PP2A的冷冻EM结构：B55 – FAM122A和PP2A：B55 – ARPP19

　　PP2Aa9–589, FAM122A1–124 (FAM122ANterm), FAM122A29–120 (FAM122AID), FAM122A67–120, ARPP19, ARPP19S104A, ARPP1919–75 and p107612–687 were subcloned into pTHMT containing an N-terminal His6-tag followed by麦芽糖结合蛋白（MBP）和烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶裂解位点。为了表达，将质粒DNA转化为大肠杆菌BL21（DE3）RIL或BL21（DE3）细胞（Agilent）。在含有卡纳霉素抗生素（50 µg mL -1）的LB肉汤中，在37°C下生长新鲜转化的细胞，直到它们达到〜0.8的光密度（OD600）。通过在培养基中添加1mMβ-硫代乙型甲糖苷（IPTG）来诱导蛋白质表达，并在18°C下允许培养物生长过夜（18-20 h，250 rpm摇动）。通过离心（8,000g，15分钟，4°C）收集细胞，并在-80°C下储存直至纯化。通过在含有4 g L-1 [13C]的M9最小培养基中生长新鲜转化的细胞 - 葡萄糖和/或1 g L-1 15NH4CL（剑桥同位素实验室），作为唯一的碳和硝酸盐来源，通过生长新鲜转化的细胞在M9最小培养基中生长新鲜转化的细胞来进行均匀的13C和/或15N标记蛋白的表达。FAM122AID variants E92K, R105L, V107G, S120C, E104A/S120C, E106A/S120C, R84A/L85A/S120C, I88A/K89A/S120C, E91K/S120C, E92K/S120C, FAM67-120S120C and ARPP19/S10C were由位置定向的诱变产生，如上所述对序列进行了验证和表达。 　　从Thermofisher（A14527）获得EXPI293F细胞，并在HEK293细胞完整培养基（SMM293-TII，SINO生物学M293TII）中生长。对于B55和PP2AC构建体的瞬时过表达，使用聚乙烯（PEI）转染试剂转染细胞。对于蛋白质印迹和免疫沉淀研究，通过在冰冷的裂解缓冲液中裂解细胞（20 mm Tris pH 8.0，500 mm NaCl，0.5 mm TCEP，1 mm MM MNCL2，1.1％Triton X-100，通过磷酸酶抑制剂（Themerofisher），themofisher（sheplofisher），themofisher（theplofisher），themofisher（theplofisher），themofisher（theplofisher），themofisher（theplofisher），制备全细胞提取物。在4°C。使用Pierce 660蛋白质测定试剂（Thermofisher）测量总蛋白质浓度。 　　将全长B551–477克隆到PCDNA3.4中，包括N末端绿色荧光蛋白（GFP），然后是TEV裂解序列。将全长PP2AC1–309克隆到PCDNA3.4中，带有N末端链球菌标签，然后是TEV裂解序列。B55无环（B55LL），其中将直接与PP2AA相互作用的B55残基126-164拆除并用单个NG接头替换（图1B）（图1B），用N末端GFP克隆到PCDNA3.4中，然后用N-末端GFP将其克隆到TEV裂解序列。使用核对Xtra Maxi Plus EF（Macherey-Nagel）扩增所有质粒并纯化。B55WT和B55LL在expi293f细胞（热燃料）中单独表达。B551–477和PP2AC1–309以1：2的DNA比共表达。 　　根据制造商在37°C的孵化器中，在37°C的孵化器中，在2 L烧瓶中，在500 mL培养基（SMM293-TII，SINO生物学）中进行转染在2 L烧瓶中进行转染。在转染当天，使用新鲜的SMM293-TII表达培养基将细胞密度调节至每毫升2.8×106个细胞。将PP2AC和B55（2：1比）的DNA稀释在Opti-MEM还原的血清培养基（热泡）中。同样，在单独的管中，将PEI（3×DNA量）在相同体积的Opti-MEM还原的血清培养基（Thermofisher）中稀释。将DNA和PEI混合物组合在一起，并在室温下孵育10分钟，然后加入细胞培养。转染后4 h和转染无菌过滤的葡萄糖（每500 ml细胞培养物为4.5 ml，45％，葡萄糖储备）后，将丙戊酸（2.2 mM终浓度，Sigma）添加到细胞中，将其添加到细胞培养瓶中，以增强蛋白质的产生。通过离心转染后48小时收集细胞（2,000g持续20分钟，4°C），并存储在-80°C下。 　　表达FAM122ANTERM，FAM122AID和FAM67-120和变体的细胞颗粒恢复在冰冷的裂解缓冲液中（50 mm Tris pH 8.0，500 mm NaCl，5 mm咪唑，5 mm咪唑，0.1％Triton X-100C3）。