单细胞脑器官筛查确定自闭症的发育缺陷

　　将无馈物HES细胞或IPS细胞培养在HES细胞限定的Matrigel（Corning，CatalogNo。354277）的涂层板上，涂有含有牛血清白蛋白（BSA）的必需8干细胞培养基。H9胚胎干细胞是从Wicell获得的。将细胞保持在37°C的5％CO2孵化器中。使用简短的串联重复测定对所有细胞系进行身份验证，并使用单核苷酸多态性（SNP）阵列基因分型测试了基因组完整性，并常规地测试了对支原体的阴性。 　　使用先前发表的具有修饰的协议生成脑器官23。简而言之，将细胞培养至70-80％汇合，在150μl必需的8培养基中培养16,000个活细胞，并在每个孔中添加添加了Revitacell（Thermofisher，EtatalogNo。A2644501）的ubottom Ultralow附件的每个孔中，将其添加到每个孔中96孔板（Cornogno。Cls343473），将其添加到Ubottom Ultralow附件的每个孔中。对于ECAS9诱导，在第5天以0.3μgml-1的浓度添加了4-羟基莫昔芬（Sigma-Aldrich，CatalogNo。H7904）。神经诱导是在第6天开始的。基于形态检查，将胚胎体嵌入在Matrigel（Corning，CatalogNo。3524234）中。从第13天到第16天，将CHIR99021（Merck，CatalogNo。361571）添加为3μm，并将培养基切换到补充了B27负维生素A（IDM-A）的改进的分化培养基。在第14天，第25天，在第25天，培养基在B27 Plusevai Mediep上进行了改进，以改善B27 Pluseade介质，并补充了B27 Plusemin a（IDM+a）（IDM+a）（IDM+a）；1% dissolved Matrigel was added to the medium from day 40 to day 90. From day 60 to day 70, medium was gradually switched to Brainphys neuronal medium (Stemcell Technologies, catalogue no. 05790) and supplemented with brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (20 ng ml−1; Stemcell Technologies, catalogue no. 78005.3), glial cell线来衍生的神经营养因子（GDNF）（20 mg ML-1; Stemcell Technologies，目录No。78058.3）和Bucladesine钠（1 mM; Medchemexpress，目录NO。HY-B0764）24。对于腹化器官，我们遵循了先前发表的协议47。胚胎没有嵌入胚胎，包括100 nm SAG（Merck-Millipore，CatalogNo。US1566660）和2.5μMIWP2（Sigma-Aldrich，CatalogNo。IO536），包括100 nm SAG（Merck-MilliporeNo。US.US1566660）。 　　首先使用多层维也纳生物活性CRISPR（VBC）得分54选择了前四个SGRNA，然后对报告编辑效率进行测试编辑效率。使用壁虎克隆协议55将SGRNA克隆到GRNA报告基因测定器慢病毒构建体中（包含双Sgrna盒：U6-SGRNA1-SGRNA2）。使用IIS类类限制酶克隆这两个SGRNA FastDigest BPII（Thermofisher，CatalogNo。FD1014）和ESP3I（Thermofisher，目录NO。FD0454），并使用Sanger测序进行了验证。所有用于本研究的GRNA都可以在补充表1中找到。 　　使用Gibson组装组装RSV启动子下的DTOMATO-2A-GRNA目标阵列阵列阵列阵列阵列阵列阵列阵列。使用基于磷酸钙的转染方法，使用铂-E逆转录病毒包装细胞系将构建体包装到逆转录病毒中。含病毒的上清液（Dulbecco修饰的Eagle的培养基（DMEM），10％胎牛血清（FBS），2 mM-谷氨酰胺，100 U ML-1青霉素和0.1 mg-1 Penicillin和0.1 mg ML-1链霉素）通过高达72 h，然后通过0.45-uce收集了72小时，然后通过0.45-μm进行过滤。