PGE2限制肿瘤浸润茎状CD8+ T细胞的效应子的扩展

　　这项研究中使用的所有小鼠均以C57BL/6J遗传背景，并从杰克逊实验室（JAX）购买。通过将OT-I小鼠（JAX，003831）与CD45.1（JAX，002014）小鼠交叉（JAX，003831）生成OT-I×CD45.1小鼠。通过交叉PTGER2 - / - 小鼠（JAX，004376）与PTGER4FL/FL小鼠（JAX，028102）产生PTGER2 - / - PTGER4FL/FL小鼠（JAX，004376），并进一步交叉至CD4CRE小鼠（Jax，022071），以cd4cretate cd4cretate cd4 crepter or e try me or -pterm/pt -ptger 2- ptger 2 - ptger2- ptger2-ptger2-ptger2-ptger2-ptger2-ptger2 − ptger2-ptger2-ptger2-ptger2 =GZMBCRE小鼠（JAX，003734）生成GZMBCREPTGER2 - / - PTGER4FL/FL小鼠。除非另有说明，否则小鼠在CD45.2/CD45.2背景上。对于某些实验，将CD4Creptger2 - / - PTGER4FL/FL小鼠和PTGER2 - / - PTGER4FL/FL小鼠交叉至OT-I小鼠，以生成CD4CREPTGER2-/ - / - PTGER2 - PTGER4FL 4FL/FL OT-I小鼠，并使用PTGER2-/pTGER2-/ - / - / - / - / - fl and a rice-in-in-in-in-in-in-in-in-in-in-in-ot acon-ot acon-io cger4 fl yot roc and acon-io cger4 fl yot-iot ron cot-iot acoCD45.1/CD45.2或CD45.1/CD45.1背景。在CD45.2/CD45.2上，WT或RAG1 - / - 小鼠（JAX，002216）在收养转移实验中用作接受者。在所有实验中，在6-12周龄时的小鼠进行性匹配，并随机分配给对照组或治疗组。使用PTGS1/PTGS2 - / - BRAFV600E肿瘤和T细胞耗竭的小鼠实验没有盲目进行；所有其他实验都是以盲目的方式进行的。没有使用统计方法来预先确定样本量。小鼠在麻醉下被宫颈脱位杀死。在Klinikum Rechts der Isar，Tum或Klinikum derUniversitätmünchen，LMU下维持和饲养所有小鼠，在不含特定的Pathogen的无PATHEN，可控的条件下，具有12小时的光向周期，环境温度，24°C的环境温度为24°C和湿度为55％，并维持55％的动物，并遵守欧洲欧洲统治的行为。所有动物实验均按照上巴伐利亚地区政府的指南（第5部 - 环境，卫生和消费者保护）进行。 　　如前所述，使用CRISPR -CAS9系统生成对照和PTGS1/PTGS2 - / - BRAFV600E黑色素瘤细胞。BRAFV600E-OVA和PTGS1/PTGS2 - / - BRAFV600E-OVA细胞是通过慢病毒转导产生的。简而言之，将OVA cDNA亚克隆到含有磷酸甘油酸酯激酶（PGK）启动子和IRES-PUROMYCIN抗抗性序列的pHIV-7转移载体中。如前所述44进行了第三代自动驱散慢病毒载体的生产，用VSV.G伪型进行。具体而言，转染包装细胞，并在2天后收集细胞上清液，过滤并用于在存在8 µg ML – 1多紧甲烯（Merck）的情况下转导肿瘤细胞系。在孵育期之后，将培养基换成新鲜培养基，并在转导后至少将靶细胞转移三遍，并使用嘌呤霉素选择。MC38细胞由A.Krüger，实验性肿瘤学研究所，TUM和MC38-OVA和PANC02细胞提供，由V. Buchholz，医学微生物学研究所V. Buchholz提供，免疫学和TUM。 　　BRAFV600E，PTGS1/PTGS2 - / - BRAFV600E，BRAFV600E-OVA和PTGS1/PTGS1/PTGS2 - / - BRAFV600E-OVA细胞在完整的RPMI培养基中培养（RPMI 1640培养基（Hepto Fisherific fisherific fisherific fisherific fisherific fisherific）50％FC，β-苯二醇（Thermo Fisher科学），50 U ML – 1青霉素（Thermo Fisher Scientific），50 µg ML – ML – 1链霉素（Thermo Fisher Scientific）和2 mM-谷氨酰胺（Thermo Fisher）（Thermo Fisher Fisher Scientif）thermifific corporific fortimic forner corpientimen corpient。