H3K36Me3引导的核小体脱乙酰基的不同模式通过RPD3S

　　RPD3S复合物的成分，包括全长RPD3，SIN3，RCO1，UME1和EAF3，通过PCR从总酵母DNA中扩增。所有这些成分及其突变体被克隆到修饰的PfastBac baculoviral表达载体中。在RCO1的N末端设计了一个可与TEV裂解的链球菌标签，以进行亲和力纯化。BAC-BAC杆状病毒系统用于表达昆虫细胞中的靶蛋白。将RPD3的所有成分的细菌病毒以预定比率混合，以实现细胞中的化学计量表达。SF9昆虫细胞在27°C共转染72小时。通过以2,700 rpm离心在4°C下以20分钟的速度收获细胞，并将颗粒重悬于细胞裂解缓冲液中（20 mM Tris-HCl pH 7.5，300 mM NaCl，5％甘油，5％甘油，0.1％NP-40），向1 mm pmsf和蛋白酶蛋白酶蛋白酶和蛋白酶Inbibitor Cocktail提供。使用56％扩增在冰上进行裂解缓冲液中的细胞超声检查，在冰上进行15分钟。通过在4°C，25,000 rpm离心1小时通过离心去除细胞碎屑。清除的裂解物与链球链球珠共孵育，然后通过细胞裂解缓冲液连续洗涤，最终通过洗脱缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mm NaCl，10mm -desthiobiobiotin）洗脱靶蛋白。将含有RPD3的馏分与TEV蛋白酶在4°C下孵育过夜，以切开标签。用阴离子交换柱（GE Healthcare）进一步纯化了消化的蛋白质。使用Superose 6增加5/150 GL色谱柱（GE Healthcare）（20 mM HEPES pH 7.5，150 mm NaCl），通过尺寸排斥色谱浓缩，浓缩和纯化靶蛋白。 　　如前所述41，从一侧发出的Widom 601序列和一个从一侧发出的20 bp接头DNA纯化了质粒的质粒，该质粒编码20个重复序列（每个侧面是ECORV限制性酶切割位点）。在大肠杆菌菌株BL21（DE3）中表达了全长未修饰的Laevis组蛋白H2A，H2B，H3和H4，并使用先前报道的方法42纯化。所有修饰的H3或H4均通过KS-V肽（KS-V肽）合成。如先前所述41，对含有未修饰的K36me3 H3或乙酰化的H3/H4的组蛋白八聚体进行了重塑。用托马斯和巴特勒兹43描述的盐梯度方法的修饰用于与DNA的组蛋白重构。组蛋白八聚体和DNA在2 m NaCl下合并；在36小时的时间内，盐浓度逐渐降低至0.25 m NaCl，导致核小体核心颗粒（NCP）的形成。 　　通过将15μM蛋白与5μMNCP混合获得RPD3S -NCP复合物。我们使用Grafix Method44纯化并稳定了RPD3S和RPD3S -NCP复合物。为了形成梯度，将含有50 mM NaCl，20 mM HEPES（pH 7.5）和10％甘油（Sigma）的6 mL顶溶液添加到管中（Beckman，331372）。然后使用带有钝针头的底部注入含有50 mM NaCl，20 mM HEPES（pH 7.5），30％甘油和0.15％甘油的底部溶液（6 mL），30％的甘油和0.15％的戊二醛。将试管放入梯度主（Biocomp）中，形成连续的密度和戊二醛梯度。最后，加载了200μl样品。将样品管以35,000 rpm的速度在4°C下进行超速离心14小时。（贝克曼，转子SW-41TI）。每500μl收集分数。选择最佳的馏分，并透析至缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，50 mm NaCl，3％甘油）进行电子显微镜样品制备。对于低温EM，将4μl样品的等分试样浓度为〜0.2 mg ml-1施加到发光递减网格（量化1.2/1.3）。然后将网格印迹3.5 s，并使用玻璃体（FEI）将液态乙烷浸入液态乙烷中。EM网格在以300 kV的速度运行的Titan Krios透射电子显微镜（FEI）上成像。在K3（Gatan）上收集了总共6,990张RPD3S复合物，其像素大小为每像素0.55Å，总共在K3（GATAN）上收集了10,786张RPD3S-核小体的图像，其像素大小为0.541Å。