然后使用逆转录病毒感染NIH-​​3T3细胞，并使用流式细胞仪将DTOMATO阳性细胞分类为单个细胞以建立报告基因细胞系。为了提供SGRNA，使用HEK293细胞包装了驱动ECAS9的慢性病毒构建体和脾脏焦点形成病毒（SFFV）启动子启动子，以产生慢病毒。将上述生成的报告基因3T3细胞系在六孔板中培养，并用含有双Sgrna盒的慢病毒感染，这些盒子单独靶向每个基因。在感染后7、14和20天测量BFP荧光。感染后20天时的荧光变化用于评估GRNA编辑效率。总共测试了98个双重SGRNA盒的36个基因。 　　选择慢病毒载体是基于先前发表的慢病毒矢量构建的，该向量载有CAG驱动ERT2-CRE-ERT2-P2A-EGFP-P2A-P2A-PURO CASSETTE12。根据Crop-Seq Vector Design17，将包括NHEI和SGSI识别序列在内的多隆站点引入了慢病毒主链的3'LTR。然后，除去了原始的U6 sgrna表达盒。取而代之的是，将双Sgrna（U6-SgrNA1-H1-SGRNA2）盒引入3'LTR克隆位点。为了生成条形码库，使用以下引物分别放大（8-10个周期，使用定量聚合酶链反应（QPCR）机器监测，在伸向对数相位盒的每个双sgrna Cassette时停止了从记者构造中使用的每个双Sgrna盒），同时介绍了一个在记者的构造中。 　　FW底漆：5'-TCGACCGCTAGGGGGCCTATTTCCATGA-3'。 　　RV底漆：5'-cagtagggcgcgcgccnvdnhbnvdnhbnvdccggcggcgacgaaccatgatcaaa-3'。 　　合并了ASD库（36个配对的SGRNA靶向ASD基因）或对照库（配对的非靶向对照GRNA）的摩尔量相等的扩增子。然后用FastDigest NHEI（Thermofisher，CatalogNo。FD0973）和FastDigest SGSI（Thermofisher，CatalogNO。FD1894）和凝胶纯化，然后用FastDigest NHEI（Thermofisher，CatalogNO。FD0973）消化扩增子和慢病毒主链。使用T4 DNA连接酶（Thermofisher，CatalogNo。El0011）进行连接，并通过苯酚 - 氯仿提取清洁。根据制造商指南，总共使用了90 ng的ASD库质粒和30 ng的对照库质粒用于电穿孔的Megax DH10B T1R电磁细胞（Thermofisher，CatalogNo。C640003）。将细菌铺在含有氨苄青霉素的锂硼酸锂培养基上。进行稀释以计算复杂性。为ASD文库获得了2.6×107个菌落，并为对照库获得了0.5×107的菌落。使用HEK293T细胞包装慢病毒，并在12之前进行HES细胞的感染。感染率被控制为低于5％以预防多种感染18；通过流式细胞仪对GFP阳性的6.6×105 ASD库细胞和2.3×105对照库单元呈阳性。将细胞回收并在10厘米菜肴中传递两次，以保持最大的复杂性。将细胞与96：4（ASD：对照）的比率混合，然后用来制造胚胎体。对于单个基因验证，携带双重GRNA盒的慢病毒仅针对一个基因，并用于感染ECAS9诱导的细胞系。然后通过FACS收集细胞，并用于制造胚胎体。使用上述条件培养器官。 　　对于每个库，在4个月时进行了三到七个器官，在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPB）中洗涤两次 - / - - 并使用gentlemacs用胰蛋白酶 - 抗激酶（1×）溶液中的gentlemacs用涡轮dnase溶液（2μLML-ML-ML-1； catalofisher，catalogofish，catalog om）解离。解离后，逐渐添加了补充10％FBS（DPB – 10％FBS）的DPB - / - 以停止反应。然后将样品在400克4°C下以400克离心5分钟，并在不接触颗粒的情况下吸出上清液。然后将沉淀重悬于另外1-2 ml的DPB – 10％FBS中，然后通过70μm滤网和FACS管过滤。然后将细胞用生存力染料DRAQ7（Biostatus; DR70250，0.3 mm）染色。