MC38-OVA and Panc02 cells were cultured in DMEM (Thermo Fisher Scientific), with both media supplemented with 10% FCS, 50 µM β-mercaptoethanol, 50 U ml–1 penicillin, 50 mg ml–1 streptomycin, 2 mM -glutamine, 1× MEM non-essential amino acids solution (Thermo Fisher Scientific) and 1 mM sodium丙酮酸（Thermo Fisher科学）生成肿瘤细胞的培养基（CM），在20 mL完整的RPMI培养基中培养5×106的肿瘤细胞，并在-20°C下收集上清液，并在-20°C下储存PTGS1/PTGS2 - / - BRAFV600E细胞，PGE2 ELISA（Cayman Chemical）常规证实了PGE2的产生。 　　通过胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific）脱离肿瘤细胞系，并在无菌PBS（Thermo Fisher Scientific）中洗涤3次。除非另有说明，否则将2×106个细胞注入S.C.在100 µL无菌PBS中，进入每个受体小鼠的侧面。使用数字卡尺测量肿瘤生长。数字中指定的肿瘤直径是指每个肿瘤的最长直径的平均值及其垂直线的平均值。15毫米的最大肿瘤直径用作人道终点，在任何实验中均未超过。 　　为了耗尽CD4+和CD8+ T细胞，小鼠接受了100 µl抗小鼠CD4（每只小鼠100 µg，GK1.5，Bioxcell）或抗小鼠CD8β（每只小鼠100 µg，每只小鼠，53-5.8，Bioxcell）抗体，每天5天后，在天数中，接受了100 µl抗小鼠CD4（100 µg，GK1.5，Bioxcell）或抗小鼠CD8β（100 µg，每只小鼠100 µg，每天100 µg）。 　　FTY720治疗是通过注射小鼠腹膜内的。在肿瘤细胞移植后的第1天或第6天，用100 µL的FTY720（每只小鼠，默克）20 µg（默克）。注射100 µL无菌等渗NaCl用作对照。 　　为了阻断IL-2Rβ和IL-2RγC，接受了腹腔内的小鼠。在肿瘤细胞移植后的第6和7天注射150 µL抗小鼠CD122（每只小鼠300 µg）和抗小鼠CD132（每只小鼠300 µg，3e12，bioxcell）抗体。注射150 µL无菌等渗NaCl用作对照。 　　在细胞移植后指定的时间点切除肿瘤，TDLN或脾脏的脾脏。使用显微镜确定肿瘤或器官重量。For subsequent analyses by flow cytometry or cell sorting, tumour samples were mechanically dissociated and incubated with collagenase IV (200 U ml–1, Thermo Fisher Scientific) and DNase I (100 µg ml–1, Merck) for 40 min at 37 °C and filtered through a 70 µm and a 30 µm cell strainer (Miltenyi) to generate single-cell suspensions.脾脏通过70 µM细胞过滤器，然后使用30 µM细胞滤网进行红细胞裂解和第二个过滤步骤。LN通过30 µM细胞过滤器。对于迁移CDC1的分离，如描述的肿瘤样品处理LN。 　　以下抗体和染色试剂用于流式细胞仪或细胞分类：可固定的生存能力染料Efluor 450（稀释：1：500； Thermo Fisher Scientific）；可固定的生存能力染料APC-EF780（1：1,000; Thermo Fisher Scientific）;生存能力染料Sytox-Blue（1：2,000; Thermo Fisher Scientific）;APC抗CD3（1：100;克隆17a2，Thermo Fisher Scientific）;PE抗CD4（1：200; gk1.5，biolegend）;AF647抗CD4（1：200; gk1.5，biolegend）;PERCP/CY5.5抗CD4​​（1：200; GK1.5，biolegend）;BV421抗CD8α（1：200; 53-6.7，Biolegend）;FITC抗CD8α（1：200; 