1的分数合并并浓缩至7.7 mg ML-1，并进行缓冲液交换以除去多余的蔗糖。 　　首先，通过在5 mm mgcl2和5 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm的情况下，通过孵育0.1 µM UbA5、5 µM UFC1、10 µM UFM1、3 µM UFLM1、5 µM CDK5RAP3和1 µM 60S核糖体的体外ufmylation反应。反应后，将10 µM UFC1 – UFM1添加到反应中，并在4°C下进一步孵育2小时。然后将反应产物在蔗糖梯度上分离，并如上一节中所述收集含有60s -rel -ufc1 – UFM1的馏分。 　　用0.05％的戊二醛连锁60s-urel-UFC1 – UFM1复合物在7.7 mg ml-1中以25 mM HEPES pH 7.5，50 mm KCl，5 mM MGCL2，5 mMMGCL2，25 mM DTT制备冷冻网格。使用Pelco Easiglow Glow放电单元在15 mA处排放30 s的Quantifoil R3.5/1铜200网格孔网格。使用Thermo Fisher Scientific Vitrobot MK IV制备冷冻网格，其腔室温度为4°C，湿度为100％。总共将3μl的蛋白质应用于网格中，并用印迹力1立即将6 s涂抹，然后快速地将其快速浸泡到液态乙烷中。 　　在Thermo Fisher Scientific Titan Krios G2传输电子显微镜上收集单粒子冷冻EM数据，该数据具有Thermo Fisher Scientific Falcon 4i直接电子检测器和SelectRisx Energy Filter。收集数据的加速电压为300 kV，名义放大倍数为×165,000，这对应于0.74Å的像素大小（完整的数据采集设置在扩展数据表1中显示）。总共获得了59,394个冷冻EM视频。 　　进口冷冻EM视频，矫正了梁诱导的运动（MotionCor2），并使用RISION（v.3.1）41,42,43估算了CTF参数（CTFFIND4.1）。使用Cryolo（v.1.6.1）44未经训练的粒子拾取（2019年常规模型），从运动校正的显微照片中挑选了大约220万个颗粒，其粒子盒大小为400像素，拾取置信阈值为0.2。与588像素的粒子盒大小相对于摘录的颗粒提取，并重新缩放到128像素（重新缩放像素尺寸，〜3.4Å）。将提取的颗粒进口到冷冻PARC（v.3.2）45中进行处理。生成了七轮无参考的2D类平均值，初始分类不确定性因子设置为2至7，在线迭代的数量设置为40，并且每个类别设置为200，并且所有类似核糖体的粒子都被前进。选定的160万个颗粒用于生成具有C1对称性的初始3D模型。最初的3D模型使用非均匀的改进算法进一步完善，其动态掩蔽启动分辨率设置为低于数据分辨率（即1Å）的值，以生成精制的3D模型和包含整个盒子大小的掩码。蒙版和模型是用于3D变异性分析的输入，要求三个类。将包含连接酶60s核糖体的类的粒子向前进行，进行另一回合的3D细化，这次是动态掩蔽启动分辨率设置为默认值（12Å），而动态蒙版阈值设置为0.1。然后再进行几轮3D变异性分析，要求两类将连接酶结合的60S核糖体与未结合的60S核糖体分开，导致356,394个连接酶结合的核糖体颗粒。然后将颗粒降低至128像素，而Cryodrgn（v.3.2.0）46模型进行了8个潜在维度和50次训练迭代的训练。cryodrgn粒子过滤去除了57,386个垃圾颗粒， 导致最终粒子堆栈为299,008个颗粒。在整个盒子尺寸下，重新提取了包含连接酶结合的核糖体的同质粒子种群。用C1对称性生成一个3D模型，然后在CryoSparc（V.4.2.1）中使用颗粒散焦优化，Ewald球体校正和CTF细化，然后进行不均匀的细化，以生成连接酶结合的60s 60s核糖体MAP。 　　为了进一步完善连接酶复合物的密度，使用UCSF Chimerax（v.1.2.5）47：一个涵盖连接酶配合物加RPL10A，另一个包含核糖体的掩模从最后的3D细化体积创建了两个掩模。核糖体面膜用于粒子信号减法。然后，使用连接酶掩模将信号提取的颗粒用于连接酶复合物加RPL10A的局部细化，以生成仅连接酶的图。