用低压（100μm喷嘴）上的Alexa 700滤波器上的BD Facsaria III对目标活细胞进行排序，并在4°C下收集在DPBS -10％FBS中。然后将细胞离心并重悬于DPB – 10％FBS中，以实现每微氧化器450-1,000个细胞的目标浓度。处理具有超过85％生存能力的样品。对于每个库，将16,000个细胞加载到10×铬控制器上，以靶向10,000个细胞的回收。遵循10倍用户指南，制备了使用铬单细胞3'试剂盒（v.3.1）的库。在Novaseq S2或S4流动池上测序库，每个单元格为25,000个配对末端读数。 　　每个细胞从基因组基因座（AAVS1）和聚腺苷酸化的双sgrna盒中表达ECAS9，该盒子由慢病毒传递并整合到基因组中。为了涵盖这些外部元素，我们通过修改GRCH38人类参考来构建一个自定义基因组参考，用于映射10×单细胞数据。随着单个GRNA序列的不同，我们用NS掩盖了它们，以免干扰映射（单独的计数管道中分开了单个GRNA信息）。这些序列涵盖了具有ECAS9-DTOMATO-WPRE-SV40的AAVS1基因组基因局基因局基因局基因局基因局和蒙面的慢病毒构建体。 　　乳液聚合酶链反应（PCR）用于从质粒库中恢复GRNA和UCB序列，从慢气病毒感染的HES细胞中提取的基因组DNA和从选择摩西类器官分类的细胞以及10倍单细胞互补的DNA库中的细胞，以减少PCR偏见，以减少CHIMER GETARES GERATION GERATION ODERADECSERAPTION 56,56,56,56,56,56,56,56,56,56.56,56,56,56,56,56。Amplitaq Gold 360 Master Mix（Thermofisher，目录编号4398876）用于所有PCR反应。根据制造商指南，使用胶束DNA乳液和纯化试剂胶束DNA乳液和纯化试剂盒（EURX，CATALOGNO。E3600）进行乳液PCR。对于来自10×单细胞库的靶标扩增，使用以下引物进行了半固定的乳液PCR： 　　第一个PCR：正向底漆（FW）：5'-GCAGACAAATGGCTGAACGCTGACG-3'，反向引物（RV）：5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCCGATCT-3';第二个PCR：FW：5'-GGAGTTCAGACGTGTGTGCTTCCGATCTTCTTGGAATCTTATATATCTTATCTTCTGTATGAGACCACTCTTTCCC-3'，RV：5'-CCCTACACGACGACGCTCTTTCCTTCCGATCT-3'。 　　然后将扩增子用独特的NEB双重索引引物进行索引，并在QPCR机中监测放大，并在达到对数相时停止。使用Illumina NextSeq2000或NovaseQ6000系统对扩增子进行了测序。所有使用的引物也可以在补充表1中找到。 　　通过用Cusadapt切割5'-和3'乘区域（10％的错误率，1-3个核苷酸（NT）重叠，无indels）58来提取GRNA序列58。将序列过滤为15至21 nt长。校正的细胞条形码（CBC）和每个读取的唯一分子标识符（UMI）是通过10×基因组细胞ranger 6.0.1 Alignment59得出的。仅接受具有相应基因表达（GEX）细胞的读数。通过允许部分重叠和两个两个距离的读数和目标序列连接。读数计入独特的CBC – UMI -GRNA组合。应用每个单元格的读数中位数读数的1％的读数截止数量最高。保留只有一个GRNA和一个以上读取的细胞。此外，在独特的CBC – UMI组合中，仅保留了该组最大读数的20％以上的GRNA。读取过滤后，对每个CBC – GRNA组合计数UMIS。如果在一个细胞中发现了多个GRNA，则仅保留了与最大UMI计数相比的GRNA相等的GRNA。仅考虑一对一的组合。类似于GRNA提取，将UCB与至少6 nt重叠提取到侧面。选择了12 nt长度的序列，必须遵循合成模式。进一步处理类似于GRNA。 　　我们首先使用前MRNA基因模型和默认参数与上述定义的自定义基因组参考与细胞Ranger 6.0（10x基因组学）进行对齐，以通过Gene Umi Count Count矩阵生成细胞。然后使用Seurat v.4（参考文献60）在R中分析UMI计数。我们首先过滤了至少三个单元格中检测到的特征。