53-6.7，Biolegend）;Pe-Dazzle594抗CD8α（1：200; 53-6.7，Biolegend）;PE-CY7抗CD8α（1：200; 53-6.7，Biolegend）;BV605抗CD11b（1：200; M1/70，Biolegend）;PE-CY7抗CD11C（1：200; n418，biolegend）;BV570反小鼠/人类CD44（1：100; IM7，Biolegend）;BV711反小鼠/人类CD44（1：100; IM7，Biolegend）;FITC抗小鼠/人类CD44（1：100; im7，biolegend）;percp-cy5.5抗小鼠/人类CD44（1：100; im7，biolegend）;AF647抗CD45.1（1：100; A20，Biolegend）;PE抗CD45.1（1：100; A20，Biolegend）;PE-DAZZLE594抗CD45.1（1：100; A20，Biolegend）;percp/cy5.5抗CD4​​5.1（1：100; a20，biolegend）;Bv510抗CD45.2（1：100; 104，Biolegend）;FITC抗CD45.2（1：100; 104，biolegend）;PERCP-CY5.5抗CD4​​5.2（1：100; 104，biolegend）;FITC抗CD62L（1：100; mel-14，biolegend）;Pe-Dazzle594抗CD62L（1：100; MEL-14，Biolegend）;FITC抗CD103（1：100; M290，BD Biosciences）;APC抗CD132/IL2RγC（1：100; Tugm2，biolegend）;PE-DAZZLE594抗CD186/CXCR6（1：200; SA051D1，Biolegend）;PE抗CX3CR1（1：100; SA011F11，Biolegend）;BV605抗CD279/PD-1（1：100; 29 F.1A12，biolegend）;BV421抗CD366/TIM-3（1：200; RMT3-23，Biolegend）;PERCP/CY5.5抗TCRβ（1：100; H57-597，Biolegend）;AF700抗I-A/I-E（1：500; MHC II类）（M5/114.15.2，Biolegend）;PE抗H-2KB与siinfekl结合（1：100; 25-d1.16，biolegend）;APC抗人GZMB（1：200; GB12，Thermo Fisher Scientific）;FITC抗KI-67（1：100; Sola-15，Thermo Fisher Scientific）; AF700反KI-67（1：100; Sola-15，Thermo Fisher Scientific）;PE抗TCF1/TCF7（1:40; S33-966，BD Biosciences）;AF488抗人PSTAT5（每次测试0.03 µg，47/STAT5（PY694）； BD Biosciences）；EF660抗TOX（1：100; TXRX10，Thermo Fisher Scientific）;EFLUOR660 RAT-IGG2A-κ-同型控制（1：100; EBR2A，Thermo Fisher Scientific）;APC小鼠-igG1κ同型控制（1：200; P3.6.2.8.1，Thermo Fisher Scientific）;AF488小鼠-igG1κ同型控制（每次测试0.03 µg； MOPC-21，Biolegend）；和Rabbit-Anti-Mouse-TCF1/TCF7（1：100; C.725.7，Thermo Fisher Scientific）。随后是AF647驴 - 抗兔IgG（1：200; Poly4064，Biolegend）或DL488 DL488驴-Anti-Rabbit IgG（1：200; Poly4064，biolegend）。除非另有说明，否则所有抗体均为抗小鼠抗体。 　　为了染色表面标记和活力染料，将细胞在FACS缓冲液（具有1％FCS和2 mM EDTA的PBS）中在4°C下染色15分钟。对CDC1的Siinfekl – MHC I类染色进行了40分钟进行OVA交叉呈递分​​析。对于GZMB，TCF1，KI-67和TOX的细胞内染色，根据制造商的方案，使用真核转录因子缓冲液集（Biolegend）固定并使用真实核转录因子缓冲液集（Biolegend）进行通透。在4°C的透化缓冲液中进行过夜的细胞内染色。对于PSTAT5的细胞内染色，根据制造商的说明（协议II和III和III，BD Biosciences），使用BD Cytofix（BD Biosciences）和BD Phosflow Perm Buffer III（BD Biosciences）固定细胞并通透了透化。