通过离心（42,000g，45分钟，4°C）对细胞碎屑进行沉淀，并用0.22 µm的注射器过滤器（Millipore）过滤上清液。将蛋白质加载到用缓冲液A（50毫米Tris pH 8.0，500 mm NaCl，5 mm咪唑）的Histrap HP柱（Cytiva）上，并使用线性梯度（0-60％）用缓冲液B（500 mm Tris pH 8.0，500 mm nacl nacl ancl ancl ancl ancl anc）洗脱。将含有蛋白质的馏分汇总，并用TEV蛋白酶（在内部； His6标记）在4°C下透析过夜，以裂解His6 -MBP标签。裂解后，将样品（1）在重力下载到预先校准的Ni2+-nta珠（Prometheus）上，该珠（Prometheus）用缓冲液A进行了平衡，收集和洗涤A分数，然后进行两次热纯化（80°C，10分钟）或（2）或（2）两次纯化（80°C，10分钟）。将样品以15,000克离心10分钟，以去除沉淀的蛋白质。使用NMR缓冲液（20 mM Na2HPO4/NAH2PO4 pH 6.3，150 mm NaCl，0.5 mm TCEP），IC50分析缓冲液（IC50分析缓冲液）（20 mm naH2PO4 pH 6.3，20 mmMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM，荧光偏振测定缓冲液（20 mM Tris pH 7.0，150 mm NaCl，0.5 mM TCEP）。样品直接用于NMR数据收集或闪存冷冻，并存储在-80°C下。 　　该协议对于所有ARPP19构建体都是相同的。将细胞颗粒重悬于裂解缓冲液中（50 mM Tris-HCl PH 8.0，500 mM NaCl，5 mm咪唑，0.1％Triton X-100，无EDTA蛋白酶抑制剂（热泡（Thermofisher）），由高压细胞同质化（Avestin C3-- Emulsiflex），deberiflex debris pellbif biuget debriS peller（avestin cy），45分钟），将上清液用0.22 µm注射器过滤器（Millipore）过滤。将蛋白质加载到用缓冲液A（50 mm Tris pH 8.0，500 mm NaCl，5 mm咪唑）的Histrap HP柱（Cytiva）上，并使用线性梯度（0–60％）洗脱缓冲液（0-60％）的Buffer B（50 mm Tris pH 8.0，500 mm tris pH 8.0，500 mm nacl，500 mm nacl，500 mm nacl，500 mmmmmmmmmmmiDaz）。将包含蛋白质的馏分合并，并在4°C下用TEV蛋白酶在4°C下过夜，以裂解MBP和HIS6标签。将切割的蛋白与Ni2+-NTA树脂（Cytiva）孵育，并用缓冲液A洗涤。收集流经和洗涤的馏分，并通过在80°C下孵育样品20分钟来纯化热量。将样品以15,000克离心10分钟，以去除NMR缓冲液（20 mm Na2HPO4/NAH2PO4 pH 6.3，150 mm nacl，0.5 mm TCEP），IC50 ASSAY BUFFIFIS（20毫米TCEP）的NMR缓冲液中的SEC（SuperDex 75 26/60（Cytiva））浓缩和纯化，浓缩和纯化。0.5 mM TCEP）或荧光极化测定缓冲液（20 mM HEPES pH 7.0，150 mm NaCl，0.25 mm TCEP）。再次纯化纯化的样品（80°C 5分钟），以15,000g离心10分钟以去除任何沉淀的蛋白质，然后直接用于NMR数据收集或闪存冷冻并存储在-80°C下。 　　将表达PP2AA9-589的细胞颗粒重悬于冰冷的裂解缓冲液中（50 mm Tris pH 8.0，500 mm NaCl，5 mm咪唑，0.1％Triton X-100，EDTA无蛋白酶蛋白酶抑制剂抑制剂（Thermofisher）（Thermofisher）（热疗法器），高压式Cell Homegen homegen homegen homegen homegenation（AvesteStrife）（Avestrex）。通过离心（42,000g，45分钟，4°C）固定细胞碎片，并用0.22 µm的注射器过滤器过滤上清液。将蛋白质加载到用缓冲液A（50毫米Tris pH 8.0，500 mm NaCl，5 mm咪唑）的Histrap HP柱（Cytiva）上，并使用线性梯度（0至40％）用缓冲液B（50 mm Tris pH 8.0，500 mm nacl and Nacl and 500 mm nacl and 500 mmmmmmidaz）洗脱。Fractions containing the protein were pooled and dialysed overnight at 4 °C with TEV protease (in house; His6-tagged) to cleave the His6–MBP tag and loaded under gravity onto Ni2+-NTA beads (Prometheus) pre-equilibrated with buffer A. Flow through and wash A fractions were collected, concentrated and loaded onto QTrap HP column (Cytiva) for further purification.