康复性个体中对SARS-COV-2的收敛抗体反应

　　在2020年4月1日至5月8日之间，该研究招募了157名合格的参与者。在其中，有111名（70.7％）是患有SARS-COV-2感染的个体，如PCR证实，具有逆转录（RT – PCR）（病例），46（29.3％）是诊断为SARS-COV-2感染（接触）的人的密切接触。尽管纳入标准允许入学无症状参与者，但在进一步的分析中排除了八个未发展症状的接触。149例病例和接触没有症状，这些症状在采集样本时至少14天，这些症状至少14天。参与者的人口统计和临床特征在扩展数据中显示了图1a和补充表1，2。只有一个对RT-PCR对SARS-COV-2感染呈阳性的人仍然无症状。其他148名参与者报告的症状暗示了COVID-19，平均发作症状在样本收集前约39天（范围为17-67天）。在此队列中，症状平均持续12天（0-35天），而参与者中有11个（7％）被住院。最常见的症状是发烧（83.9％），疲劳（71.1％），咳嗽（62.4％）和肌痛（61.7％），而基线合并症很少见（10.7％）（补充表1，2）。症状的持续时间或严重程度（方法）没有显着差异，或者从症状发作到性别之间的样本收集或病例和接触之间的样本收集。我们队列中男女之间没有年龄差异（扩展数据图1）。 　　使用抗IGG或抗IGM二级抗体进行检测6,7（图1，图1，扩展数据2、3和补充表1），通过经过验证的酶联免疫吸附测定法（ELISA）测试血浆样品与SARS-COV-2 RBD和三聚体S蛋白结合。在所有实验中，包括八个独立的阴性对照和来自参与者21（COV21）的阳性对照等离子体样品（COV21）。总体而言，测试的血浆样品中有78％和70％表现出抗RBD和抗S IgG AUC，它们至少高于对照的两个标准偏差（图1A，B）。相比之下，只有15％和34％的血浆样品显示出对抗RBD和抗S的IgM响应，这些反应至少在对照以上至少两个标准偏差（图1C，D）。抗RBD或抗S IgG或IgM水平与症状持续时间或样本收集时间相对于症状发作之间没有正相关（图1E和扩展数据图3A – C，G – J）。相比之下，可以预期的是，抗RBD IgM滴度与症状的持续时间和样品收集的时间呈负相关（图1E和扩展数据图3H）。抗RBD IgG水平与年龄和包括住院在内的症状的严重程度中等相关（图1F，G和扩展数据图3K）。值得注意的是，女性的抗RBD和抗S IgG滴度低于男性（图1H和扩展数据图2F）。 　　为了测量康复血浆样品中中和活性，我们使用了基于HIV-1的病毒体，这些病毒体携带纳米荧光素酶报告基因，这些病毒蛋白是用SARS-COV-2 S蛋白（SARS-COV-2伪病毒；图2，方法2，方法，方法和扩展数据图4）进行了伪造。所有实验中包括负（历史样本）和阳性（COV21）对照。通过一半最大的中和滴度（NT50）衡量的队列中中和活性的总体水平通常很低。NT50值的样本中的33％中的值小于50，在79％的样本中低于1,000（图2A，b）。几何平均值NT50为121（算术平均值= 714），只有2个个体达到5,000以上的NT50值（图2A，B和补充表1）。 　　值得注意的是，抗RBD和抗S IgG抗体的水平与NT50值密切相关（图2C，D）。中和活性也与年龄，症状的持续时间和症状的严重程度相关（扩展数据图5）。与这一观察结果一致，症状持续时间更长的住院个体比未住院的个体平均中和活动水平略高（p = 0.0495）（图2E）。最后，我们观察到男性和女性之间中和活性存在显着差异（p = 0.0031）（图2F）。男性和女性之间的差异与男性中较高的抗RBD和抗S IgG滴度一致，不能归因于年龄，症状的严重程度，相对于症状的发作或持续时间，样本收集的时间（图1H和扩展数据图1B – E，2F）。 　　为了确定SARS-COV-2感染引起的抗体的性质，我们使用流式细胞仪来分离单个B淋巴细胞，这些淋巴细胞携带了从六个选定个体的血液中绑定到RBD的受体的单个B淋巴细胞，包括两个具有最高中和活性的样品和四个具有高中性中性活性的样品（图3）。