CryoSparc（v.4.2.1）3DFLEX19训练模型是为具有6个潜在尺寸的连接酶生成的，并且具有2的刚度为2。由40个最大BFGS迭代的3DFLEX重建使用了最终的3DFLEX模型，以生成最终的连接酶图。 　　使用近60s（v.1.2.1）48 AutoSharpen Map作业对连接酶结合的60S图进行锐化，并使用DeepeMhancer49紧密目标锐化方案锐化了仅连接酶的图。使用COOT（V.0.9.8.1）50建立原子模型。对于结合连接酶的60S核糖体图，PDB 7QWR（参考文献51）通过将模型拟合到密度图中，然后在COOT中进行重建，将模型拟合到密度图中，用作60S核糖体的起始模型。除UFL1 PTC环外，连接酶结合的核糖体图中没有连接酶组件内置。对于连接酶复合物，将单个蛋白质的AlphaFold2模型分成较小的片段，然后将刚性拟合到密度图中，然后在COOT中进行手动重建。UFL1 CTD（残基515-786），CDK5RAP3 UUBD（残基15–116）和UFM1表现出较差的侧链密度，这些区域的侧链密度和这些区域的侧链设置为0。原子模型的占用度为0。使用苯金真实空间改进，并使用Molprobity进行了验证。在UCSF Chimerax（v.1.2.5）47中对所有3D密度图进行了视觉检查。 　　按照上述1.5 mg ml-1样品制备冷冻EM网格。使用Thermo Fisher Scientific Falcon 4 Direct Electron检测器收集在Thermo Fisher Scientific Titan Krios G2传输电子显微镜上收集单粒子冷冻EM数据。收集数据的加速电压为300 kV，名义放大倍数为×96,000，对应于0.82Å的像素大小（扩展数据表1中显示的完整数据录取设置）。总共获得了3,028个低温EM视频。数据是像以前一样处理的，在经过几轮3D变异性分析后，最终地图是从粒子中生成的。 　　将大约1.2 µm UFL1 – UFBP1，2 µm CDK5RAP3，0.2 µm核糖体和10 µm的UFC1 – UFM1与1 mM DSBU（二尿酰亚胺二酰二酰二酰二氨基二氨基尿素）孵育，含有50 mm HEP 7.5，50 mm kcl，6MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM，23°C。通过添加50 mM Tris pH 8.0淬灭反应。根据制造商的协议，使用S-TRAP微型自旋柱（Protifi）处理交联样品进行MS分析。简而言之，通过添加20 mM DTT（10分钟，50°C），然后用40 mM碘乙酰胺（30分钟，20°C）降低交联样品。通过将磷酸添加到最终浓度为5％，然后用90％甲醇稀释在100 mM碳酸氢苯甲酸铵（TEAB）pH 7.1（1：7（v/v）样品：buffer）中，将样品酸化。总共添加了1 µg胰蛋白酶（Promega），然后将样品与S-Trap微型自旋柱（Protifi）结合。随后，将色谱柱用100毫米茶具中的90％甲醇洗涤3次。将另外0.6 µg的胰蛋白酶施加到柱上，然后通过在47°C下孵育90分钟来进行消化。通过用50 mM TEAB（40 µL），0.2％（V/V）甲酸（40 µL）和50％乙腈/0.2％（V/V）甲酸（V/V）甲酸（40 µL）依次清洗肽。然后将洗脱器蒸发至真空离心机中的干燥，并将肽重悬于5％（v/v）乙腈/0.1％（v/v）甲酸（20μl）之前，然后在MS分析之前。将肽（5 µL）注射到征服的Neo LC（Thermo Fisher Scientific）系统中，并将肽捕获在PEPMAP NEO C18陷阱弹药筒（Thermo Fisher Scientific，5 µm粒径，300 µm×0.5 cm）之前，使用易于量的Reverse-prays scients（300 µm×0.5 cm）（300 µm×0.5 cm）（75 µm×500毫米）。通过在溶剂A（水中0.1％（0.1％（v/v）甲酸）中的乙腈中的0.1％（v/v）甲酸）中的2-40％（V/V）溶剂B（0.1％（V/V）甲酸）分离肽。 在250 nl min -1时80分钟以上。将洗脱器注入以阳性离子模式运行的Orbitrap Eclipse质谱仪（Thermo Fisher Scientific）。