用100 mm – 1 m的盐梯度洗脱蛋白质（缓冲液A：20 mm Tris pH 8.0，100 mm NaCl，0.5 mm TCEP； Buffer B：20 mm Tris pH 8.0，1 M NaCl，0.5 mm TCEP）。在测定缓冲液（20 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，0.5 mM TCEP）中，使用SEC（SuperDex 200 26/60（Cytiva））浓缩PP2AA级分并进一步纯化。直接使用样品或闪存冷冻并存储在-80°C下。 　　如上所述，将EXPI293F单元用PCDNA5_FRT_TO_TO_TO_TO_TO_TO_TO_3XFLAG_MASTL转染。将表达MASTL的细胞颗粒重悬于冰冷的裂解缓冲液中（20 mM Tris pH 8.0，500 mm NaCl，0.5 mm TCEP，0.1％Triton X-100，无EDTA无蛋白酶抑制剂片剂（Thermofisher）），高压力细胞均通过高压力细胞植物化（高压细胞）的溶裂（Averiflexcin）。通过离心（42,000g，45分钟，4°C）对细胞碎屑进行沉淀，并用0.22 µm的注射器过滤器（Millipore）过滤上清液。将裂解液与抗FLAG M2珠（Sigma）一起孵育，并用洗涤缓冲液1（20 mm Tris pH 8.0，500 mm NaCl和0.5 mM TCEP）预取平衡，并在4°C缓慢摇动2小时。随后，用洗涤缓冲液（20 mM Tris pH 8.0、500 mM NaCl，0.5 mM TCEP，1 mM MNCL2）洗涤珠3次，并通过与150 ng µl -1 3×Flag肽（生物合成）孵育10分钟，从而洗脱结合的MASTL蛋白。将纯化的活性MASTL与10％甘油混合，并在-80°C下储存。 　　为了表达，将PKA（PET15B中的人Cα1）转化为大肠杆菌BL21（DE3）RIL细胞（Agilent）。新鲜转化的细胞在37°C的LB肉汤中生长，直到达到〜0.8的光密度（OD600）。通过在培养基中添加1mMβ-硫代乙型甲糖苷（IPTG）来诱导蛋白质表达，并在18°C下允许培养物生长过夜（18-20 h，250 rpm摇动）。通过离心（8,000g，15分钟，4°C）收集细胞，并在-80°C下储存直至纯化。为了纯化，将细胞颗粒重悬于冰冷的裂解缓冲液中（50 mM Tris pH 8.0，500 mM NaCl，5 mM咪唑，0.1％Triton X-100，无EDTA无蛋白酶抑制剂（Thermofisher）和高压力的细胞同质化（Avestin Emuls emuls emuls emulsiflex C3）。通过离心（42,000g，45分钟，4°C）对细胞碎屑进行沉淀，并用0.22 µm的注射器过滤器（Millipore）过滤上清液。将蛋白质加载到用缓冲液A（50毫米Tris pH 8.0，500 mm NaCl，5 mm咪唑）的Histrap HP柱（Cytiva）上，并使用线性梯度（0-80％）用缓冲液B（500毫米Tris pH 8.0，500 mm nacl，500 mm nacl，500 mm nacl，500 mm imiDaz）洗脱。将含有蛋白质的馏分聚合并在4°C下的缓冲液（20 mm Tris pH 8，50 mm NaCl，1 mm EDTA，2 mM DTT）中透析过夜。将纯化的样品以15,000克离心10分钟，以去除沉淀的蛋白质。将上清液样品与50％甘油混合，并在-80°C下储存。 　　将纯化的15N标记-ARPP1（25μM）与PKA或MASTL激酶（10：1比）在磷酸化缓冲液（100 mM Tris pH 7.5，2 mm DTT，10 mm MGCL2，10 mm MGCL2）中孵育，用ATP-γ-S或ATP（Sigma）的500 µm的pHosphoration和500 µm的phosphoration和500 µm激酶反应在37°C下放置72-90 h。磷酸化的ARPP19通过在80°C下孵育10分钟来纯化热量。将样品以15,000克离心10分钟，以去除沉淀的激酶，并立即用于实验或闪存冷冻，并存储在-80°C下。通过使用2d 1H，15N HSQC光谱的磷酸化丝氨酸残基的化学位移变化证实了完全磷酸化。 　　通过孵育每种条件的总蛋白（〜500 µg），将GFP标记的B55或B55LL和相关的内源性蛋白与GFP-trap纳米型琼脂糖珠（使用Aminolink Plus inminolink Plus Immilization Kit; Thermofisher; Thermofisher; Thermofisher;在3次用洗涤缓冲液（20 mM Tris pH 8.0、500 mM NaCl，0.5 mM TCEP，1 mM MNCL2）洗涤后，用2％SDS样品缓冲液（90°C，10分钟）洗脱了结合的蛋白质，通过SDS-PAPPAGE（BIO-RAD）（BIO-RAD）解决了pvDFFembrane分析（访问蛋白酶），使用蛋白质分析（请访问）。