自动化2用于自动数据集合45。自动设置散焦，值在-1.5至-1.8μm之间。大约50 e -Å2分数分为32帧（暴露时间2.56 s）。 　　使用MotionCor246进行运动校正。使用GCTF47估算CTF参数。对于RPD3S复合物数据集，自动颗粒拾取和3回合2D分类为48,49，在3D分类的第一轮中选择了约263万个颗粒。初始模型是通过Relion生成的，低通滤波至60Å，以获得3D参考。经过2轮分类后，选择了〜670,000个颗粒，并用于3D自动再填充和后处理，从而在3.2Å处重建了整个RPD3S复合物。在局部蒙版3D分类后，桥 - 桥 - 右臂，选择了〜348,000个颗粒，并进行了3D自动精制和后处理，从而产生了头桥 - 右臂的局部密度图，分辨率为2.7Å。同样，将桥左臂的局部密度图以3.2Å的形式重建。对于RPD3S-核体复杂数据集，选择了两个数据集，分别为10,786个显微照片。自动颗粒拾取和2轮2D分类后，选择了约259万个颗粒进行3D分类。初始模型是通过Relion生成的，低通滤波至60Å，以获得3D参考。经过2轮3D分类后，随着核小体上RPD3S复合物的变化，RPD3S-核小体配合物的两个代表性类别相对更好。对于CHD - 核小体复合物，〜427,000个颗粒以接近状态的3D自动refine和后处理，从而获得了CHD-核小体配合体的局部密度图，分辨率为2.8Å。在RPD3S复合物上进行了一轮3D分类后，进行了两类，从而导致了两个不同的稳定RPD3S复合物的不同状态。这两个类别都经过全局3D的细化，在4.0Å（接近状态）的分辨率为4.0Å（松散状态）下产生两个密度图。在RPD3S复合物的3D细化后，解决了两个类别的RPD3的3.3Å映射和3.4Å地图。 　　使用RELION49创建本地分辨率图，并使用UCSF Chimera50表示。所有报告的分辨率均基于金色标准的傅立叶壳相关（FSC）0.143。校正了最终的FSC曲线，以使其具有高分辨率噪声取代的软面膜的效果。 　　RPD3S综合体的整个结构模型是根据头桥 - 右臂区域的2.7Å地图和桥梁 - 左臂区域的3.2Å地图手动建造的。Alphafold用于预测和确定RCO152中的特殊打结线圈。核小体（PDB ID：6ESF）和EAF3 CHD（PDB ID：3E9G）的结构用作CHD-核小体模型的初始结构模板，该模型使用UCSF Chimera50将其停靠在冷冻EM图中。EAF3-A CHD是用COOT建造和调整的，而EAF3-B CHD被停靠到冷冻EM地图中。通过将RPD3S复合物和CHD-核体结构停靠在2.8Å的CHD-核体，3.3Å地图和RPD3S复合物的3.4Å地图中，RPD3S-核体复合体的两个结构模型是通过将RPD3S和CHD – Nucleosoms结构停靠到2.8Å的地图中。使用Phenix53在实际空间中精炼了这些模型。扩展数据表1和2中显示了地图重建和模型改进的统计数据。使用Molprobity54评估了最终模型。图中的地图和模型表示由Pymol（https://pymol.org/），UCSF Chimera50或UCSF Chimerax55制备。 　　使用Microcal Peaq-ITC仪器（Malvern Panalytical）在25°C进行了RCO1蛋白的野生型或突变型PHD1结构域的量热实验。所有蛋白质和合成组蛋白肽均在含有20 mM Tris 7.5、50 mM NaCl和5％甘油的相同滴定缓冲液下制备。通过在280 nm处的吸光度光谱法确定蛋白质浓度。通过大规模称重，等分并冷冻干燥以供个人使用来量化肽（> 95％的纯度）。使用“一组绑定位点”拟合模型的Origin 7.0（OriginLAB）分析获得的量热滴定曲线。详细的肽序列信息是H31-10UN：Artkqtarks。 　　