接下来，我们根据检测到的基因数量（最少1,000，最多8,000）过滤高质量的细胞，去除具有高线粒体（小于15％）或核糖体（小于20％）的信信体RNA含量的细胞。此后，将高质量细胞的表达矩阵标准化（对数正归化），并缩放为每个细胞的总表达10,000 UMIS。主成分分析（PCA）是根据2,000个最大特征的z量表表达（FindVariableFeatures（））进行的。 　　为了注释数据集，我们首先用对照GRNA提取细胞，并将它们与未诱导的类器官（35,203个细胞）的细胞合并。我们使用Harmony61与默认参数集成了这些不受干扰的单元格。使用集成空间，我们使用Louvain AlgorithM62以一个分辨率聚集了数据集，并根据标记基因表达将簇作为背和腹侧端脑的注释。然后，我们将两个轨迹分开，并以两个分辨率再次聚集，以更细细胞类型注释。这种不受干扰的细胞的注释用于使用seurat进行标记传递到完整的数据集中。使用Seurat锚定方法对整个库中检测并集成了GRNA的单元格进一步过滤。在计算PCA之前，集成计数矩阵已对数符合和缩放。为了可视化数据集，使用前20个主要组件来计算UMAP嵌入。 　　为了评估筛网中的靶基因如何在器官和原代组织中表达，我们从发育中的人脑32中从https://storage.googleapis.com/linnarsson-lab-human/humanfetalbrain.h5获得了基因表达数据。对于主要数据和我们的器官数据集，我们通过计算算术平均值来概括了每种单元格类型（主要数据集中的“细胞列”）的对数notalsatizan表达式。我们可以观察到选择目标基因的表达，并在扩展数据中显示的热图图6L，m。 　　为了获得剪接和未剪接的成绩单的计数矩阵，我们通过python package loompy（v.3.0.7; https：//linnarssonsonlab.orgg/loompy/）的命令行工具loompy使用了kallisto（v.0.46.2）63。使用SCVELO（v.0.2.4）31，根据前20个主要组件计算矩矩，使用scvelo.pp.moments（）n_neighbors = 30。随后使用函数scvelo.tl.tl.velocity（）（模式='stochastic’）和velocity scvely scell. scell.rna = 30。为了获得描述两个分化轨迹的伪阶顺序，我们首先从数据集中删除了以循环细胞（MKI67+）和星形胶质细胞（S100B+）为单位的簇。然后，我们使用函数SCV.TL.VELOCITY_PSEUDOTIME（）分别根据速度图计算了一个基于速​​度图的假频率。 　　为了测试扰动是否影响细胞的适应性或增殖能力，我们比较了ECAS9诱导的GRNA表示（n =三批批次的14个器官池）与未诱导的（n =来自两个批次的n = 8个类带的类杆）样品。对于每个类型器池，我们使用每个GRNA计算细胞的分数。然后，我们计算了诱导和未诱导的样品之间检测百分比的平均折叠变化，并进行了两侧t检验，以比较两个分布。使用Benjamini-Hochberg方法对所得的P值进行了多测试校正。 　　为了评估ASD风险基因的扰动如何改变不同的器官细胞群体的丰度，我们测试了每个带注释的细胞状态中每个GRNA的富集与对照。为了通过不同库中的差异GRNA采样来控制混淆效果，我们使用了通过库进行分层的CMH测试。使用Benjamini-Hochberg方法进行了多测试校正，并将其显着性阈值应用于所得的FDR。使用签名的-LOG10 FDR绘制富集效应：即对数比值比（效应大小）的符号乘以-LOG10 FDR FDR校正的P值。为了进一步评估独立器官池之间差异丰度效应的变异性，我们计算了每个器官池和GRNA的细胞型折叠富集。为此，我们使用了从独立器官池获得的14个SCRNA-SEQ库作为从三批批次的重复。两批（11个重复）将非靶向的GRNA用作对照，第三批（三个重复）使用了ECAS9无诱导的细胞作为替代对照。我们还计算了从随机排列的GRNA标签中计算出的富集作用的背景分布。然后，我们针对此背景分布执行了每种扰动和单元格类型的t检验。 　　为了可视化遗传扰动在更精细的分辨率下引起的组成变化，我们使用了Nikolova等人的64中概述的一种方法，简要介绍了细胞的K-Nearealt邻居（KNN）图（k = 200），根据PCA降低的CCA（CACA-CCA（CACA）（CANONICAL-CAONILICAL-CORTANICAL ENSICAL）的基础，构建了细胞的构建。