纯化的PP2A：B55复合物用作阳性对照。使用Chemidoc MP成像系统（图像实验室触摸软件2.4; Bio-Rad）和使用ImageJ 1.53T51,52量化的抗体荧光信号捕获抗体荧光信号。 　　纯化的FAM122A和变体（约25 µg，在方法中，请参见“ FAM122A纯化”中的制备）与表达B55，PP2AC构建体和纯化的PP2AA的Expi293f全细胞提取物混合。在与琼脂糖珠一起孵育之前收集输入样品。通过与GFP-trap纳米型琼脂糖珠（如“ EGFP-Nanobody蛋白表达，纯化”，Purification，Purification，Purification，Purification，Purification，Purification，Purification，Purification，Purification，Purification，Purification，Purification，Purification，purification，purofienation，upotiages制备的每种条件下，每种条件的总蛋白（约500 µg）通过孵育相等量的总蛋白（约500 µg）来捕获GFP标记的B55和相关蛋白。在3次用洗涤缓冲液（20毫米Tris pH 8.0、500 mM NaCl，0.5 mM TCEP，1 mM MNCL2）洗涤后，用2％SDS样品缓冲液（90°C，10分钟）洗脱了结合的蛋白抗B55（2290 S，1：1,000），抗PPP2AC（MABE1783，1：1,000），山羊抗Rabbi IgG，（12005869，1：3,000）和山羊抗小鼠IgG（12004158，1：3,000）。使用Chemidoc MP成像系统（Image Lab Touch Software 2.4; Bio-Rad）捕获抗体荧光信号，并使用ImageJ 1.53T量化频带强度。图2中示出了无编工印迹。 　　纯化的FAM122ANTERM（〜25 µg）和S62 TPARPP1104A（〜25 µg或125 µg，请参见单独的“方法中Arppp19的磷酸化”中的制备）或将表达B55的全细胞提取物与Expi293F全细胞提取物混合在一起，以表达B55，PP2AC构造，PP2AC构造和PP2AA。在与琼脂糖珠一起孵育之前收集输入样品。通过与GFP-trap纳米型琼脂糖珠（使用Aminolink Plus固定化试剂盒; Thermofisher制备）在4°C下，每种条件与GFP-trap纳米型琼脂糖珠一起孵育相等量的总蛋白（500 µg），从而捕获GFP标记的B55和相关蛋白。在3次用洗涤缓冲液（20毫米Tris pH 8.0、500 mM NaCl，0.5 mM TCEP，1 mM MNCL2）洗涤后，用2％SDS样品缓冲液（90°C，10分钟）洗脱了结合的蛋白抗FAM122A（MA5-24510，1：1,000），抗ARPP19（ProteIntech，11678-1-AP，1：1,000）。使用Chemidoc MP成像系统（Image Lab Touch Software 2.4; Bio-Rad）和使用ImageJ 1.53T量化的带强度捕获抗体荧光信号。补充图2中所示的未编写印迹。 　　对于碱性处理，将100μLPP2A：从阴离子交换的B55三重复合部分与NaOH混合，最终浓度为0.2 m，并在室温下孵育10分钟。通过将HCl添加到最终浓度为0.2 m，并用裂解缓冲液稀释至200μL，将反应中和。用中和溶液（0.2 M NaOH和0.2 M HCl）处理对照反应，并用裂解缓冲液稀释至200μL。将样品用2％SDS样品缓冲液（90°C，10分钟）煮沸，通过SDS-PAGE（BIO-RAD）解决，并转移到PVDF膜上进行蛋白质印迹分析，使用所示抗体（请参阅报告摘要）抗PPP2AC（MABE1783，1,000），抗PPP2AC甲基甲基甲基甲基甲基（828）。使用Chemidoc MP成像系统（Image Lab Touch Software 2.4; Bio-Rad）和使用ImageJ 1.53T量化的带强度捕获抗体荧光信号。补充图1中所示的未编写印迹。 　　为了表达，将Popin-EGFP-Nanobody质粒DNA（来自M. Bollen的礼物）转化为大肠杆菌BL21（DE3）细胞（Agilent）。在含有氨苄青霉素抗生素（50 µg mL -1）的LB肉汤中，在37°C下生长新鲜转化的细胞，直到它们达到〜0.8的光密度（OD600）。通过在培养基中添加0.5mMβ-甲状腺乳糖苷（IPTG）来诱导蛋白质表达，并允许培养物在18°C的一夜之间生长（18-20 h，250 rpm摇动）。通过离心（8,000g，15分钟，4°C）收集细胞，并在-80°C下储存直至纯化。将表达EGFP - 纳米病的细胞沉淀重悬于冰冷的裂解缓冲液中（50 mm Tris pH 8.0，500 mm NaCl，5 mm咪唑，0.1％Triton X-100，EDTA无蛋白酶抑制剂抑制剂（Thermofisher）（热疗法），高压蛋白蛋白酶抑制剂（Thermofisher），高压单元格式溶剂化（通过高压单元）裂解。