Antibodies used: rabbit polyclonal anti-H3K9ac (ABclonal, A7255, dilution: 1:5,000), mouse monoclonal anti-H3K14ac (PTM BIO, PTM-157, clone name: 1A4, dilution: 1:500), mouse monoclonal anti-H3K18ac (PTM BIO, PTM- 158, clone name:9E1, dilution: 1:750), rabbit polyclonal anti-H3K23ac (PTM BIO, PTM- 115, dilution: 1:1,500), mouse monoclonal anti-H3K27ac (PTM BIO, PTM- 160, clone name: 12G5, dilution: 1:2,000), mouse monoclonal anti-H3K56ac (PTM BIO,PTM-162，克隆名称：9G9，稀释：1：1,000），兔多克隆抗H3K36Me3（PTM Bio，PTM-625，PTM-625，稀释：1：1,000），兔子单克隆抗H4K5AC（Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich，04-118，04-118，Clone name：1：1：1：RM156，rm156anti-H4K8ac (ABclonal, A7258, dilution: 1:6,000), rabbit polyclonal anti-H4K12ac (ABclonal, A22754, clone name: ARC56881, dilution: 1:1,000), rabbit monoclonal anti-H4K16ac (Cell Signaling Technology, 13534S, clone name: E2B8W,稀释：1：500），小鼠单克隆抗H4（PTM BIO，PTM-1009，克隆名称：3f2，稀释：1：1,000）和兔多克隆抗H3（Abclonal，A2348，A2348，稀释：1：2,000）。 　　对于RPD3S脱乙酰化测定，H3KAC，H4KAC和H3K36ME3核小体（500 nm）在体外组装而成，在缓冲液中以不同浓度的不同RPD3S复合物处理20 mm HEPES HEPES 7.5，150 mm NaCl，以及0.2 mm NaCl和0.2 mg mg mg mg ml -nacl，在300 mm nacl和0.2 mg ml -1 bsa at at 30 ca。对于由不同的组蛋白修饰和H3K9R突变体引起的酶活性的差异，我们在20 mM HEPES 7.5、150 mM NaCl，0.2 mg ML -1 BSA和0.15μgμl -1 LL -1 Salmon Sperm DNA的缓冲液中采用了酶活性测定。对于核小体样品，在25分钟后增加了80 mM EDTA和5×SDS -PAGE凝胶载荷缓冲液。将样品在95°C煮沸5分钟，并通过4–20％SDS -PAGE分辨。转移到PVDF膜，H3K9AC，H3K14AC，H3K18AC，H3K23AC，H3K27AC，H3K27AC，H4K5AC，H4K8AC，H4K8AC，H4K12AC，H4K16AC，H4K16AC和TOTAL H4通过Western绘制的特定抗体在单独的凝胶上检测到特定的抗体。通过ECL可视化蛋白质印迹带。 　　将纯化的RPD3S复合物与室温下2小时的5 mM Bis（硫糖酰亚胺）链酸酯（BS3）交联。用40 mM Tris-HCl pH 7.5淬灭反应。然后切除交联样品以进行凝胶消化，并通过质谱鉴定。为了开始凝胶内消化过程，用25 mM二硫代醇（DTT）二硫化物还原样品，并用55 mM碘乙酰酰胺烷基化。使用测序级修饰的胰蛋白酶在37°C的50 mM碳酸氢铵中使用测序级修饰胰蛋白酶进行过夜进行凝胶消化。将肽用1％三氟乙酸在50％乙腈水溶液中提取两次，持续30分钟。然后将肽提取物在SpeedVac中离心以减少体积。 　　对于液相色谱 - 潮一流质谱法（LC – MS/MS）分析，通过60分钟的梯度洗脱以0.300μlmin-1的流量分离肽，并使用Thermo-Dionex Ultimate 3000 HPLC系统，该系统与Thermo Orbitrap Fusion量质谱仪直接连接。