使用Flexmix溶液（Thermo Fisher Scientific）进行Orbitrap校准。在数据依赖性分析模式下进行数据采集，并使用较高能量的碰撞解离进行碎片化。每次高分辨率全扫描（M/z 380–1,400，r = 60,000），然后进行高分辨率产品离子扫描（r = 30,000），逐步的归一化碰撞能量为21％，26％和31％。使用3 s的周期时间。仅选择电荷状态为3-8+进行碎裂。使用了60 s的动态排除。使用蛋白质组发现器（V.3.0）和内置的Xlinkx模块（Thermo Fisher Scientific）使用以下设置进行交联识别：sequest HT和20 ppm的Xlinkx Tandem MS（MS/MS）的dsbu：dsbu：dsbu，10 ppm和0.02 da。将Cys残基的氨基甲基化设置为静态修饰，并将动态修饰设置为MET氧化和DSBU死端修饰（DSBU抑制，DSBU TRIS和DSBU水解）（每肽最大三个修饰）。仅带有对应于<1％的假差异率的得分的结果。最后，使用最低Xlinkx分数为45，用于过滤交联的肽52,53。 　　如先前所述进行核糖体紫外线化测定3。将纯化的60S核糖体（约0.05 µm）与0.5μmUBA5、1μM UFC1、1μM UFM1和0.1 µM UFL1 – UFL1 – UFBP1混合，其中包含25 mM HEPES pH 7.5、100 mm Nacl，10 mm mgcl2和5 mm的反应缓冲液中的反应缓冲液，均为100 mm nacl和5 mm c.期间。通过添加SDS加载缓冲液来停止反应，并在还原条件下以4–12％的SDS -PAGE凝胶运行，然后使用指定的抗体进行免疫印迹。在包含CDK5RAP3的反应中，将约0.15 µm的CDK5RAP3与0.1 µM UFL1 -UFBP1一起添加到反应中。 　　如前所述，从HEK293细胞中分离出多个细胞，并以轻微的修饰。简而言之，在实验前一个晚上，将HEK293细胞播种。在实验当天，在收集前，用0.1％DMSO或200 nm型氨基霉素处理细胞。用冰冷的PBS洗涤细胞，以800g的速度刮掉并通过离心5分钟。然后将颗粒重悬于含有20 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl，5 mM MGCL2、1 mM DTT的裂解缓冲液中，100 µg ML-1环己酰亚胺，0.02％Digitonin，Digitonin，完整的蛋白酶抑制剂Cocktail，EDTA-Free（Roche）和Rnassin和Rnassin和Rnassin。在冰上在冰上孵育5分钟，并在4°C下以17,000克离心10分钟。丢弃含有细胞质提取物的上清液，并用20 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl和5 mM MGCL2洗涤其余的沉淀，并以7,000g的速度离心5分钟。将上清液丢弃，并将沉淀重悬于裂解缓冲液中，其中含有20 mm Tris pH 7.5、150 mM NaCl，5 mM MGCl2、1 mM DTT，100 µg ML-1环己酰胺，0.5％Triton X-100，完整的蛋白酶抑制剂cocktail，Edta-free，ROCHE（ROCHE）。将重悬的颗粒在冰上孵育10分钟，并在4°C下以17,000克离心10分钟。将含有膜分数提取物的上清液转移到新的Eppendorf管中，并使用纳米体系统对每个样品进行了量化的RNA量。然后将RNA归一化样品分层到10–50％的蔗糖梯度上，其中含有20 mm Tris pH 7.5、150 mM NaCl，5 mM MGCL2、1 mM DTT，100 µg ML-1环己酰胺和RNASIN，然后在36,000 rpm中以3 h h 3 h h。然后，使用生物彩色分级系统通过分馏分离多个多个，并使用蛋白质印迹分析。 　　通过将0.1 µm 60s核糖体，0.2 µm或0.3 µm富含80s（超过60s超过60s）与0.5 µM UBA5，1 µM UFC1，1 µM UFC1，1 µM UFM1，0.3 µM UFL1 – UFL1 – UFL1 – UFL1 – UFL1 – UFL1 – UFL1和0.3 µM中孵育，进行体外尿反应进行了体外的反应。