接下来，在每个单元的附近进行了通过库进行分层的CMH测试，比较了GRNA或GRNA池的频率以及邻里内外的控制GRNA的频率。每个单元的最终邻域富集得分定义为签名的-LOG（P），其中符号由对数转换的优势比的符号确定。然后应用带有重新启动过程的随机步行，以平滑每个单元格的邻居富集评分。使用ggplot2（参考65）函数stat_summary_hex（）（bins = 50），在UMAP嵌入上可视化平滑的富集分数。 　　为了研究每种扰动引起的转录组变化，我们根据逻辑回归进行了差异表达分析。我们使用seurat函数findmarkers（）（test.use ='lr'）来找到每个GRNA标签与对照的DEG。在将库，cell_type和n_umi作为模型中的协变量时，对对数正态分立的转录本计数进行了测试： 　　通过省略Cell_Type协变量来进行每个发育轨迹内的测试。使用Benjamini – Hochberg方法进行了多测试校正，并将其显着性阈值应用于结果的FDR，以获得一组DEG（选择DEGS）。我们进一步选择了每个GRNA的绝对折叠变化（顶级）的最佳30度。 　　为了评估所涉及的DEG的生物学过程，我们在全球所有顶尖的所有顶级博士上都进行了基因本体学富集，并在兴奋性和抑制性神经元轨迹中为每个靶基因使用所有检测到的DEG。作为背景基因集，我们使用了在数据集中超过5％的细胞中表达的所有基因。为了执行基因本体分析，我们使用了从R包clusterProfiler66的函数“ renrichgo”和“ padjustmethod ='fdr'”。我们使用FDR的显着性阈值过滤了结果< 0.01. To test whether the set of TOP-DEGs was enriched for ASD-associated genes, we first obtained a list of risk genes from SFARI (https://gene.sfari.org/database/gene-scoring/, 11 April 2021). We then tested the enrichment using a Fisher exact test with all genes expressed in more than 5% of cells in our dataset as the background. To assess the specificity of this enrichment, we obtained a list of ID risk genes from sysID (936 primary ID genes, https://sysndd.dbmr.unibe.ch, 17 March 2022) and tested for enrichment among TOP-DEGs in the same way. 　　Initial transcript count and peak accessibility matrices for the multiome data were obtained from sequencing reads with Cell Ranger Arc and further processed using the Seurat (v.4.0.1) and Signac (v.1.4.0)67 R packages. Peaks were called from the fragment file using MACS2 (v.2.2.6)68 and combined in a common peak set before merging. Transcript counts were log-normalized, and peak counts were normalized using term frequency–inverse document frequency normalization. To assess the cell composition of the multiome data, integration with the CHOOSE scRNA-seq data was performed using Seurat (FindIntegrationAnchors() -> 具有默认参数的IntegratedAta（））。