为了检测EDU融合，在实验的最后3小时中，将EDU以15 µM的最终浓度添加到培养物中，并根据制造商的协议使用EDU增殖试剂盒（IFLUOR 488，ABCAM）进行分析。 　　Flow cytometry analyses were performed using a LSR Fortessa Cell Analyzer (BD Biosciences, BD FACSDiva software v.8.0.1 and v.9.0.1), a SP6800 Spectral Cell Analyzer (Sony Biotechnologies, spectral analyser software v.2.0.2.14140) or a SA3800 Spectral Cell Analyzer (Sony Biotechnologies, spectral analyser softwarev.2.0.5.54250）。对于细胞数量的流式细胞量定量，在分析之前，将countbright绝对计数珠（Thermo Fisher Scientific）添加到样品中。对于某些实验，CD8+TIL（活的CD45+CD3+CD8+细胞），类似茎的CD4CREPTGER2 - / - PTGER4FL 4FL/FL OT-I TILS（LIVE CD45.1+CD8+CD44+CD44+TIM-3-CXCR6- CXCR6-）或不同CD45.1+CD8+CD44+TIM-3+CXCR6+）使用FACS ARIA III细胞分选仪（BD Biosciences，BD FACSDIVA软件v.9.0.1）进行分类。使用SH800S细胞分系师（Sony Biotechnologies，Cell Sorter Software V.2.1.6）从血液中对使用中的幼稚OT-I T细胞（CD45.1+CD8+CD62L+CD44–）进行分类。使用FlowJo（BD Biosciences，V.00.8.1和V.10.8.2）分析了所有流式细胞仪数据。 　　对于幼稚T细胞的产物T细胞转移，来自OT-I，PTGER2 - / - PTGER4FL 4FL/FL OT-I或CD4CREPTGER2 - / - PTGER2 - PTGER2- PTGER4FL 4FL/FL OT-I小鼠的1×103含有1×103个贴有明显的幼稚CD8+ T细胞。在肿瘤细胞移植前6小时，在无菌PBS中进入性匹配的受体WT小鼠。为了产生CRISPR-Cas9编辑的T细胞，将1×103个细胞从体外T细胞培养物中符合明显的OT-I T细胞。肿瘤细胞移植S.C.第2天进入受体小鼠。为了重新转移CD8+TIL，7×103符合茎状（TIM-3 – CXCR6 –）或区分效应子（TIM-3+CXCR6+）CD4CREPTGER2 - / - PTGER4FLL/ - PTGER4FLER4FL/ - pTGER4FL/ - fl ot-i tils从Mc38-ova tumors中排序，从WT的MC38-ova tumors中排序。在无菌PBS中，在T细胞重新转移前2天接种了与MC38-OVA肿瘤细胞接种的性匹配的受体RAG1 - / - 小鼠。 　　如前所述35，通过重复激活将TCF1+ CD8+ T细胞与脾脏幼稚的CD8+ T细胞区分开，并进行了较小的修饰。简而言之，将1×106幼稚的CD8+ T细胞播种在补充有1×MEM非必需氨基酸溶液和1 mM丙酮酸钠的完整rpmi培养基中。低剂量IL-2（85 U ML – 1）和小鼠抗CD3/CD28微粒被添加到培养物中，同时在4天内维持多个（重新）激活循环的CD8+ T细胞浓度为每mL 1×106细胞，然后在4天内通过梯度净化细胞（梯度离心）（pancollat​​ion pancollat​​ion）。 　　如先前所述的35，对TCF1+ CD8+ T细胞的效应子分化进行了较小的修改。简而言之，在存在高剂量IL-2（350 U ML – 1）的情况下，将细胞与小鼠抗CD3/CD28微粒培养。如图所示，pGE2（100 ng ml – 1，除非在图形图例中另有说明； thermo Fisher Scientific），肿瘤细胞CM，IL-7（10 ng ML – 1，Miltenyi），IL-12（10 ng ml – 1，biolegegend）或IL-15/15Rα（1 ng ml – 1 ng ml – 1，Thermo – 1，Thermo fishicic）是培养物。为了评估T细胞的扩展，在孵育期后，通过72小时通过流式细胞仪对活的CD45+CD3+CD8+T细胞的数量进行定量。 　　