抗原特异性B细胞的频率通过其与phycoerythin（PE）和Alexafluor-647标记的RBD结合的能力确定，范围为0.07至0.005％，范围为0.07％至0.005％，占COVID-19-CONVALESCENT中的所有循环B细胞的范围为0.07至0.005％。我们通过从6个疗养个体的单个RBD结合B细胞的RT – PCR获得了534个配对的IgG重链和轻链（IGL和IGL）序列（方法和补充表3）。与人类抗体库相比，几个IGHV和IgLV基因的代表性明显过高（扩展数据图7）。The average number of nucleotide mutations in V genes for IGH and IGL was 4.2 and 2.8, respectively (Extended Data Fig. 8), which is lower than in antibodies cloned from individuals with chronic infections such as hepatitis B or HIV-1, and similar to antibodies derived from individuals with a primary malaria infection or from non-antigen-enriched circulating IgG memory cells8,9,10,11.除其他抗体特征外，IGH CDR3长度与报告的规范没有区别，疏水性低于平均值12（扩展数据图8）。 　　与其他人类病原体一样，在Covid-19之后，所有测试的个体康复中都有病毒抗原结合B细胞的膨胀克隆（图3B，C和方法）。总体而言，回收的IGH和IgL序列的32.2％来自克隆扩展的B细胞（范围为21.8-57.4％）（图3B）。在不同个体中共有IGHV和IgLV基因的特定组合的抗体占所有克隆序列的14％（图3B，C）。值得注意的是，在不同个体中发现的某些抗体的氨基酸序列几乎相同（图3D）。例如，在不同个体中反复发现，由克隆膨胀的B细胞表达的抗体与IGHV1-58/IGKV3-20和IGHV3-30-3/IGKV1-39反复发现，分别具有高达99％和92％的氨基酸序列身份（图3D和补充表4）。我们得出的结论是，对SARS-COV-2 RBD的IgG记忆响应富含复发和克隆扩展的抗体序列。 　　为了检查抗SARS-COV-2抗体的结合特性，我们表达了94种代表性抗体，67个来自克隆的抗体，27个来自单链球的抗体（补充表5）。ELISA表明，测试的抗体中有95％（在94个）中有95％（包括克隆和独特序列结合到SARS-COV-2 RBD），平均半最大有效浓度（EC50）为6.9 ng ml-1（图4A和扩展数据图9A）。其中一部分（在77个测试中，有7个，或9％）与SARS-COV的RBD交叉反应，EC50值低于1μgml-1（扩展数据图9B，C）。MERS，HCOV-OC43，HCOV-229E或HCOV-NL63的RBD没有明显的交叉反应性。 　　为了确定单克隆抗体是否具有中和活性，我们对SARS-COV-2假病毒进行了测试（图4和补充表6）。在测试的89种RBD结合抗体中，我们发现52个中和SARS-COV-2伪病毒，IC50值范围为3至709 ng ml-1（图4B，C，E和补充表6）。这些抗体中最有效的一部分还针对正宗的SARS-COV-2进行了测试，这些抗体用IC50值小于5 ngml-1的病毒中和该病毒（图4D，E）。与SARS-COV的RBD交叉反应的抗体中只有两种对SARS-COV假病毒的中和活性显着（扩展数据图9D，E）。 　　在个体中发现了有效的中和抗体，无论其血浆NT50值如何。