通过离心（42,000g，45分钟，4°C）固定细胞碎片，并用0.22 µm的注射器过滤器过滤上清液。将蛋白质加载到用缓冲液A（50 mm Tris pH 8.0，500 mm NaCl，5 mm NaCl，5 mm咪唑）的Histrap HP柱（Cytiva）上，并使用线性梯度（0–60％B）用缓冲液B（500 mm Tris pH 8.0，500 mm nacl和500 mm nacl and 500 mm nacl and 500毫米）洗脱。在PBS pH 7.5缓冲液中，使用SEC（SuperDex 75 26/60（Cytiva））将含有蛋白质的分数合并，浓缩并在室温下进一步纯化。按照制造商在PBS pH 7.5偶联缓冲液中的说明之后，使用Aminolink加上固定化套件（Thermofisher）将纯化和浓缩的EGFP纳米蛋白固定在琼脂糖珠（每列20 mg蛋白）上。 　　Pellets of Expi293F cells expressing eGFP–B55 or eGFP–B55LL were resuspended in ice-cold lysis buffer (20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 0.1% Triton X-100, EDTA-free protease inhibitor tablet (ThermoFisher)), lysed by high-pressure cell homogenization (Avestin乳液C3）。通过离心（42,000g，45分钟，4°C）固定细胞碎片，并用0.22 µm的注射器过滤器过滤上清液。将裂解物与GFP - 纳米偶联琼脂糖珠混合（请参阅“ EGFP - 纳米型蛋白的表达，纯化和固定在方法中”中的制备），用洗涤缓冲液进行预校准，用洗涤液1（20 mm tris pH 8.0，500 mm nacl and Nacl and 0.5 at at At 4 ccep），并缓慢地ccep）。2小时后，将裂解物孔混合物加载到重力柱上，收集通过（FT1）的流量，并用25 mL洗涤缓冲液洗涤3次（洗涤1-3）。将GFP – B55树脂重悬于20 mM Tris pH 8.0、250 mm NaCl和0.5 mM TCEP中，并在4°C下添加TEV以进行柱面上的裂解。再次收集流通（FT2），并用20 ml洗涤缓冲液2（20 mM Tris pH 8.0、250 mm NaCl和0.5 mM TCEP； Wash 4）和2×20 mL洗涤树脂，并用洗涤缓冲液1（洗涤5和6）。收集流经2（FT2）和洗涤4-6的流量，稀释至〜100 mm盐浓度（用0 mm NaCl洗涤缓冲液），并加载到QTRAP HP柱（Cytiva）上，以进一步纯化。用100 mm – 1 m的盐梯度洗脱蛋白质（缓冲液A：20 mm Tris pH 8.0，100 mm NaCl，0.5 mm TCEP； Buffer B：20 mm Tris pH 8.0，1 M NaCl，0.5 mm TCEP）。将B55或B55LL浓缩并使用NMR缓冲液（20 mm Na2HPO4/NAH2PO4 pH 6.3，150 mm NaCl，0.5 mm tceP）或0.5 mm TCEP）或ASSAY PH 8.0 pH 8.0 pH 8.0，150 mm nacl，0.5 mm nacl，0.5毫升，进一步纯化了NMR缓冲液中的SEC（SuperDex 200 26/60（Cytiva））。 　　Expi293F cell pellets expressing StrepII–PP2Ac and eGFP–B55 constructs were resuspended in ice-cold lysis buffer (20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 1 mM MnCl2, 0.1% Triton X-100, EDTA-free protease inhibitor tablet (ThermoFisher)), lysed by high-pressure cell均质化（Avestin乳液C3）。将纯化的PP2AA添加到细胞裂解物中。通过离心（42,000g，45分钟，4°C）固定细胞碎片，并用0.22 µm的注射器过滤器过滤上清液。Lysates were loaded onto a GFP–nanobody-coupled agarose bead (see preparation in ‘eGFP–nanobody protein expression, purification, and immobilization onto agarose beads’ in Methods) column, pre-equilibrated with wash buffer 1 (20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM MnCl2 and 0.5 mM TCEP) and slowly rocked at4°C 2小时。