作为使用PANDO41进行GRN推断的预处理步骤，首先将染色质可及性数据粗粘贴到高分辨率群集水平。为此，将来自选择数据集中的控制单元与多组数据集结合在一起，并根据根据2,000个最大可变特征（RNA）计算出的前20个主组件以20分辨率进行露天聚类。对于每个群集，通过计算二进制峰值计数的算术平均值来总结峰值可及性，以使群集中的每个单元均由每个峰的检测概率向量表示。为了限制Pando考虑的一组峰，我们使用了30个哺乳动物的比对（从https://genome.ucsc.edu/）和候选cis-regunatoratival elements从Encode Project70（启动project70获得）（initiate_grn（））。在这些区域中，我们基于用pando运送的图案数据库扫描了TF图案（find_motifs（）），该图案是根据源自Jaspar和Cis-bp得出的图案编辑的。基于基匹配匹配，细胞级对数n量标准的成绩单计数和集群级峰值访问性，然后我们使用pando函数celes_grn（）推断GRN（pead_to_to_to_gene_method ='greet'，上游= 100,000，下游= 100,000），以5,000最多可变的功能。在这里，基因与Great71提出的方法在基因体周围100,000个半径中的候选调节区域相关。从潘多（Pando）返回的模型系数中，使用函数find_modules（）（p_thresh = 0.05，rsq_thresh = 0.1，nvar_thresh = 10，min_genes_per_module = 5）构建了TF模块。为了可视化以一个TF为中心的子网，我们计算了从TF到GRN图中每个基因的最短路径。如果有多个最短路径，我们保留了平均p值最低的路径。用R包Ggraph可视化所得图 （https://github.com/thomasp85/ggraph）使用圆形树布局。 　　为了找到与ASD相关基因积累的GRN的子网，我们首先从SFARI获得了ASD风险基因列表（https://gene.sfari.org/database/gene-scoring/）。对于SFARI（1,031个基​​因）中的所有基因，我们使用Fisher精确检验在TF模块中进行了富集。在我们数据集中超过5％的细胞中表达的所有基因（12,079个基因）都被视为背景。使用Benjamini -Hochberg方法校正了Fisher测试P值进行多次测试，并将大量富集定义为FDR <0.01，大于双重富集（优势比）。为了评估哪些TF模块受ASD相关基因的遗传扰动影响最大，我们类似地使用了Fisher精确检验。对于一组顶级，我们在任何推断的TF模块中测试了富集。在这里，GRN中包含的所有基因（5,000个可变特征）都被视为背景。 　　为了更好地了解导致抑制性神经元群体的分化轨迹，我们使用Cellrank43根据先前计算的速度假局段将过渡概率计算到每个终端命运中。首先，将每个末端细胞状态的伪次结构簇作为末端状态。然后，我们基于速度伪度构建了一个Palantir kernel72（palantirkernel（）），并使用了通用的Perron Perron群集群集分析73（gpcca（））来计算终端命运概率矩阵（Compute_abSorption_absorptign_prottive_probobilities（））。所有单元格函数均使用默认参数运行。使用圆形投影可视化每个细胞的命运概率74。简而言之，我们在一个圆周围均匀间隔端子状态，并为每个状态分配一个角度t。然后，我们从N细胞和末端状态的过渡概率矩阵中计算了二维坐标（，）作为 　　为了可视化在这个空间中扰动细胞的富集，我们使用了Nikolova等人64中概述的方法。在这里，使用命运概率空间中的欧几里得距离计算KNN图（k = 100），并在圆形投影上可视化富集得分。否则，如上所述进行该方法。 　　固定器官组织在4°C的多聚甲醛中固定过夜，然后在PBS中洗涤3次10分钟。然后将组织允许在30％的蔗糖中沉入30％的蔗糖中，然后嵌入O.C.T.化合物（樱花，目录编号4583）。