从脾脏中纯化CD4CREPTGER2 - / - PTGER4FL/FL OT-I T细胞，并在添加了IL-2（10 U ML – 1）和IL-7（5 ng ML – 1）的完整rpmi中培养，并在小鼠抗CD3/CD28 microbeads的情况下进行。24小时后，通过磁分离去除抗CD3/CD28微粒，并将细胞电穿孔（4d-nucleofector，Lonza； Pulse Program CM137）46在P3电极缓冲液中补充了Cas9电动缓冲液，并补充了CAS9电动增强剂（IDT），Cas9蛋白（IDT）和CAS9蛋白（IDT）和CD122-TARES或NONNON或NONNON或NONNON或NONNONGEN。gRNAs were generated by hybridizing trRNA (IDT) with Cd122-targeting (sequences TATGTCAAGGAGGTCCACGG and CTGGGAACGACCCGAGGATC, generated using CHOPCHOP; ref. 47) or non-targeting crRNA (IDT) (GCCTGCCCTAAACCCCGGAA; ref. 48) as mock control.将细胞放在完整的RPMI中，补充了IL-7（5 ng ML – 1，Miltenyi）在37°C下持续48 h，并在注射到受体小鼠中的CD122表面染色之前对特异性敲除验证。 　　将来自体外培养物的TCF1+ CD8+ T细胞在添加的RPMI中静止20小时，并补充了低剂量IL-2，并通过梯度离心纯化。在不存在或存在PGE2（100 ng mL – 1）的情况下，用小鼠抗CD3/CD28微粒和低剂量IL-2刺激细胞24小时。24小时后，通过流式细胞仪分析IL-2RγC链表达。为了分析IL-2诱导的STAT5信号传导，通过磁分离去除抗CD3/CD28微粒，将细胞在37°C的完整rpmi中休息30分钟，并以不同浓度的IL-2（10-100 U ML – 1）刺激30分钟。在孵育期之后，将固定缓冲液直接添加到培养物中，以终止信号传导过程，并将细胞染色以进行流式细胞仪分析。 　　肿瘤细胞移植后11天切除含肿瘤小鼠的肿瘤和器官，直接在液氮中冷冻，并储存在-80°C下直至进一步加工。使用GentleMacs discocator（Miltenyi）在同质化缓冲液（0.1 M PBS，1 mM EDTA和10 µM吲哚美辛（Merck），pH 7.4）中匀浆样品。根据制造商的规程，通过ELISA（Cayman Chemical）测量PGE2浓度。 　　使用Arcturus picopure RNA分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific）分离RNA，并使用敏感器cDNA合成试剂盒（Bioline）生成cDNA。根据制造商的协议，使用Takyon no Rox sybr Mastermix DTTP蓝色套件（Eurogentec）在LightCycler 480（Roche，LightCycler 480软件v.1.5.1）上进行定量实时PCR。使用ΔCT方法确定PTGER4表达，HPRT用作参考基因。引物序列来自先前的研究38。所有引物均购自Eurofins。 　　肿瘤细胞移植后11天，从BRAFV600E肿瘤中对CD8+ TIL进行分选。在库制备过程中，将细胞散列和DNA条形码的组合组合用于样品多路复用，这使每组的四个生物学重复同时进行了测序。对于细胞散列，使用独特的totalseq-c抗小鼠主题标签抗体用于每个实验组的细胞，如下所示：wt：ashtag 1;PTGER2 - / - PTGER4FL/FL：标签2;CD4CREPTGER2 - / - PTGER4FL/FL：标签3;和GZMBCREPTGER2 - / - PTGER4FL/FL：主题标签4（每个1：250，Biolegend）。将每组含有肿瘤的小鼠的标签细胞汇总，并将其加载在铬的下一个宝石芯片上（10倍基因组学）。使用Chromium Next Gem单细胞5'试剂盒V.2用户指南生成RNA-seq库，并根据制造商的协议（10X Genomics）具有特征条形码技术（REV D）的特征条形码技术。使用高灵敏度DNA试剂盒（Agilent），生物分析仪2100和Qubit DSDNA HS分析套件（Thermo Fisher Scientific）进行质量控制。为了进行测序，使用S4 V.1.5（300个周期）测序试剂盒（Illumina）在NovaseQ6000平台上通过配对末端测序（2×150 bp）汇总和分析库。对于基因表达文库，将库至少为每个细胞的深度为2×104读，而T细胞受体文库的每个细胞读数为5×103。 　　