分析柱是一个自制的熔融二氧化硅毛细管柱（内径为75μm，长150 mm； Upchurch），上面装有C-18树脂（300 A，5μM； Varian）。流动期A由0.1％甲酸组成，流动相B由100％乙腈和0.1％甲酸组成。Orbitrap融合质谱仪使用XCalibur3.0软件以数据依赖性的采集模式运行，并且在Orbitrap（350-1,550 m/z，120,000分辨率）中有一个完全扫描的质谱。使用Proteome Discovery Searching算法（版本1.4），使用每个LC -MS/MS运行中的每个LC -MS/MS运行的MS/MS光谱搜索。使用PLINK2软件处理原始数据56。使用Xinet57制备了交联网络图。 　　RCO1的PHD1和BHC80的PHD的组蛋白H3K4UN读数是高度保守的。另外，RPD3用HDAC1高度保守。基于这些信息，RPD3S和RPD3S – H3K36ME3核小体配合物，BHC80 – PHD（PDB ID：2PUY）和HDAC1 – H4K16HX（PDB ID：PDB ID：5ICN）的结构是为使用蛋白质制备wizard wizard in Maessestro（Schrore）（Schrorder）（Schricinger）释放的。加入氢，并在蛋白质制备过程中确定可滴定氨基酸的质子化状态。然后使用Schrödinger58中的Glide/SP肽进行对接。58。组蛋白H31–7K4UN停靠在RCO1-A的PHD1中，组蛋白H312–16K14AC停靠在RPD3的HDAC催化口袋中。同时，H38-11在H31-7K4UN和H312–16K14AC之间伸展，受到氢键相互作用和空间阻滞的阻碍。 　　RCO1和突变体以及其本机启动子被克隆到PRS415质粒上。然后将质粒（包括对照质粒）转化为Ste11-His3报告菌株（YBL853）。为了分析酵母菌菌株的生长，将浓度为600 nm（OD600）的光密度的新鲜培养物的五倍连续稀释液发现到SC-LEU（对照）和SC-HIS-LEU平板上，直到饱和。 　　为了分析H3K9AC对酵母生长的重要性，我们使用CRISPR-CAS9基因组编辑方法59来靶向HHT1和HHT2基因，并在W303-1A菌株中获得H3K9R突变体。将细胞稀释至0.4的OD600，并连续稀释5倍。在100μgml-1 6-AU板上发现每个稀释度约5μl，直到饱和。 　　为了检查体内RCO1突变体引起的乙酰化水平，将RCO1野生型和突变体以及其天然启动子克隆到PRS415质粒。然后将质粒转化为RCO1剥落菌株（YBL534）。酵母菌菌株在Leu培养基中在30°C下过夜，稀释至0.1的OD600，再生长8小时，至0.8-1.0的OD600。为了检查H3K9R突变菌株中H3和H4乙酰化的变化，W303-1A和W303-1A-H3K9R在YPD的30°C下过夜，稀释至0.1的OD600，并将其生长为8小时，至OD600 0.8-1.0的OD600。如上所述提取酵母细胞蛋白。将样品在95°C煮沸20分钟，并通过4–20％SDS -PAGE分辨。转移到PVDF膜，H3K9AC，H3K14AC，H3K18AC，H3K23AC，H3K27AC，H3K27AC，H3K56AC，H4K5AC，H4K8AC，H4K8AC，H4K12AC，H4K12AC，H4K16AC，H4K16AC和Total H4与特定于特定抗体的蛋白质印记一起在特定的抗体中检测到。通过ECL可视化蛋白质印迹带。 　　为了检查体内RPD3S复合物引起的H3K56AC的水平，然后将PRS415-RCO1和对照质粒转化为YBL534菌株。酵母菌菌株在Leu培养基中在30°C下过夜，稀释至0.1的OD600，再生长8小时，至0.8-1.0的OD600。H3K9AC，H3K14AC，H3K18AC，H3K23AC，H3K27AC，H3K56AC和总H3通过蛋白质印迹检测到单独的凝胶上的特定抗体。通过ECL可视化蛋白质印迹带。 　　所有酵母菌菌株均使用标准程序构建，并在补充图1中列出。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。