2小时后，收集通过（FT1）的流量，并用25 mL洗涤缓冲液洗涤3次（洗涤1-3）。将GFP – B55树脂重悬于20 mM Tris pH 8.0、250 mm NaCl，1 mM MNCL2和0.5 mM TCEP中，并在4°C下添加TEV以进行柱面裂解过夜。再次收集流通（FT2），并用20 mL洗涤缓冲液2（20 mM Tris pH 8.0、250 mm NaCl，1 mM MNCL2和0.5 mM TCEP）（WASH 4）和2×20 mL洗涤液缓冲液1（洗涤缓冲液1（洗涤5和6））。收集流经2（FT2）和洗涤4-6的流量，稀释至〜100 mm盐浓度（用0 mm NaCl洗涤缓冲液），并加载到单Q柱（Cytiva）上，以进一步纯化。用100 mm – 1 m的盐梯度洗脱蛋白质（缓冲液A：20 mm Tris pH 8.0、100 mm NaCl，1 mM MMNCL2和0.5 mM TCEP； Buffer B：20 mm Tris pH 8.0，1 M NaCl，1 mM NaCl，1 mm MM MNCL2和0.5 mm TCEP）。PP2A：NMR缓冲液（20 mm Na2HPO4/NAH2PO4 pH 6.3，150 mm NaCl和0.5 mm TCEP）和0.5 mm TCEP或ASSAY BUFFER（20 mmMMMMMMMMMMMMMMMM MMMM MM，MM MM MM MM MM MM MM，MM NMR缓冲液（20 mM Na2HPO4/NAH2PO4）中，使用SEC（SuperDex 200 26/60（Cytiva））汇总，浓缩并进一步纯化B55复合物和B55级分。0.5 mm TCEP）。 　　PP2A：B55 – FAM122A复合物是通过纯化PP2A：B55并以1.5摩尔比为PP2A：B55与FAM122AID以1.2 mg ML -1的总浓度孵育。PP2A：B55 – TPARPP19复合物是通过纯化PP2A：B55制备的，并以1.5摩尔比的PP2A：B55与TPARPP19的总浓度为2.4 mg ml -1。在印迹和玻璃化之前（Vitrobot MK IV，18°C，100％相对湿度，印迹时间5 s），Chapso（3--（[3-胆碱丙基] Dimethylamonio）-2-Hydroxy-1-羟基-1-磺酸盐），将其添加到最终浓度为0.075％（W/V）的最终浓度（W/V）PP2A的0.125％（w/v）：B55 – TPARPP19。将3.5μl的样品应用于排放的新鲜发光的Ultaufoil 1.2/1.3 300网格网格，覆盖5 s，并浸入液态乙烷中。使用配备了Gatan Bioquantum K3 Energy滤波器和以CDS模式运行的摄像机进行成像进行成像。补充表1中给出了采集和成像参数。所有数据处理步骤均使用Relion 4.053进行，并在扩展数据图2中进行了总结。6–8。对于两个数据集，都将显微照片电影求和并加权剂量。使用CTFFIND 4.1.1454在电影框架平均功率谱（〜4EÅ-2剂量）上估算对比传递函数（CTF）参数。对显微照片进行过滤以删除运动校正和/或CTF估计结果的异常值，并手动筛选以删除具有严重非维特尔冰污染的显微照片。使用Topaz55使用在显微照片的随机子集上训练的模型，选择了整个显微照片集中的潜在粒子位置。训练子集上的颗粒是通过对先前筛选数据训练的黄玉模型选择的。将子集选择进行2D分类，Ab Initio 3D初始型号生成和3D分类，以及用于训练用于选择完整显微照片集的改进的TOPAZ模型的幸存粒子。从这些选择中， 2D分类和3D分类（带有全角和翻译搜索）用于在类中选择粒子，显示清晰的二级结构并代表完整的复合体。Resolution in both datasets was then further improved by cycles of CTF parameter refinement, particle polishing, and fixed-pose 3D classification, alongside the following elaborations: For PP2A:B55–tpARPP19, particles with well-resolved ARPP19 density were selected by isolating ARPP19 via signal subtraction of the vast majority of the holoenzyme, followed by fixed-pose 3D classification;在处理工作流程的过程中，该过程进行了两次。最终地图从52,934个颗粒到分辨率为2.77Å。对于PP2A：B55 – FAM122A，需要对复合物的B55和PP2AC段的多体细化来解决这两个段的细节。在每个结果的身体对齐中，FAM122A的信号减法和固定置置3D分类及其周围的结合凹槽用于选择多体细化成功的颗粒，并且存在FAM122A，并且存在良好的水平。