MGCL2和5 mm ATP在37°C下持续15分钟。孵育后，将反应混合物分层在10–50％的蔗糖梯度上，其中含有20 mm Tris pH 7.5、150 mM NaCl，5 mM MGCL2、1 mM DTT，并在36,000 rpm下以3 h h 36,000 rpm在4°C下以3 h速度离心。使用BioComp分馏系统对梯度进行分馏。然后在4–12％的SDS -PAGE凝胶上运行蔗糖梯度级分，并通过免疫印迹分析RPL26的ufmylation。 　　短暂地用冰冷的PBS短暂洗涤，在十个15 cm菜肴中生长的亲本细胞（WT HEK293）或CDK5RAP3-KO细胞（约80％汇合），并在15 mL猎鹰管中收集。通过在500克离心5分钟通过离心将细胞颗粒。将细胞沉淀物重悬于含有20 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl，5 mM MGCL2、1 mM DTT的缓冲液中17,000克10分钟。澄清的上清液是胞质分数，被丢弃。将剩余的膜沉淀重悬于含有20 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl，5 mM MGCL2、1 mM DTT，100 µg ml -1环己酰亚胺的裂解缓冲液中（Roche）和rnasin在冰上持续15分钟，然后以17,000克离心10分钟。收集澄清的上清液并分层到10–30％的蔗糖梯度上，其中含有20 mm Tris pH 7.5、150 mM NaCl，5 mM MGCl2、1 mM DTT，100 µg ML -1环酰胺，并在36,000 Rpm中以36,000 RPM的速度分离3小时。收集含有60s核糖体的分数并将其交换为含有20 mM HEPES pH 7.2、100 mM KCl，5 mM MGCL2和2 mM DTT的缓冲液，并在-80°C下储存直至使用。 　　通过将0.05 µM膜溶解60S核糖体（60S – SEC61溶解并从CDK5RAP3-KO细胞溶解并富含0.5 µm UBA5，1 µm UFC1，1 µm UFC1，1 µm UFC1，0.1 µM UFM1，UFM1，UFM1，UFM1，UFM1，UFM1，UFM1，0.1 µm UFM1，UFM1，UFM1，UFM1，UFM1，UFM1，0.1 µm UFM1，UFM1，UFM1，UFM1，UFM1，UFM1，0.1 µm，60s – Sec61溶解并富集），通过孵育0.05 µm膜溶解60S核糖体（60s – Sec61）进行体外60S – SEC61解离反应。CDK5RAP3在5 mM MGCL2和5 mM ATP的情况下在37°C下持续25分钟。在反应结束时，将反应混合物分层在10–50％的蔗糖梯度上，其中含有20 mm Tris pH 7.5、150 mM NaCl，5 mM MGCL2和1 mM DTT，并以36,000 rpm离心3 h，使用SW41 Ti Rotor 3 h。使用BioComp分馏系统将蔗糖梯度分馏。通过免疫印迹将蔗糖梯度分数分离在4–12％SDS-PAGE凝胶上，并分析Sec61β与60S核糖体的共同迁移。 　　首先，在存在UFL1 – UFBP1或尿素的情况下，进行了体外核糖体ufmylation反应，以产生Ufmylated核糖体。然后，在4–12％的SDS-PAGE凝胶上运行反应产物，以分离单纤维化核糖体。接下来，切除了对应于单一和DI-Fufmylated核糖体的条带，并根据先前描述的协议54进行凝胶消化。通过液相色谱与MS/MS（LC – MS/MS）结合在Exploris 240（Thermo Fisher Scientific）系统上，与Evosep One（Evosep）耦合到Exploris 240（Thermo Fisher Scientific）系统上，分析了消化的肽。根据制造商的建议将样品加载到Evotips上，并使用30 SPD方法进行分析。然后，使用数据依赖性采集在Exploris 240系统中分析肽，MS1分辨率为60,000，AGC目标为300％，最大注射时间为25 ms。然后使用TOP 2 S方法分裂肽，MS2分辨率为15,000，NCE为30％，AGC为100％，最大注射时间为100 ms。