将组织在干冰上冷冻，并以20μm的速度冷冻。对于染色，首先在PBS（0.1％PBTX）中以4％正常驴血清中的0.1％Triton X-100进行阻塞并在0.1％Triton X-100中透化。然后将切片用在0.1％PBTX中稀释的初级和继发抗体染色，并用4％的正常驴血清染色。每种抗体染色后，将切片在PBS中洗涤3次，持续10分钟，并安装在Dako荧光安装培养基中（Agilent Technologies，目录NO。S3023）。这项研究使用了以下抗体：DLX2（Santa Cruz，Catalog No。SC393879，1：100）;Olig2（ABCAM，目录号AB109186，1：100）;SOX2（R＆D，目录号Mab2018，1：500）;FOXG1（ABCAM，目录号AB18259，1：200）;EOMES（R＆D，目录号AF6166，1：200）;ARID1B（细胞信号传导，目录号92964，1：100）;ADNP（Thermofisher，目录编号702911，1：250）;Bcl11a（ABCAM，目录号191401，1：250）;PHF3（Sigma，目录号HPA024678，1：250）;Smarcc2（Thermofisher，目录号PA5-54351，1：250）;KMT2C（Sigma，目录号HPA074736，1：250）;Alexa 488、568和647共轭次级抗体（Thermofisher，1：250）;和Hoechst（Thermofisher，目录号H3569，1：10,000）。 　　使用配备双凸横川W1旋转盘的Olympus IX3系列倒置显微镜对组织切片进行成像。用10×0.75（空气）工作距离（WD）0.6 mm或40×0.75（空气）WD 0.5 mm目标获取图像，并由Cellsense软件产生。 　　对于图4中的DLX2和Olig2定量，使用斐济处理并定量图像。根据组织的大小，使用Hoechst通道选择了每个类型器的5-12个区域。总共n = 108个区域（来自四个批量的13个类带有13个类带有的类器官）（c.2201dupg维修），n = 104个区域（来自四个批次的15个器官）ARID1B +/-（c.2201dupg）组和n = 94个区域（来自ARID的15个诸如ARIDER -ariD -batches and Arid -1b +/-是6Q2）（6Q225）。使用斐济宏自动分割。DLX2和Olig2通道都用于定义细胞体面积，然后进行强度测量。区域平均强度用于设置阈值。对于扩展数据中的蛋白质表达定量图2，使用Fiji处理并对每个基因的单个基因扰动进行了摄影的类器官。每个基因分析了五到十四个皮层板区域。选择了包含未诱导的（DTOMATO-）和诱导（DTOMATO+）细胞的区域，并使用斐济宏对自动分割进行自动分割。HOECHST通道用于定义细胞体区域，然后进行强度测量。通过在Dtomato通道中设置平均强度阈值，将检测到的细胞分离为野生型和扰动细胞。此外，比较了野生型（Dtomato-）和突变体（Dtomato+）VZ区域之间的KMT2C蛋白表达。单独概述了VZ，并测量了平均DTOMATO以及KMT2C强度。对于IPC丰度分析，EOMES具有单个基因扰动的类器官。表达DTOMATO的突变柱分别进行了分割， 通过设置EOMES强度的阈值来鉴定Eomes+细胞。将EOMES+细胞的数量标准化为细胞总数。在单个基因扰动和非靶向GRNA对照组之间比较了EOMES+细胞的百分比。对于INP的丰度分析，用DLX2进行了类器官。使用用于自动分割的斐济宏来鉴定整个组织中的DLX2+细胞。收集了来自每个器官的多个玫瑰花结的区域进行定量。将DLX2+细胞的数量标准化为组织区域，并在单个基因扰动和非靶向GRNA对照组之间进行比较。 　　该研究得到了维也纳医科大学地方伦理委员会的批准。研究纳入标准如下：（1）通过全异位测序证明的ARID1b基因突变，（2）0至18岁之间的年龄，（3）维也纳综合医院的连续随访和（4）（4）胎儿脑MRI数据的可用性。知情同意后，从两名选定患者的IPS细胞重编程中收集10 mL血液。 　　如前所述75，由从患者血液样本中分离的外周血单核细胞（PBMC）产生IPS细胞。简而言之，在柠檬酸钠收集管中收集了10毫升血液。通过Ficoll -Paque密度梯度分离PBMC，将红细胞扩展9天。