对来自PTGER2 - / - PTGER4FL/FL，CD4CREPTGER2 - / - PTGER4FL/FL/FL/FL和GZMBCREPTGER2 - / - PTGER4FL/FL的所有样品进行了初始SCRNA-SEQ分析。使用CellRanger Multi（CellRanger Multi（v.6.1.1）49; 10x基因组学）与预构建的小鼠参考V2020-A（10X基因组，MM10/GRCM38，GRCM38，GENCODE释放M23的注释M23）进行对数的比例进行基因表达文库的比对和反复插图。使用参数-Reads-per-fastq设置为BAM文件加上10,000中的读取总数，将BAM文件转换为fastq文件。之后，通过分别为每个曲线的样品分别运行CellRanger多运行的CellRanger组合基因表达和TCR分析，从而使文库一致性加强了。该算法被迫找到反复传递的第一步中鉴定出的细胞数量，并将样品特异性FASTQ文件用作基因表达分析管道的输入。使用预构建的ENSEMBL GRCM38小鼠V（D）J参考V.5.0.0用于TCR分析。 　　最初的下游分析在R（V.4.0.4）中使用R包Seurat（v.4.0.1）50进行。仅检测到超过1,000个基因的细胞，少于10％的线粒体基因和UMI计数的计数低于平均值的3个标准偏差。在其中一个样品中至少三个细胞中检测到的基因过滤数据。使用SCTRANSFORM（V.0.3.2）51独立对每个样品的过滤读数计数进行了归一化，并使用Glmgampoi Method52进行了归一化的读数。使用规范相关分析和30个规范矢量，在顶部的1,000个高度可变基因上鉴定了来自不同重复物的细胞之间的锚固。在第20个PC分析（PCA）维度上进行了数据积分。计算PCA针对前1,000个高度可变基因上的集成数据计算，并在30个最近的邻居和前20个PCA维度上计算了K-Neartime Trigner图和UMAP。使用共享最近的邻居模块化优化的算法在分辨率为0.9、0.65和0.9的pTGER2 - / - PTGER4FL/FL，CD4CREPTGER2 - / - PTGER4FL/FL/FL和GZMBCREPTGER2-和GZMBCREPTGER2 - / - / - / - / - PTGER4FL/FL，分别是相应的。根据标记基因CD14，LYZ2，FCGR3，MS4A7，FCER1G，CST3，CST3，H2-AA，LY6D，LY6D，MS4A1和LY6D的平均簇表达鉴定污染的髓样细胞。根据CDK1，MCM2，PCLAF，H2AFZ，BIRC5和MKI67的表达鉴定循环细胞。 　　组之间的综合分析在R（v.4.2.1）中使用R封装Seurat（v.4.1.1）50进行。如上所述，在污染细胞的一般数据预处理和回归之后，使用sctransform（v.0.3.2）51独立将每个样品的过滤读数计数与Glmgampoi Method52独立归一化。使用更保守的方法鉴定出所有组和所有重复的细胞之间的锚固剂，从而导致批次校正较弱。为此，将相互的PCA应用于每个样品的前1,000个高度可变基因上，并仅使用前20个维度和1个邻居挑选锚。PCA是对顶部1,000个高度可变基因的集成数据进行的。在前20个PC和30个最近的邻居上计算了K-Neart最初的邻居图和UMAP（扩散0.4，最小距离为0.01）。使用基于共享的邻居模块化优化算法，将0.6的分辨率用于露天簇识别。使用Wilcoxon级别测试和Bonferroni校正确定了两组之间的DEG。使用AddModulesCore函数计算了单细胞水平的基因集表达得分，其中仅包括检测到的基因。与参考数据集的相似性得分是使用R软件包Singler（v.1.10.0）53计算出最高200摄氏度的。幼稚的CD8+ T细胞，记忆干细胞CD8+ T细胞和中央记忆CD8+ T细胞的处理后转录组曲线来自先前的研究54。对于TDLN中的肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞，使用R Package deseq2（V.1.36）55处理了先前研究3的肿瘤渗透茎状CD8+ T细胞及其幼稚的对应物。使用AddModulesCore函数计算了单细胞水平的基因集表达得分，其中仅包括检测到的基因。效应子T细胞基因签名来自先前的研究56（M3013：KAECH_NAIVE_VS_DAY8_EFF_CD8_TCELL_DN）。CD8+ T细胞增殖特征是从MSIGDB获得的（GO：2000566）。使用R套件弹弓（V.2.4.0）57在集成数据上计算的UMAP上推断转录轨迹，将曲线近似于150分。假频率计算为跨谱系的加权平均值，并由分配权重加权。 　　