例如，抗体C121，C144和C135分别为1.64、2.55和2.98 ng ml-1，分别从真实的SARS-COV-2中获得了COV107，COV47和COV72的个体，血浆NT50值为297，10,433和3,138和3,138和3,138和3,138和3.138（3）。最后，具有IGHV和IgLV基因复发组合的抗体是最强的中和抗体之一，例如，抗体C002由IGHV3-30/IGKV1-39组成，并由两个供体共享，并由两个供体具有最强的血浆中和活性（图3B，4）。我们得出的结论是，即使具有适度血浆中和活性的个体也具有罕见的IgG记忆B细胞，可产生有效的SARS-COV-2中和抗体。 　　为了确定具有中和活性的人类抗SARS-COV-2单克隆抗体是否可以与RBD上的不同域结合，我们进行了双层干涉测量实验，其中预先形成的抗体抗体-RBD免疫复合物被暴露于第二个单克隆抗体。所测试的抗体包括三组，所有这些抗体在其结合特性与CR3022的结合特性不同，CR3022是一种中和SARS-COV并与SARS-COV-213,14结合的抗体。这三组中每一组的抗体包括：第1组中的C144和C101；第2组中的C121和C009；第3组中的C135。所有这些抗体都可以与先前用CR3022免疫复合的SARS-COV-2 RBD结合。第1组和第2组也与3组抗体的RBD免疫复合结合。该组1中的第1组和第2组不同，可以与第2组的RBD免疫复杂结合，但反之亦然（图4F – N）。我们得出结论，类似于SARS-COV，SARS-COV-2的RBD上有多个不同的中和表位。 　　为了进一步定义第1组和2组抗体的结合特性，我们使用C002（第1组，IGHV3–30/IgKV1-39抗体，使用负污渍电子显微镜检查对SARS-COV-2 S-FAB复合物成像，在两个供体中均在两个供体中扩展），C119和C121和C121（图10）（图10）。与RBD的构象柔韧性一致，二维类平均均显示两组的占用和方向的异质性（图4O – Q）。负染色电子显微镜重建的低分辨率排除了详细的结合解释。但是，结果与两组能够识别RBD的“上升”和“向下”状态的FAB一致，如先前针对该表位15,16的某些抗体所述。三维重建也与竞争测量值一致，这些竞争测量表明，组1和2组抗体与RBD表位结合，与由抗体CR3022结合的表位不同（图4F-N）和单个晶状体冷冻的冷冻素质微量镜检查C105 – S COFFFFERS17。此外，结构表明抗体以不同的方法角度结合RBD。组1抗体的接近角度与SARS-COV抗体S23018的接近角度更相似（图4R）。 　　通过单细胞抗体克隆从自然感染的个体中获得了对从病毒到寄生虫的病原体中和活性中和活性的人类单克隆抗体。已证明几种抗体可有效地保护和治疗模型生物体和早期临床研究，但目前只有一种抗病毒单克隆抗体在临床使用中有效19。抗体比小分子药物相对昂贵，更难生产。但是，它们与药物有所不同，因为它们可以通过与宿主免疫细胞上的FC伽马受体结合的恒定结构域吸引宿主免疫系统20。这些相互作用可以增强免疫力并有助于清除病原体或感染细胞。但是，它们还可以导致登革热病毒21和可能冠状病毒22感染期间疾病增强。这个问题阻碍了登革热病毒疫苗的发展，但不会干扰有效的中和中和抗体的临床使用，这些抗体可以被修饰以防止与FC伽马受体相互作用，并且仍然可以保护病毒病原体23。 　　抗体是大多数疫苗的重要元素，可能是针对SARS-COV-224,25,26的有效疫苗的关键组成部分。在其他传染病和疫苗反应中已经观察到复发性抗体11,27,28,29,30。在大多数康复中，血浆中和活性低的观察结果可以在具有强有力的中和活性的抗SARS-COV-2 RBD抗体中发现，在中和血浆中和活性的个体中表明，人类本质上能够产生抗RBD抗体产生抗RBD抗体，这些抗体具有强烈中性中性中性sARS SARS-SARS-SARS-COV-COV-2。因此，有选择地有效诱导靶向SARS-COV-2 RBD的抗体的疫苗可能特别有效。