这产生了103,522个颗粒，这在两个身体中都是正确的。使用这些颗粒，使用第二个多体细化来生成在每个身体内建造模型的地图，最终分辨率为B55身体2.55Å，PP2AC身体的最终分辨率为2.69Å。为了生成共识图，仅使用来自多体型细化的最小平方特征值的前25,000个颗粒进行完善（如Relion_flex_analyse报道）。这两个数据集的所有3D自动翻新都使用了软溶剂掩码和侧面填充56。这项工作中报告的所有全局地图分辨率均通过金标准半图傅立叶壳相关（FSC）= 0.143公吨计算。进一步的验证信息在扩展数据图2中给出。6–8和补充表1。 　　所有模型均通过在COOT57和ISOLDE58中的手动重建和改进之间进行迭代以及在Phenix59中自动化的全球真实空间改进来构建和完善。对于PP2A：B55 – FAM122A，使用先前确定的晶体PP2A：B55 Holoenzyme Crystal结构（PDB ID 3DW8）内置了B55和PP2AC车身图中的相关段，并将其内置。然后将两个车身模型连接在一起，并进一步重建关节附近的区域，并针对25,000个粒子共识子集图进行了完善。对于PP2A：B55 – TPARPP19，PP2A的全酶部分：B55-FAM122A模型和可用的ARPP19 Alphafold模型（Uniprot P56211）用作起点。在补充表1中给出了模型的几何形状和MAP - 模型验证指标。 　　磷酸酶活性测定在96个井板（Corning）中进行。PP2A：将B55全酶稀释至所需浓度范围（0至20 nm）（30 mm HEPES pH 7.0，150 mm NaCl，1 mm MM MNCL2，1 mm MM MNCL2，1 mm DTT，0.01％Triton X-100，0.1 mg x-100，0.1 mg mg ml-1 bsa）和30°C.该反应是通过将6,8-二氟4-甲基细胞磷酸盐（DIFMUP）添加到最终浓度为50μm的情况下开始。每15秒钟读取约50分钟的ClarioStarplus（BMG LabTech）读取器（使用Reader Control Softwarev。5.7R2），并使用GraphPad Prism 9.5评估数据。 　　在384孔板中进行了基于DIFMUP的IC50分析（Corning，4411）。对于ARPP19和FAM122A IC50分析，PP2A：酶缓冲液中的B55全酶（30毫米HEPES pH 7.0，150 mm NaCl，1 mm MM MNCL2，1 mm MM DTT，1 mm DTT，0.01％Triton X-100，0.1 mg ml-1 bspp predation2 and ins2 and-instrations2 and-instrations 2 and-instrations 2 and-instrations 2在室温下30分钟（扩展数据图2）。通过将DIFMUP（最终浓度为50μm）添加到PP2A中开始反应：B55-FAM122A酶促反应（PP2A的最终浓度：B55 Holoenzyme在1 nm处），然后在30°C孵育30分钟。通过添加300 mM磷酸盐（pH 10），在反应停止反应后停止反应后，在ClarioStarplus（BMG LabTech）读取器（使用读取器控制软件5.7 R2）上对终点读数（激发360 nm，发射450 nm）进行。实验是独立重复≥3次的（在n = 3至6中进行的），并进行平均IC50和S.D。报告了值。使用GraphPad Prism 9.5评估数据。 　　遵循制造商的说明，使用1:10蛋白质与荧光园的比例将100 µM的FAM122AID（S120C）（S120C）（或变体）或ARPP19（S10C）标记为Alexa Fluor 488 C5 MaleImide（Thermofisher）。将混合物在室温下在pH 7.0的室温下在黑暗中孵育2小时，并添加过量的β-甲醇乙醇（1.2×荧光团浓度）添加以使任何未反应的未反应的Alexa荧光488。标记的FAM122AID（S120C）（S120C）（S120C）（OR variants）或Arpp19（S10C）（S10C）（S10C）已恢复（S10C）（S10C）已恢复（S10C）。（Cytiva）），用于荧光极化测定。以下称为FAM122AID（S120C）（或变体）或ARPP19（S10C），以下称为FAM122AID-Tracer或ARPP19-Tracer。 　　使用黑色384孔低体积圆底微板（Corning，4411）用15 µL溶液的荧光极化测定标准化。使用ClarioStarplus（BMG Labtech Inc）微孔板读取器（使用读取器控制软件5.7 R2版）进行测量，该测量器的设置高达482±16 nm激发，530±40 nm的发射，二甲状腺长度通过504 nm，在380-497 nm和508之间进行反射范围范围内的504 nm，并在380 – 497 nm之间进行反射范围。对于解离常数（KD）结合测量值，将所有稀释液用于荧光极化缓冲液（10 mM HEPES pH 7.0，150 mM NaCl，0.5 mM TCEP，0.01％Triton X-100，0.1 mg 0.1 mg Mg ML-1 BSA）。