使用R软件包屏幕（V.1.6.0）58进行clonotype的TCR分析。基于包含CDR3区域TCR和核苷酸序列的VDJC基因的组合称为clonotypes。每当为单个组显示clonotype分布时，单元格数就会降采样，因此所有组的群集1具有相同的最大大小。使用Dorothea（v.1.8.0）60获得的去耦（V.2.2.2）59和TF – TARGET相互作用的加权平均方法（V.1.8.0）60来推断TF活性，其置信水平a至PTGER2 - / - PTGER2 - / - PTGER4FL/FL通过从其他组的得分中减去其得分。每个组中群集之间的前100个变量TF用于绘制带有tidygraph（v.1.2.1）61的网络图，该网络图基于具有与数据库中定义相同的调节模式的通用目标。仅保留至少两个常见目标的TF进行可视化。使用IGRAPH（v.1.3.2）62以0.5的分辨率鉴定出Louvain簇。 　　为了添加来自WT组的SCRNA-SEQ数据，如上所述进行了对样品进行预处理，并映射到由PTGER2 - / - PTGER4FL/FL的集成数据形成的参考，CD4CREPTGER2 - / - PTGER4FL/fl/fl/fl/fl/fl和GZMBCREPTGER2-使用50组（使用50 se）。为此，使用互惠PCA在TOUP 1,000高度可变的基因上使用相互PCA鉴定了参考组和WT组之间的细胞之间的锚固。仅使用前20个维度和1个邻居挑选锚。使用函数传输传输注释，并使用IntegrateEmbedDings集成了数据。然后将来自添加组的细胞投射到带有30个最近邻居的参考UMAP调用Projectumap的坐标上。使用DeepTools（v.3.5.4）63估计读取覆盖范围，其BAMCOVERAGE和BIN尺寸为10 bp，并通过每百万映射的读数为bins归一化。为了在TCF7/TCF1+和TCF7/TCF1-簇上进行覆盖范围分析，使用SAMTools（v.1.1.13）64，通过簇1-2或簇3–8的细胞条形码分配BAM文件。使用R软件包TrackViewer（V.1.32.1）65可视化基因轨迹上的读取覆盖范围。 　　在存在或不存在PGE2（100 ng ml – 1）的情况下，在37°C下孵育1小时，在37°C下孵育1小时，然后用IL-2或IL-2或IL-2 Plus小鼠抗CD3/CD28微粒刺激4小时，将其重复活化的TCF1+ CD8+ T细胞孵育1小时。使用总RNA微型RNA（Monarch）分离总RNA。使用NEB的NEB下一个Ultrarna库准备套件进行库制备，其中i7和i5索引读取为8 bp，每次读取mRNA库制备和poly a富集。使用S4（v.1.5）（300个周期）测序套件（Illumina），在配对末端模式下的NovaseQ6000 PE150平台上进行了测序。使用HISAT2（v.2.0.5）映射工具对读取与鼠标参考基因组（GRCM38/MM10，NCBI）对齐。为了量化基因表达水平，使用特征（v.1.5.0-p3）来计算映射到每个基因的读数，然后根据基于基因长度和读数计算每千千座转录序列的片段每千倍序列的片段计算。使用DESEQ2 R软件包（V.1.20.0）识别DEG。使用WALD测试通过Benjamini -Hochberg方法进行了多次测试，并通过DESEQ2鉴定，调整后的P值<0.05 <0.05 <0.05且倍数变化≥2分配为DEGS，从而获得了调整后的P值。使用GGPLOT2 R软件包GGPLOT2（v.3.4.2）可视化火山图，并使用R中的PRCOMP函数进行PCA，并使用R packages ggplot2和ggrepel（v.0.9.3）进行可视化。通过比较“抗CD3/CD28+IL-2”和“ PGE2处理+抗CD3/CD28+IL-2”组获得的DEG，根据其log2折叠变化值进行了订购，并使用GSEA（v.4.3.2）对MH.All.all.all.all.all.al.v20223.1.mmm（mssigigmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm（v.4.3.2）进行GSEA（v.4.3.2）进行了GSEA。使用GSEA（v.4.3.2）的预先工具用于通过调整后的P值确定NES和显着性。 　　GraphPad Prism软件（V.9.5.0和V.9.5.1）用于统计分析。亲和力设计师（V.1.10.6）（Serif）可视化数据。如图传说中所示，使用配对或未配对的两尾学生的t检验，单向方差分析或双向方差分析来评估统计显着性。数据显示为平均值±S.D.，平均值±S.E.M.或盒子和胡须图，如图传奇所示。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。