富含红细胞的人群被表达人oct3/4，sox2，klf4和cmyc的仙台向量感染（细胞点；生命技术，A1377801）。感染三天后，将细胞切换为小鼠胚胎成纤维细胞喂食器层。感染五天后，将培养基更改为IPS细胞培养基（KOSR+FGF2）。感染十到21天，转导的细胞开始形成表现IPS细胞形态的菌落。转移到MTESR培养系统（Stemcell Technologies）后每5-7天采摘IPS细胞菌落。 　　使用CRISPR – CAS9生成患者1的等源性控制细胞系。如先前所述，纯化了具有两个核定位置信号的链球菌CAS9蛋白具有两个核定位信号。根据制造商的方案，使用Hiscribe T7高产量RNA合成试剂盒（NEB）进行GRNA转录，并通过苯酚：氯仿：氯仿（25：24：1; Applichem）提取，然后进行乙醇沉淀纯化GRNA。同源指导的修复（HDR）模板（自定义的单链寡脱氧核苷酸；集成的DNA技术）设计为突变位点的向上和下游跨越100个碱基对。在手术前，IPS细胞在MTESR中生长了14个段落。为了生成同基因对照细胞系，将细胞用DPB-/ - 洗涤，并在37°C下与1 mL的Accutase溶液（Sigma-Aldrich，A6964-500ML）一起孵育5分钟。将板轻轻轻按到分离细胞中，然后轻轻移动细胞以产生单细胞悬浮液，该悬浮液通过在200g下旋转3分钟，并使用锥虫蓝色溶液（Thermofisher Scientific）计数。为了进行核能，以每毫升2×107个细胞的浓度为2×107个细胞，将1.0×106个细胞旋转并重悬于霓虹灯转染系统的缓冲液中。将SGRNA和5 ng的Cas9蛋白的十二纳米图合并为重悬式缓冲液，形成Cas9 – Sgrna核糖核蛋白复合物。将反应混合并在37°C下孵育5分钟。将HDR模板的五个微量液（100μM）添加到Cas9 – Sgrna核糖核蛋白复合物中，并与细胞悬浮液结合。使用霓虹灯转染系统（Thermofisher Scientific）使用胚胎干细胞电穿孔方案（1,400 V，10 ms，三个脉冲）进行电穿孔。将细胞在MTESR中的六孔板中播种在一个纤维胶涂层的孔中。恢复期3天后，产生了单细胞悬架， 细胞被分成一个六孔板的另一孔，用于储存，并稀疏成两个10厘米的菜肴，以形成单细胞的菌落。菌落生长1周后，将单个菌落捡起并播种成96孔板的一个孔。菌落扩张后，使用DNA Quickextract溶液（Lucigen）提取GDNA，然后进行PCR和Sanger测序，以确定突变的有效修复。 　　回顾性地审查了2016年1月至2021年12月，在三级护理中心接受胎儿MRI的妇女进行了胎儿MRI。这项研究得到了机构伦理委员会的批准，并在临床上指示所有检查。对患者记录进行了回顾性综述，并选择了阳性基因测试报告的ARID1B突变。参与者被包括在进一步的分析中，妊娠年龄（在月经后几天给出）由第一孕期超声确定。获得了高质量的超分辨率重建13。确定了年龄匹配的对照受试者，如果他们缺乏混杂的合并症，包括结构性大脑或心脏异常或胎儿生长限制。 　　使用1.5-T（Philips Ingenia/Intera）和3-T磁铁（Philips Achieva）进行胎儿MRI扫描。在仰卧姿势或必要时检查母亲，剩下的卧式以达到足够的成像质量。检查在45分钟内进行，既没有应用镇静和MRI对比培养基，胎头和身体均成像。胎儿脑成像包括三个正交平面的T2加权序列（切片厚度= 3–4 mm，回声时间= 140 ms，视场= 230 mm）。如前所述进行后处理77。使用体积超分辨率算法77生成了分辨率成像。所得的超分辨率数据进行了质量评估，并且仅包括符合高质量标准的情况（得分小于或等于五个中的两个）。对胎儿皮层进行了基于ATLA的分割，并通过对每个研究的病例77,78的公开时空，解剖胎儿脑图的非辅助映射进行了总脑体积。使用开源应用程序ITK-SNAP79手动执行GE的分割。为了描述T2加权的高压素质GE，将拜耳和Altman80,81的组织学胎儿图谱用作参考指南。生成了体积数据，并根据研究的妊娠年龄进行了GE的计算。 　　在每个方法部分中描述了有关所使用统计分析的信息。除非指定，否则没有使用统计方法来确定样本量。除非指定，否则不使用盲和随机分组。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。