制备了0.3 nm的FAM122AID跟踪/ARPP1-Tracer的偏见，并以最终浓度的3倍进行PP2A：B55的连续稀释。将FAM122AID-TRACER/ARPP1-TRACER，5 µL串行稀释的PP2A：B55复合物和5 µL荧光极化缓冲液分布到384孔微磷酸盐中，导致FAM122AID-TRACER或ARPPPERERPERPRACERERACERARACERACERACERARP19-FINS，将五个微透明。将所有测定实验重复一式三份重复，并在黑暗中孵育30分钟，并在阅读前在室温下密封。实验独立重复≥3次，平均KD和S.D.报告了值。使用GraphPad Prism 9.5评估数据。 　　编码各种ARPP19序列的合成DNA购自Geneart，Life Technologies，并将其克隆到PCDNA5/FRT/TO（Invitrogen）表达载体中，含有YFP，从而导致YFP -ARPP19融合蛋白。在收集细胞之前，将这些构建体瞬时转染到HeLa细胞中。将细胞裂解在裂解缓冲液中（50 mM Tris-HCl pH 7.5、50 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT和0.1％NP40）。如制造商所述，将复合物在4°C的裂解缓冲液中以裂解缓冲液（Chromotek）珠进行免疫沉淀。将沉淀的蛋白质复合物在裂解缓冲液中洗涤3次，在2×SDS样品缓冲液中洗脱，并使用以下抗体进行蛋白质印迹：YFP（1：5,000;在内部产生），B55α（1：2,000; 5689; 5689s; 5689s，细胞信号技术），PP2AC（1：2,000; 2,000; 05-421; 05-421; 05-421，MILLIPORE）。图1的补充图显示。 　　所有NMR数据均在Bruker Avance NEO 600 MHz或800 MHz NMR光谱仪上，配备了TCI HCN Z-GradAdient Cryope，位于283 K.（15n，13c）的FAM1222ANTEMP（150 µm）（150 µm），（15n，13c）-labell fam fam fam fam122antem（150 µm）（15N，13C）标签ARPP19（400 µM）和（15N，13C）标签的PS62PS104ARPP19（200 µM）在FAM122A或ARPP19 NMR缓冲液中以5-10％（V/V）D2O立即添加到数据收购之前，在FAM122A或ARPP19 NMR缓冲液中制备。通过记录异核NMR光谱套件来确定两种蛋白的序列特异性主链分配：2d 1h，15n HSQC，3D HNCA，3D HN（CO）CA，3D HNCACB，3D HNCACB，3D CBCA（3D CBCA）（CO）收集用于FAM122AID（TM = 12 ms）61。在Topspin（Bruker Topspin 4.1.3）中处理光谱，并参考了内部DSS。 　　使用CARA 1.9.1（http://www.cara.nmr.ch）进行峰采摘和序列特异性主链分配。FAM122ANTERM，FAM122AID，ARPP19和PS62PS104ARPP19的CSI计算使用每种指定的氨基酸的Cα和Cβ化学移位进行了计算，该氨基酸省略了REDDB数据库62。使用七个残基的加权平均值来计算二级结构倾向（SSP）得分，以最大程度地减少残基的化学位移的贡献，而残基的化学移位是二级结构的量度较差的量。63。根据最近的邻居分析，可以追溯不同FAM122A或ARPP19构建体或变体之间峰位置的变化。使用以下公式计算化学位移差异（∆δ）： 　　使用Bruker NEO 600 MHz NMR光谱仪记录了FAM122ANTERM/ID，ARPP19或PP2A或B55LL的所有NMR相互作用数据，ARPP19或PS62PS104ARPP19与PP2A：B55或B55LL记录，配备了配备了HCN TCI Z-gradient Z-Gradient Cryope在283 k.283 k.Ar fam12222222的Neo 600 MHz NMR频谱计。使用NMR缓冲液中的15N标记蛋白和90％H2O/10％D2O记录PS62PS104ARPP19。对于每种相互作用，未标记的B55LL的PP2A：B55复合物（最低25％盈余比）被添加到正在研究的15N标记的FAM122A或ARPP19构建体中，并在收集2d 1H，15N HSQC Spectrum之前在冰上孵育10分钟。FAM122A和ARPP19浓度范围为2-6μm。使用NMRPIPE64处理NMR数据，并在Poky65中分析了强度数据。将每个数据集归一化为最强烈的峰值，每个免费2d 1H，15n HSQC Spectrum FAM122A或ARPPP19残基与其相应的峰进行比较，如果存在，则在2d 1h，15n，15n HSQC FAM122A或ARPP19的频谱上与B55LL或PP2A：B55LL或PP2A：B55。为此分析省略了任何重叠峰。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。