肽识别是在Maxquant（V.2.0.2.0）中对含有同工型的Uniprot swissprot人类（2021年5月5日发布）进行的，并启用了匹配。将氨基甲基甲基化（C）设置为固定的修饰和氧化（M），乙酰基（蛋白质N-端），并将二肽丝丝甘氨酸 - 甘氨酸（K）的添加设置为可变修饰。其他参数留为默认值。 　　首先将30 µm UBA5，30 µm UFC1（C116K）和60 µM UFM1在25 mm HEPES pH 7.5、200 mm NaCl，10 mM MGCL2和10 mM ATP中孵育。用0.5 m盖，pH 11.5将反应混合物的pH调节至9.8，并在23°C下孵育18小时。随后使用HILOAD 26/600 SUPERDEX 75 PG柱从UBA5分离UFC1 – UFM1，并未反应的UFC1和UFM​​1分离，并用25 mM HEPES pH 7.5，200 mm NaCl进行了预取平。 　　使用坐式蒸气扩散技术获得UFC1 – UFM1晶体，UFC1 – UFM1（22.8 mg ML-1）的晶体为1：1，与30％（v/v）PEG 400，0.1 m tris pH 8.5，0.5，0.5，0.2 m na柠檬酸酸盐混合，并在19°C下孵育。单晶在2-3天内出现。晶体在含有30％（v/v）乙二醇的结晶缓冲液中闪烁。在Diamond Light Source（DLS），Beam Line I04上收集数据集，并使用XIA2（参考55）和Dials56进行处理。使用UFC1（PDB：3EVX）58和UFM1（PDB：5IA7）59作为起始模型的晶体结构通过分子置换（Phaser）57求解晶体结构。分别使用REFMAC60和COOT50（CCP4I2 Suite）进行改进和模型构建。数据收集和细化的统计数据在扩展数据表2中列出。 　　使用坐落式蒸气扩散技术获得UFL1 – UFBP1 – UFC1晶体，ufl1 – UFC1 – UFBP1（20.2 mg ml-1）的1：1与1.03 m Li2SO4，0.1 M Li2SO4，0.1 M HEPES pH 7.2混合，并在19°C下孵育。单晶在1-2天内出现。晶体在含有30％（v/v）乙二醇的结晶缓冲液中闪烁。在欧洲同步加速器辐射设施（ESRF），光束线ID23-EH2上收集数据集，并使用AutoProc Suite61（包括XDS62，XDS62，Doctless63 Aimeless64，CCP4（参考文献65）（参考文献65）和Staraniso66）进行处理。使用Alphafold11预测UFL1和UFBP1的模型以及UFC1（PDB：3EVX）58的晶体结构，通过分子置换（Phaser）57通过分子置换（Phaser）57求解晶体结构。分别使用REFMAC60和COOT50（CCP4I2 Suite）进行改进和模型构建。数据收集和细化的统计数据在扩展数据表2中列出。 　　使用SuperDex 200增加3.2/300色谱柱进行分析SEC运行，并用25 mM HEPES pH 7.5，200 mm NaCl，0.5 mm TCEP进行了预衡。将共有50 µL不同组分的50 µL蛋白混合并在冰上孵育30分钟，然后再加载到柱上。 　　使用Microcal Peaq-ITC（MALVER）进行ITC实验。首先将蛋白质透析到含有25 mM HEPES pH 7.5，200 mM NaCl，0.44 mM TCEP的ITC缓冲液中。每个实验由13次注射持续时间为6 s，然后在注射之间进行150 s的间距，除了UFBP1 UFIM – UFM1的实验，其中包括19个注射。所有实验均在25°C下进行。 　　使用Adobe Illustrator，生物和Chimerax47来制作数字。 　　本研究中的所有cDNA构建体均由H.M.M.，J.J.P。生成。以及MRC PPU试剂和服务团队的克隆团队。所有质粒都存放在MRC PPU试剂和服务上，可在https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/上找到。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。